Techniques de culture et de traitement des organoïdes tridimensionnels pour la génération de fibromes myométaux et utérins

Summary

Ce protocole décrit une technique manuelle pour créer des hydrogels contenant du collagène intégrés à des cultures organoïdes 3D de cellules souches à partir de tissu myométrial et de fibromes utérins.

Abstract

Les fibromes utérins sont les tumeurs bénignes, monoclonales et gynécologiques les plus courantes dans l’utérus d’une femme. Pour surmonter les obstacles courants liés aux méthodes utilisées dans l’étude de ces pathologies, nous avons voulu élaborer une stratégie visant à générer des modèles organoïdes tridimensionnels des cellules souches du myomètre et des fibromes utérins en utilisant des hydrogels contenant du collagène comme échafaudages d’enrobage. Plus précisément, des hydrogels contenant du collagène dans des plaques à faible attachement en V à 96 puits ont été exploités. Cette méthode a permis le développement d’organoïdes 3D de deux types de cellules souches à partir du myomètre normal et du myomètre contenant des fibromes utérins en les incorporant dans des hydrogels contenant du collagène et en formant des organoïdes dans un milieu de prolifération cellulaire souche approprié. Les organoïdes ont réussi à différencier, se multiplier et à s’auto-organiser en structures complexes, développant un système durable. L’importance de ce modèle réside dans la compréhension de la physiopathologie et de l’étiopathogenèse, ainsi que dans le test de nouveaux médicaments pour prévenir ou traiter les fibromes utérins.

Introduction

Les fibromes utérins, ou léiomyomes, sont les tumeurs bénignes les plus courantes de^{l’utérus 1}. Ils touchent une part significative des femmes durant leurs années de reproduction, des recherches suggérant qu’environ 77 % des femmes en sont confrontés à un moment donné. Bien que de nombreuses femmes aient des fibromes sans symptômes, un nombre important de 25 % présentent des symptômes tels que des saignements utérins anormaux, des douleurs pelviennes ou une^{infertilité 2}. Le développement et la croissance des fibromes sont influencés par divers facteurs, notamment les hormones sexuelles, ....

Protocol

Le protocole a été approuvé par le Comité des Ethniques de l’Université de Chicago, avec le numéro d’approbation IRB#20-1414. Selon la banque de tissus de l’Université de Chicago, le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets dont le tissu a été prélevé.

1. 3D culture des organoïdes

1. Cultiver et maintenir les cellules souches myométriales et UF isolées et purifiées comme décrit précédemment⁹.
2. Obtenir les SC à partir de l’azote liquide et les laisser dégeler. Un organigramme du processus de culture est présenté à la Figure 1.

Results

Dès le premier jour après l’ensemencement, les SC ont commencé à s’auto-agréger, formant des organoïdes, comme illustré. Nous avons déterminé que la densité optimale de semis était de 10 000 SC, qui formaient systématiquement des organoïdes lorsqu’ils étaient cultivés dans un système de culture défini. Ce système utilisait des hydrogels contenant du collagène comme échafaudage ECM pour les cellules souches et le milieu de prolifération des cellules souche.......

Discussion

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles qui ressemblent à des organes miniaturisés et sont composées de cellules auto-organisées dérivées de cellules souches ou d’échantillons de^{tissu 11}. Les organoïdes de cellules souches issues des tissus des patients ont le potentiel de révolutionner la recherche biomédicale et les applications cliniques grâce à leur capacité remarquable à reproduire avec précision la physiologie et la maladie^12<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photons confocal  ; Microscope	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, États-Unis	97062-248
Microplaques sphéroïdes Akura 96 & nbsp ;	InSphero	CS-09-004-03	Plaques à bas pied en V à faible attachement
Alexa Fluor 488 anti-chèvre IgG  ;	Life Technologies, CA, États-Unis	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anti-lapins pour chèvres IgG  ;	Life Technologies, CA, États-Unis	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]  ;	GeneTex, Taïwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorps anti-alpha musculaire lisse contre l’actine & nbsp ;	Abcam, MA, États-Unis	(ab7817)	1 & micro ; g/mL
Anticorps anticollagène III   ;	Abcam, MA, États-Unis	(ab7778)	(1:500)
Anticorps anti-SOX1   ;	Abcam, MA, États-Unis	ab242125	(1:500)
Facteur d’attachement   ;	Gibco, États-Unis	S-006-100
Tampon de blocage   ;	Dako	X0909	5 %  ; sérum de cheval   ;+ 0,5 %  ; Triton X-100 & nbsp ; dans 1X  ; PBS
Cryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Thermo Scientific, Allemagne	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Lituanie	EN0521
Dullbecco » s modifié Eagle' DMEM moyen et   ; F12	Gibco, États-Unis	21041-025
Sérum bovin fœtal   ;	Omega Scientific ,   ; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hydrogels contenant du collagène)	Corning, Corning, NY	356237
Milieu MesenCult-ACF Plus (Milieu proliférant des cellules souches sans sérum   ; )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
Composé OCT (composé à température de coupe optimale)	Sakura, États-Unis	4583
Microscope Olympus BX41 & nbsp ;	Olympus America, Center Valley, PA
Solution d’inhibiteur de protéase ovomucoïde   ;	Worthington Biochemical Corporation, États-Unis	LK003182
Papain  ;	Worthington Biochemical Corporation, États-Unis	LK003176	solution d’activation (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoéthanol, 5,5 mM L-cystéine HCl)
PBS (solution saline tamponnée phosphate)	Gibco, États-Unis	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldéhyde) 4 %	Invitrogen, États-Unis	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  ; QuPath : logiciel open source pour l’analyse d’images en pathologie numérique.  ; Rapports scientifiques & nbsp ; (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Logiciels pour l’analyse de bioimagerie
Microscope à accéléré
Fioles de culture tissulaire	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsine & nbsp ;	Gibco, États-Unis	A12859-01	0,25 % de trypsine et 0,1 % d’EDTA dans le HBSS sans calcium ni magnésium & nbsp ;
Média de montage antifade VECTASHIELD complété par DAPI	Laboratoires Vector, CA, États-Unis	#  ; UX-93952-24	1  ; ng/mL