Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

Résumé

Nous présentons une méthode pour un modèle de pathogenèse fongique qui préserve le positionnement naturel des spores fongiques dans les voies respiratoires pulmonaires pour une analyse par microscopie fluorescente.

Résumé

Les champignons infectent les humains lorsque des spores environnementales sont inhalées dans les poumons. Le poumon est un organe hétérogène. Les voies respiratoires conductrices, y compris les bronches et les bronchioles, se ramifient jusqu’à se terminer dans l’espace aérien alvéolaire où se produisent les échanges gazeux. Les infections provenant des bronchioles ou des alvéoles provoquent des réponses distinctes de l’hôte et des manifestations de la maladie. Par conséquent, comprendre précisément où les spores se localisent naturellement dans les poumons, en particulier peu de temps après l’infection, élargit les possibilités d’étude des interactions hôte-pathogène. Nous détaillons ici une analyse in situ de poumons de souris infectées par Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Les méthodes conventionnelles de conservation histologique impliquent le gonflage liquide des voies respiratoires avec une solution fixatrice, qui déplace l’emplacement naturel des particules fongiques aspirées, poussant les spores des bronchioles proximales vers les espaces aériens terminaux.

À l’inverse, cette méthode de gonflage de l’air avec fixation par perfusion vasculaire sanguine préserve la position physiologique des spores fongiques au sein des bronchioles. De plus, nous décrivons une approche simple de la cryoconservation, de l’intégration et de l’imagerie des échantillons pulmonaires. Nous partageons également des techniques de calcul à haut débit via le programme open source QuPath pour analyser la distribution spatiale des spores fongiques dans les poumons. La méthode présentée ici est simple et rapide, nécessite un équipement minimal et peut être facilement adaptée pour être utilisée avec de nombreux modèles d’infections fongiques respiratoires.

Introduction

Les humains peuvent inhaler jusqu’à des milliards de spores par jour à partir d’une variété de champignons environnementaux¹. Pour comprendre nos défenses barrières contre ces spores inhalées, nous devons apprécier les environnements microanatomiques précis où ces spores atterrissent dans les voies respiratoires et le parenchyme pulmonaire. La composition cellulaire des voies respiratoires (c’est-à-dire les cellules épithéliales) se transforme considérablement le long de la trachée, des bronches, des bronchioles et des alvéoles. Chacune de ces régions distinctes est composée de différents types de cellules avec des fonctions discrètes qui disposent d’un arsenal de défenses pour prévenir l’infection pathologique.

L’emplacement précis du dépôt de spores fongiques pulmonaires peut varier entre les lumières des voies respiratoires des bronchioles colonnaires tapissées d’épithéliales, des canaux alvéolaires ou des alvéoles². La plupart des espèces fongiques cliniquement pertinentes produisent des spores d’un diamètre³ compris entre 1 m et 10 m. Le dépôt de ces particules de spores dans les poumons dépend de plusieurs facteurs, tels que l’aérodynamique, la densité, la charge électrique et les forces phorétiques, qui peuvent influencer le mécanisme de sédimentation après l’inhalation⁴. Généralement, les grosses particules (> 6 μm) se déposent dans les voies respiratoires supérieures, les particules de taille moyenne (2-6 μm) peuvent se déposer dans les voies respiratoires plus petites et les petites particules (<2 μm) atteignent la région alvéolaire⁵. Des spores d’Aspergillus (2-3 μm) ont été signalées pour atteindre les espaces alvéolaires, mais les rapports de pathologie clinique indiquent également un fardeau important de maladies bronchiques et bronchiolaires⁶. En raison de la popularité croissante de la bronchoscopie^flexible 7, on reconnaît également de plus en plus les infections fongiques endobronchiques d’Aspergillus fumigatus, de Coccidioides immitis, d’espèces Candida, de Cryptococcus neoformans, d’Histoplasma capsulatum et de Zygomycètes. Les progrès récents de l’imagerie microscopique des infections à Aspergillus chez la souris ont également révélé que les espaces aériens plus proximaux, tels que les bronches et les bronchioles, peuvent porter le fardeau le plus élevé de la prolifération fongique pathologique⁸. La recherche sur la réponse de l’hôte aux infections fongiques pulmonaires a montré que les cellules épithéliales bronchiolaires et les cellules épithéliales alvéolaires jouent un rôle important en tant que sentinelles immunitaires, de sorte qu’il sera essentiel d’élucider les sites exacts de dépôt de spores et d’interaction épithéliale pour les travaux futurs ^2,9,10.

L’étude de la dynamique de la pathogenèse de ces voies respiratoires proximales est difficile car les techniques standard de fixation pulmonaire et de préparation de la section peuvent déplacer les spores de ces positions proximales dans les voies respiratoires tapissées d’épithélium et les pousser vers les régions alvéolaires terminales distales. Généralement, 10 % de formol ou 4 % de paraformaldéhyde sont utilisés pour gonfler les poumons et exposer rapidement l’ensemble des poumons au fixateur. Lors de la préparation des poumons pour la cryosection, certains groupes administrent un composé à température de coupe optimale (OCT) dans les poumons pour améliorer les performances de cryosection¹¹. Ces pratiques sont utiles dans le bon contexte, mais notre laboratoire et d’autres groupes ont constaté qu’elles déplacent les spores et les particules des emplacements proximaux, interférant ainsi avec les interprétations concernant les types de cellules exposées aux spores et la réponse ultérieure de l’hôte¹².

Pour établir avec précision la localisation microanatomique des spores fongiques inhalées, nous avons mis au point une méthode rapide et nécessitant peu de ressources pour la préservation de l’emplacement des spores fongiques dans les voies respiratoires des souris. Nous avons adapté une méthode de perfusion vasculaire par gonflage d’air murin de Thomas et al. (2021), où nous avons réduit la quantité d’équipement, de temps et de compétences techniques nécessaires pour obtenir un résultat satisfaisant¹³. D’après la méthode décrite ici, nous avons observé que les arthroconidies de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (d’une taille de 3 à 5 μm) s’accumulent plus proximal que ce qui a été montré précédemment, à savoir dans les bronchioles distales et les jonctions broncho-alvéolaires plutôt que dans les alvéoles terminales. Cette information peut orienter des questions biologiques concernant les types de cellules critiques associés à ces régions du poumon et leur influence sur les réponses précoces aux spores fongiques inhalées.

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Marquez les spores avec une fluorescence intracellulaire

1. Colorez 1 x 10⁶ spores dans de l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE), du Cell Tracker Orange ou du Cell Tracker Red (ou du colorant intracellulaire de votre choix) à 5 μM pendant 30 min à 30 °C, puis lavez avec du PBS et essorez les spores à 12 000 x g. Répétez ce lavage une fois.
2. Préparez l’inoculum de spores à la concentration appropriée de sorte que 25 μL contiennent la dose de spores appropriée pour une souris.

2. Inoculation de spores à la souris par inhalation par aspiration à l’aide d’une anesthésie à l’isoflurane

ATTENTION : L’isoflurane est un agent anesthésique volatil et doit être utilisé dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.

1. Pour préparer le pot d’exposition à l’isoflurane, placez une serviette pliée dans un pot Nalgene à vis de 1 L et placez un cercle en plastique sur la serviette comme plate-forme pour les souris. Ajoutez 2 ml d’isoflurane dans la serviette, fermez le pot et attendez 1 à 2 minutes que le gaz s’équilibre dans le récipient.

Figure 1 : Appareil pour la méthode d’inoculation des spores à l’aide d’isoflurane à goutte ouverte. Une serviette pliée est placée au fond d’un bocal à vis de 1 L, puis un treillis circulaire en plastique est inséré pour servir de plate-forme aux souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Avant d’exposer la souris à l’anesthésie, préparez une pipette avec 25 μL d’inoculum. Placez la souris dans le récipient d’isoflurane et inclinez le récipient pour surveiller la perte du réflexe de redressement, c’est-à-dire que la souris a perdu conscience et est à l’envers. Cela prend généralement environ 10 s.
3. Surveillez la fréquence respiratoire (RR) jusqu’à ce qu’elle ralentisse à un niveau constant de 50 à 80 respirations par minute (bpm), soit environ 50 % de la RR au repos. Cela prend généralement 10 secondes supplémentaires. À ce moment, retirez la souris du bocal d’isoflurane.
   REMARQUE : Il s’agit d’une forte concentration d’isoflurane, qui produira une induction rapide de l’anesthésie, et la souris doit être surveillée de très près. Un surdosage mortel d’isoflurane présente un risque, car la concentration d’isoflurane peut être variable et la courbe dose-réponse à l’isoflurane est très abrupte. Si la fréquence respiratoire descend en dessous de 50 bpm et/ou est irrégulière, retirez la souris de l’isoflurane, laissez-la récupérer pendant 3 à 5 minutes et réessayez (un maximum de deux tentatives répétées).
4. Confirmez la profondeur de l’anesthésique par l’absence de réponse au pincement de l’orteil. Ensuite, positionnez la souris en position couchée d’une main et permettez-lui de prendre 3 à 5 respirations haletantes régulières avec un rythme croissant (à partir de 50-60 bpm) et une vigueur. Lorsque cela commence, placez l’extrémité de la pipette à l’arrière de l’oropharynx de la souris et libérez l’inoculum lors d’une inspiration.
   REMARQUE : Ces halètements par la bouche secouent la tête vers le bas en raison du recrutement de muscles accessoires pour la respiration. Lorsque la pipette est insérée pendant ces halètements, la bouche doit s’ouvrir à chaque halètement. Si la bouche ne s’ouvre pas, la souris n’est pas suffisamment anesthésiée et n’inhalera probablement pas le contenu de l’oropharynx. La pipette doit enfoncer la langue, la pousser vers le bas et l’avant de la bouche pour éviter l’infusion de l’inoculum. Lorsque la pipette est dans la bouche et que la souris est correctement anesthésiée, la souris ouvre la bouche à chaque halètement.
5. Avec la main et le pouce tenant la souris, palpez les crépitements sur les faces postérieure et antérieure du thorax de la souris pour confirmer l’inhalation de l’inoculum.

3. Euthanasie des souris

1. Injectez à la souris par voie intrapéritonéale un cocktail de 200 mg/kg de kétamine et de 24 mg/kg de xylazine 10 minutes avant le moment du sacrifice.
2. Attendre 10 minutes après l’injection jusqu’à ce que la souris entre dans un plan chirurgical d’anesthésie, confirmé par l’absence de réponse au pincement de l’orteil.

4. Perfusion des poumons avec PBS et formol

1. Vaporisez la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour couper la peau de la souris et séparez la peau pour exposer le péritoine de tous les côtés. Tirez la peau de la moitié supérieure de la souris sur sa tête, en retirant les bras de la peau.
2. Coupez la membrane péritonéale au niveau du sternum et le long de la face inférieure de la cage thoracique, exposant le péritoine. Déplacer le foie vers le bas, révélant le diaphragme. Utilisez des ciseaux pour percer soigneusement le diaphragme loin du parenchyme pulmonaire afin d’éviter de percer un trou dans les poumons eux-mêmes.
   REMARQUE : Perforer par inadvertance les poumons rendra impossible le gonflage ultérieur de l’air.
3. Après la perforation du diaphragme, l’air pénètre dans le thorax, ce qui fait s’effondrer les poumons. Coupez la cage thoracique sur le côté gauche pour révéler le cœur. Injecter 5 à 10 ml de PBS dans le ventricule droit avec une aiguille de 30 G à raison de 1 ml toutes les 5 s (pour éviter d’endommager les vaisseaux), en blanchissant rapidement les poumons.
   ATTENTION : Le formol est une substance volatile dangereuse qui doit être manipulée dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.
4. Lorsque vous avez terminé, retirez l’aiguille et utilisez une nouvelle aiguille pour injecter 5 ml de formol à tampon neutre (FBN) à 10 % dans le ventricule droit au même rythme.

5. Gonflement à l’air du poumon perfusé

1. Retirez la moitié antérieure de la cage thoracique. Pour exposer la trachée, coupez les côtes supérieures et les clavicules à droite et à gauche du cou. Prenez soin d’éviter de couper près de la ligne médiane où se trouvera la trachée. À l’aide d’une pince, agrippez les côtes supérieures et les clavicules restantes sur la ligne médiane du cou et tirez vers le haut jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
2. Préparez un fil de suture de 10 cm de long, passez-le sous la trachée et faites un nœud lâche à l’extrémité inférieure de la trachée exposée. Préparez une seringue d’air de 1 mL avec un cathéter de 18 G. À l’aide d’une aiguille de 18 G, faites un trou dans la trachée à l’extrémité supérieure de la région exposée.
3. Placez le cathéter dans ce trou, en veillant à ce qu’il soit relativement serré pour empêcher l’air de s’échapper. Injectez lentement 1 ml d’air dans les poumons pendant 10 s, en surveillant le gonflement pulmonaire de tous les lobes. Le gonflage complet fait que les poumons s’enroulent légèrement autour du cœur et remplissent le volume qu’ils occupent dans le diaphragme non perforé.
4. Tirez le nœud autour de la trachée et retirez le cathéter. Tenez la trachée et utilisez des ciseaux émoussés pour retirer les poumons de la souris, en faisant attention de ne pas percer le poumon.

6. Fixation par immersion et déshydratation

1. Placez les poumons sur le bord supérieur d’un tube conique de 50 ml rempli de 20 ml de FBN à 10 %. Gardez les fils de suture à l’extérieur de la conique, vissez le capuchon et inversez la conique de sorte que les poumons soient suspendus à l’envers dans 20 ml de FBN. Placez-le à 4 °C pendant 24-48 h.
2. Rincer les poumons au PBS, puis les placer dans une solution à 30 % de saccharose-PBS (p/v) pendant 72 à 96 h à 4 °C pour déshydrater les poumons en vue de la cryoconservation. Retirez les poumons du saccharose, placez-les dans un cryomoule avec un milieu à température de coupe optimale (OCT) et congelez l’échantillon à -80 °C.

7. Cryosectionnement

1. Équilibrez les échantillons dans les cryoblocs OCT à la température de -20 °C du cryostat pendant 1 h avant la section. Sectionnez les blocs à des épaisseurs de 20 à 100 μm.
   REMARQUE : Le gonflage à l’air peut entraîner une fragilité accrue de l’échantillon, et une coupe à une épaisseur accrue peut prévenir la rupture des tissus pendant la section.
2. Prélever des sections sur des lames de verre et laisser sécher pendant 30 min à 1 h pour assurer l’adhérence du tissu à la lame.
   REMARQUE : Les diapositives peuvent être maintenues à -80 °C à ce stade.

8. Préparation et blocage des lames

1. Placez les lames dans un bain PBS (dans un plat ou un bocal Coplin) pendant 30 min à température ambiante (RT) pour éliminer l’OCT des lames.
   REMARQUE : Les sections plus épaisses (40-100 μm) peuvent ne pas adhérer aux lames de verre ainsi qu’aux sections plus minces, il est donc préférable de les garder plates et verticales dans un plat plutôt que de les placer sur le côté dans un bocal Coplin.
2. Séchez les lames une fois que l’OCT s’est dissous loin du tissu. Utilisez une lingette pour sécher les gouttelettes en excès du périmètre de la lame autour de l’échantillon de tissu.
3. À l’aide d’un stylo Pap hydrophobe, tracez un périmètre autour de l’échantillon et laissez-le sécher pendant 5 minutes.
4. Préparez un tampon de blocage de solution de blocage sans animaux avec 0,3 % de Tween-20 et un bloc de 1:100 Fc dans 300 mL par lame.
   REMARQUE : Pour les cibles intracellulaires, 1 % de Tween-20 peut être utilisé. Un volume de 300 μL est généralement suffisant, mais le volume nécessaire pour couvrir entièrement le tissu dépend de la taille du périmètre du marqueur hydrophobe. Le tissu ne doit pas sécher à partir de ce moment.
5. Laissez la solution de blocage sur les lames pendant 1 h à RT.

9. Immunomarquage

1. Lavez la lame en pipetant le liquide et en ajoutant 300 à 500 μL de PBS. Répétez le lavage une fois.
2. Préparez l’anticorps primaire conjugué AlexaFluor-647 anti-souris EpCAM (clone G8.8) (marqueur épithélial des voies respiratoires) dans une solution bloquante exempte d’animaux avec 0,33 % de Tween-20 (ou 1 % pour les cibles intracellulaires). Ajouter 300 μL par lame de cette solution et colorer toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Les anticorps doivent être testés empiriquement pour la concentration, le temps et la température de la coloration. Les lames minces (8-20 μm) sont colorées pendant 30 min à 37 °C et les sections plus épaisses (20-100 μm) à 4 °C pendant la nuit en utilisant des dilutions 1:100 pour la plupart des anticorps. Si vous utilisez des anticorps non conjugués, laver 2 fois (comme ci-dessus) et appliquer un anticorps fluorescent secondaire pendant une durée et une température déterminées empiriquement. Généralement, la coloration secondaire des anticorps est effectuée à RT pendant 1 h à une dilution de 1:1000.
3. Retirer la solution d’anticorps de l’échantillon et laver la lame avec 300 mL de PBS pendant 5 min. Répétez ce lavage une fois. Séchez les lames en enlevant tout excès de liquide de l’échantillon et du verre environnant.
4. Ajoutez une goutte de support de montage RT soft set (par exemple, SlowFade Glass) sur chaque morceau de tissu. Prenez soin d’éviter les bulles en laissant le flacon se déposer à l’envers et en déposant lentement chaque goutte sur les mouchoirs. Placez une lamelle de taille appropriée pour s’étendre au-delà du périmètre de l’échantillon et du marqueur hydrophobe.

10. Imagerie par microscopie fluorescente

1. Utilisez un microscope fluorescent multicanaux pour balayer des coupes pulmonaires entières de manière impartiale à l’aide d’un objectif ayant une résolution suffisante pour résoudre les spores individuelles et les cellules hôtes (par exemple, Zeiss Axioscan 7 avec un objectif d’huile 20x avec NA = 0,8 ou similaire).
   REMARQUE : Assurez-vous que la puissance laser et le gain de tension PMT sont réglés pour maximiser les rapports signal/bruit de la cible sur l’arrière-plan déterminés avec une commande de fluorescence moins un (FMO).
2. Recueillir suffisamment de tuiles d’image pour capturer l’ensemble du lobe pulmonaire (p. ex., ~200 tuiles de 400 μm x 400 μm). Utilisez le logiciel de microscope (par exemple, Zeiss ZEN 3.7 ou similaire) pour exporter l’image des carreaux fusionnés pour le traitement en aval.

11. Analyse spatiale via QuPath

1. Dans QuPath, un logiciel open source gratuit¹⁴, créez un fichier de projet et ajoutez-y les images fluorescentes.
2. Classez les pixels EpCAM+ en tant qu’épithélium en cliquant sur l’option de menu supérieure Classifier, puis sur Classification des pixels > Créer un seuil. Sélectionnez la résolution, le canal, le sigma de lissage et la valeur de seuil qui identifient le mieux la région cible. Enregistrez le classifieur sous un nom unique, puis sélectionnez Créer des objets.
3. Dans la nouvelle fenêtre Créer des objets , sélectionnez Nouveau type d’objet en tant qu’annotation. Pour l’épithélium pulmonaire, réglez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou à 100 mm². Il n’est pas nécessaire de sélectionner Diviser les objets ici. Après avoir sélectionné OK, les annotations seront créées et elles peuvent être modifiées à l’œil nu à l’aide de l’outil Pinceau dans la zone supérieure gauche.
4. Pour classer les spores, répétez les étapes de 11.3 à 11.4 en utilisant le canal dans lequel les spores ont été capturées et faites en sorte que le nouveau type d’objet soit Détection plutôt qu’Annotation. Définissez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou sur 0 mm², puis sélectionnez Diviser les objets.
5. Pour effectuer une analyse spatiale des spores, sélectionnez l’option de menu supérieure Analyser > Analyse spatiale > Calculer la distance signée aux annotations 2D. Les distances jusqu’à l’épithélium EpCAM+ seront calculées pour chaque spore détectée. Exportez-les via l’option de menu supérieure Mesure > Exporter les mesures.

Résultats

Cette méthode produit finalement des images immunofluorescentes des poumons de souris en utilisant le gonflage physiologique de l’air pour laisser les voies respiratoires intactes. Il est important de noter que plusieurs points de contrôle en cours de route confirmeront que les composants du protocole ont été exécutés avec succès. Lors de l’inoculation, il est important de confirmer que l’inoculum a été aspiré en palpant des « crépitements » sur la paroi thoracique postérieure de la souris qui indiquent que le liquide a pénétré dans les voies respiratoires. S’il n’y a pas de sensation de crépitements, il est possible que la souris ait avalé l’inoculum. La perfusion des poumons de souris avec le PBS devrait entraîner des marbrures blanches des poumons suivies d’un blanchiment complet de l’ensemble du poumon (figure 2A). S’il y a un blanchiment incomplet, la perfusion de formol qui s’ensuit n’atteindra pas toutes les zones du parenchyme pulmonaire (Figure 2B). Lors du gonflage du poumon avec de l’air, les poumons doivent se distendre lentement jusqu’à ce qu’ils atteignent une taille physiologique. Après avoir attaché la suture trachéale pour sécuriser l’air à l’intérieur des poumons, les poumons ne doivent pas se contracter en taille. Si c’est le cas, le poumon a probablement été perforé pendant la procédure.

Ici, nous montrons des images représentatives de coupes avec des spores de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ marquées (vert) et un épithélium bronchiolaire cylindrique EpCAM+ (magenta) dans des poumons gonflés à l’air et des poumons gonflés au formol (figures 3A, B respectivement). Ces spores s’accumulent principalement dans les bronchioles distales et dans les espaces alvéolaires immédiatement adjacents à ces bronchioles distales, probablement dans les canaux alvéolaires. Les poumons gonflés par un fixateur contiennent des spores qui apparaissent plus fréquemment dans les bronchioles et se regroupent plus près des bronchioles (figure 3A), plutôt que le fixateur liquide où les spores semblent légèrement plus dispersées à partir de l’épithélium bronchiolaire (figure 3B). Grâce à l’analyse spatiale QuPath, nous mesurons la distance des spores individuelles par rapport à l’épithélium bronchiolaire EpCAM+ le plus proche afin d’indiquer le niveau de dispersion des spores loin de la bronchiole et dans des espaces alvéolaires plus distaux. Nous montrons que l’inflation liquide disperse les spores plus loin des bronchioles par rapport à l’inflation physiologique de l’air (Figure 4A,B). La perfusion vasculaire par gonflage aérien préserve le positionnement naturel de ces spores dans les bronchioles distales et empêche la dispersion artificielle de ces spores dans des espaces alvéolaires plus distaux par instillation fixatrice intratrachéale.

Figure 2 : Indication de succès de la perfusion pulmonaire. (A) Les poumons perfusés avec succès seront complètement blancs. (B) Les poumons incomplètement perfusés apparaîtront roses ou tachetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives de la distribution des spores dans les poumons gonflés au formol gonflés à l’air par rapport aux poumons gonflés au formol. Les spores fluorescentes intracellulaires (en vert) sont distribuées plus près de l’épithélium bronchiolaire EpCAM+ (magenta) dans les poumons gonflés à l’air (A) que dans les poumons gonflés au formol (B). Des images ont été obtenues à partir de coupes d’une profondeur de 1,2 mm à partir de la surface postérieure des lobes gauches de souris de chaque groupe de traitement sur un microscope fluorescent multicanaux à un grossissement de 20x, et les carreaux ont été assemblés à l’aide d’un logiciel de microscopie. Barre d’échelle = 800 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison de la distance entre les spores (mm) et l’épithélium bronchiolaire entre les poumons gonflés à l’air et les poumons traités par des spores gonflées au formol. Les poumons de 3 souris par groupe de traitement ont été prélevés, traités et imagés pendant 1,5 h après l’inoculation avec 1 x 10⁶Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidies. Quatre sections par souris ont été échantillonnées à 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm et 2,0 mm de la surface postérieure du lobe gauche, colorées et imagées au microscope fluorescent multicanaux. Toutes les spores de chaque groupe ont été détectées et analysées spatialement dans QuPath pour déterminer la distance (A) jusqu’à l’épithélium bronchiolaire cylindrique EpCAM+ le plus proche, et (B) la médiane et les intervalles de confiance à 95 % sont affichés en micromètres. Spores de gonflage dans l’air, n = 11 673. Spores d’inflation liquide, n = 9 837. Le test t de Mann-Whitney a été réalisé en raison d’un manque de normalité, et p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Discussion

Nous avons établi un pipeline pour l’inhalation de spores et l’analyse du dépôt spatial des spores inhalées. Ce pipeline fournit des informations précieuses pour déterminer les régions stromales pertinentes du poumon affectées par l’inhalation d’arthroconidies de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Nous avons observé que les spores de Coccidioides et les particules inertes de taille similaire (données non présentées) s’accumulent dans les régions bronchiolaires distales et les jonctions broncho-alvéolaires plutôt que d’être entièrement dispersées dans les lumières alvéolaires des voies respiratoires. Ce modèle nécessite un niveau relativement faible d’équipement et de compétences techniques pour produire des cryosections pour l’immunofluorescence (ou d’autres pipelines en aval tels que l’immunohistochimie [IHC]) qui maintiennent l’intégrité physiologique du contenu des voies respiratoires tout en maintenant la morphologie naturelle des poumons. Sans gonflage de l’air, l’affaissement des alvéoles déforme l’architecture naturelle du parenchyme pulmonaire entourant les bronchioles^13,15. La perte du volume d’air du poumon pendant le traitement histologique a été indiquée comme un « problème grave » par une déclaration officielle conjointe de la politique de recherche de l’American Thoracic Society et de l’European Respiratory Society dans la définition de normes pour l’évaluation quantitative de la structure pulmonaire¹⁶. De plus, l’instillation intratrachéale de fixateur peut perturber la nature et l’emplacement des composants moléculaires et cellulaires proximaux des voies respiratoires tels que les mucines, le tensioactif et les cils des voies respiratoires 17,18,19. La méthode décrite ici préserve suffisamment à la fois le volume d’air du poumon ainsi que les composants moléculaires et cellulaires le long des voies respiratoires qui interagissent avec les spores fongiques inhalées.

La microscopie à immunofluorescence fournit un outil puissant pour interroger la dynamique spatiale des composants pulmonaires, et elle est bien évaluée^20,21. Il n’y a pas de limites aux cibles qui peuvent être colorées par immunofluorescence de ces sections, sauf que les anticorps avec des épitopes sensibles à la fixation au formol peuvent ne pas lier leurs cibles de manière satisfaisante. Lors de l’utilisation d’un nouvel anticorps, il est préférable de préparer un contrôle de fluorescence moins un (FMO) pour déterminer si l’anticorps génère un signal au-dessus du bruit de fond. Si vous utilisez un anticorps secondaire, utilisez un groupe de traitement sans l’anticorps primaire pour contrôler la liaison hors cible de l’anticorps secondaire. Les anticorps monoclonaux primaires conjugués sont très spécifiques, de sorte que la coloration à des températures plus élevées (37 °C) pendant moins de temps (30 min) est courante et se lie généralement spécifiquement à leur cible. D’autre part, les anticorps polyclonaux non conjugués sont plus sensibles à la détection des antigènes mais moins spécifiques, de sorte que des incubations plus longues (~16 h) à des températures plus froides (4 °C) optimisent le rapport signal/bruit. Tous les anticorps nécessiteront une optimisation empirique.

Le modèle d’analyse spatiale utilisé dans cette étude pour la localisation des spores mesure la distance entre les spores individuelles et l’épithélium bronchiolaire le plus proche. Cela nécessite une identification appropriée de l’épithélium bronchiolaire à l’aide de son signal EpCAM élevé et de son apparence morphologiquement distincte en tant qu’épithélium cylindrique tapissant des structures tubulaires. EpCAM peut également être exprimé à des niveaux inférieurs par l’épithélium alvéolaire, il est donc important de seuilr le signal EpCAM dans QuPath pour limiter les annotations définies aux régions bronchiolaires morphologiquement confirmées. Comme les bronchioles ont une taille anatomique minimale, nous pouvons limiter la définition QuPath de ces régions à la zone minimale de 100 mm², comme indiqué à l’étape 11.3. Cela exclura des annotations QuPath les cellules isolées exprimant à EpCAM élevé ou les artefacts dans les espaces alvéolaires, tels que les cellules épithéliales alvéolaires de type II. Ces étapes nous permettent de définir exclusivement l’épithélium bronchiolaire en tant qu’annotations QuPath et de déterminer la proximité des spores avec cet épithélium bronchiolaire défini.

Le modèle d’infection décrit ici utilise l’anesthésie à l’isoflurane pour induire une réponse haletante orale chez la souris pour l’aspiration des spores fongiques. La méthode de goutte ouverte d’isoflurane a été développée comme une technique rapide et nécessitant peu de ressources pour induire une anesthésie à court terme chez les souris ^9,22,23. Cette méthode demande un peu de pratique pour fonctionner de manière cohérente. Le temps sous anesthésie doit être suffisamment long pour anesthésier suffisamment la souris pour aspirer le contenu du pharynx. Si la souris n’est pas suffisamment anesthésiée, elle peut avaler l’inoculum au lieu de l’aspirer. Le signe d’une anesthésie suffisante est atteint lorsque la souris produit un halètement oral régulier de vigueur croissante à un rythme d’environ 50 à 60 halètements / min. La tête de la souris couchée doit avancer à chaque halètement. Une anesthésie insuffisante peut être déterminée par un manque de halètement ou un mouvement des moustaches, de la langue ou des membres. Il est préférable d’enfoncer la langue avec la pointe de la pipette tout en administrant l’inoculum pour éviter l’ingestion. Un surdosage d’isoflurane peut entraîner la mort de la souris et doit être évité. Une bonne règle de base pour éviter cela est de retirer la souris de l’isoflurane après le même laps de temps nécessaire pour que la souris perde le réflexe de redressement. Par exemple, si la souris met 10 s pour perdre le réflexe de redressement, retirez-la après 10 s supplémentaires. Au fur et à mesure que le gaz isoflurane s’échappe au cours de plusieurs traitements sur des souris, ce délai peut augmenter. Dans nos mains, nous pouvons traiter 6 à 8 souris sans ajouter plus d’isoflurane.

Il existe certaines limitations aux composants de ce protocole. La procédure d’inoculation utilise des spores en suspension dans 25 μL de milieu PBS fluide, ce qui est moins physiologique qu’une inoculation de spores en aérosol. La question reste ouverte de savoir si l’utilisation d’un liquide aspiré modifie la localisation des spores/particules par rapport à d’autres méthodes d’inoculation, telles que l’inhalation de spores en suspension dans l’air. Cependant, l’inhalation d’aérosols nécessite des investissements considérables en ressources et présente d’autres limites (taille limitée de l’inoculum, exposition variable, risque professionnel) qui peuvent ne pas être optimales selon la nature de l’étude et l’environnement du laboratoire. Une autre limitation de ce protocole est qu’une fragilité tissulaire peut survenir pendant la cryosection, ce qui pourrait être dû soit à la présence d’air dans tout le tissu, soit à l’efficacité réduite de la fixation vasculaire par rapport à la fixation intratrachéale. Cette fragilité de cryosectionnement peut être surmontée en coupant des sections plus épaisses de 60 à 100 μm et en utilisant la microscopie confocale pour imager des plans bidimensionnels (2D) dans le tissu.

Nous pensons que la simplicité et l’adaptabilité de cette méthode permettront à d’autres groupes de trouver une utilité avec les agents pathogènes inhalés qu’ils ont choisis et les réponses de l’hôte qui les intéressent.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
18 G, 1 1/2 aiguille (305185)	Fisher	305185
1 L  ; Pot à vis  ; (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Seringues non stériles en vrac Air-Tite 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed injectable (solution stérile de xylazine)	Akorn	59399-110-20
Bloqueur et diluant sans animaux, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Cathéter IV à écran ailé avec matériau de cathéter BD Vialon 18 g x 1,88 po	BD	381547
BD Pharmingen Purifié Rat Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block&trade ;)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Colorant	Fisher	Scientific NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta ;   ;	BEI Resources	NR-166
Corning 70 microns Filtres	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 Anticorps monoclonal	Biolegend	118211
Exel International Aiguilles HYpodermic 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Seringues stériles à usage unique (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose monohydraté	Azer Scientific  ;	ES17530-500G
Graisse sous vide	poussé VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Chlorhydrate de kétamine	Dechra	1000001250
KIMWIPES Essuie-glaces Delicate Task (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Ciseaux pour bébé	FST	14078-10
Pince Micro-Adson	FST	11018-12
Formol tamponné neutre (10 %) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask flacons de culture tissulaire, T75, capuchons filtrants	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way moules d’encastrement	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Logiciel	Open-source	https://qupath.github.io/
Fil de suture en soie taille 3/0	FST	18020-30
DiapositivesMicro Slides Superfrost Plus  ;	VWR	48311-703
Verre SlowFade Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Stylo barrière hydrophobe Ensemble de 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangulaire (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
Grillage en plastique blanc	MAPORCH	789862904922
Extrait de levure	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7  ;		Microscope fluorescent multicanaux	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html Carl Zeiss Microscopy GmbH
Logiciel ZEN 3.7 Logiciel	microscopie	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	Zeiss Microscopy GmbH