Techniques de culture et de traitement des organoïdes tridimensionnels pour la génération de fibromes myométaux et utérins

Summary

Ce protocole décrit une technique manuelle pour créer des hydrogels contenant du collagène intégrés à des cultures organoïdes 3D de cellules souches à partir de tissu myométrial et de fibromes utérins.

Abstract

Les fibromes utérins sont les tumeurs bénignes, monoclonales et gynécologiques les plus courantes dans l’utérus d’une femme. Pour surmonter les obstacles courants liés aux méthodes utilisées dans l’étude de ces pathologies, nous avons voulu élaborer une stratégie visant à générer des modèles organoïdes tridimensionnels des cellules souches du myomètre et des fibromes utérins en utilisant des hydrogels contenant du collagène comme échafaudages d’enrobage. Plus précisément, des hydrogels contenant du collagène dans des plaques à faible attachement en V à 96 puits ont été exploités. Cette méthode a permis le développement d’organoïdes 3D de deux types de cellules souches à partir du myomètre normal et du myomètre contenant des fibromes utérins en les incorporant dans des hydrogels contenant du collagène et en formant des organoïdes dans un milieu de prolifération cellulaire souche approprié. Les organoïdes ont réussi à différencier, se multiplier et à s’auto-organiser en structures complexes, développant un système durable. L’importance de ce modèle réside dans la compréhension de la physiopathologie et de l’étiopathogenèse, ainsi que dans le test de nouveaux médicaments pour prévenir ou traiter les fibromes utérins.

Introduction

Les fibromes utérins, ou léiomyomes, sont les tumeurs bénignes les plus courantes de^{l’utérus 1}. Ils touchent une part significative des femmes durant leurs années de reproduction, des recherches suggérant qu’environ 77 % des femmes en sont confrontés à un moment donné. Bien que de nombreuses femmes aient des fibromes sans symptômes, un nombre important de 25 % présentent des symptômes tels que des saignements utérins anormaux, des douleurs pelviennes ou une^{infertilité 2}. Le développement et la croissance des fibromes sont influencés par divers facteurs, notamment les hormones sexuelles, les facteurs de croissance, les changements génétiques et d’autres mécanismes^{biologiques 3}.

Afin d’étudier la pathogenèse et l’efficacité des médicaments testés, des modèles in vitro et animaux ont été développés. Les cellules en cultures 2D sont forcées de croître sur une surface plane, ce qui déforme leur forme et modifie leur comportement par rapport à leur comportement dans un environnement tissulaire 3D. Le principal inconvénient de la culture 2D par rapport à la culture 3D est qu’elle représente mal l’environnement cellulaire naturel au sein d’un tissu, ne parvenant pas à imiter fidèlement les interactions complexes cellule-cellule et matrice cellulaire qui se produisent chez un organisme vivant, ce qui conduit à des résultats potentiellement inexacts lors de l’étude du comportement cellulaire et de la réponse aux^{stimuli 4}. De plus, la UF et les cellules myométriales perdent rapidement leur réactivité hormonale en culture^{2D 5}. Dans l’ensemble, les différents modèles animaux ont fourni des informations pertinentes concernant la physiopathologie de la^{FU 6}. Comparés aux modèles animaux, les organoïdes 3D offrent plusieurs avantages : ils simplifient les expériences, sont compatibles avec l’imagerie en temps réel et permettent d’étudier les aspects du développement et des maladies spécifiques à l’humain qui ne sont pas bien représentés dans les modèles^{animaux 7}. En revanche, les expériences avec des animaux plus sophistiqués, comme les primates, sont très difficiles à justifier éthiquement, en plus des coûts^{élevés 8}. Le modèle organoïde 3D est généralement supérieur aux cultures cellulaires 2D en imitant plus étroitement l’architecture tissulaire in vivo tout en étant plus contrôlé, efficace et rentable que les modèles animaux. Il est donc essentiel de développer des modèles alternatifs plus efficaces qui reproduisent avec précision la croissance naturelle des cellules et la complexité des tissus malades.

Nous avons eu pour objectif de mettre en place la procédure de culture 3D d’organoïdes de cellules souches du myomètre et des fibromes utérins à l’aide d’hydrogels contenant du collagène, avec une procédure manuelle, mettant en avant les principaux avantages et limites.

Protocol

Le protocole a été approuvé par le Comité des Ethniques de l’Université de Chicago, avec le numéro d’approbation IRB#20-1414. Selon la banque de tissus de l’Université de Chicago, le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets dont le tissu a été prélevé.

1. 3D culture des organoïdes

1. Cultiver et maintenir les cellules souches myométriales et UF isolées et purifiées comme décrit précédemment⁹.
2. Obtenir les SC à partir de l’azote liquide et les laisser dégeler. Un organigramme du processus de culture est présenté à la Figure 1.
3. Ajoutez 5 mL de la protéine du facteur d’attache pour préparer les flasques pré-enduites. Couver pendant au moins 4 heures à 37 °C. Ensuite, éliminez l’excès de protéine du facteur d’attachement.
4. Cultivez les SC dans les 2 flasques pré-enduites de 75 cm à l’aide de 10 mL du milieu comprenant à la fois le milieu modifié d’Eagle (DMEM) de Dulbecco et F12, complétés avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 12 %. Incubez la fiole dans un incubateur d’hypoxie à 37 °C avec une concentration d’oxygène de 2 % jusqu’à atteindre 90 % de confluence, comme illustré à la Figure 2A.
   REMARQUE : L’hypoxie peut jouer un rôle important dans la croissance des cellules souches, car elle peut favoriser la prolifération et la survie des cellules souches.
5. À la confluence, détachez les cellules à l’aide d’une solution 25 % de trypsine à 0,1 % d’EDTA dans un HBSS sans calcium ni magnésium.
   1. Pour ce faire, retirez le milieu de culture cellulaire. Lavez les cellules avec 1x PBS. Ajoutez 1 mL de trypsine à une cellule de 25 cm² et incubez pendant 2 à 3 minutes.
   2. Une fois que les cellules commencent à se décoller, ajoutez un substrat avec du sérum pour stopper la réaction à la trypchine. Aspirez la solution cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifugez pendant 5 minutes à 500 x g à température ambiante.
   3. Jetez prudemment le surnageant, laissant la boule intacte.
6. Resuspendez ensuite la pellete cellulaire dans 1 mL de milieu proliférant sans sérum. Interrompez les amas par des pipetages délicats.
7. Effectuer la quantification cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
   1. Mélangez 100 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de solution de bleu de Trypan à 0,4 %.
   2. Faites brièvement passer le mélange en vortex et piettez 10 μL de suspension à lycéne bleue Trypan dans la chambre de l’hémocytomètre entre l’encoche de la chambre et la gaine de verre ( Figure 2B).
   3. Comptez les cellules dans les cases 1 à 4, utilisez les équations suivantes pour calculer le nombre de cellules :
      Cellules/mL = (nombre total de cellules comptées/nombre total de boîtes comptées) x facteur de dilution x 10 000
      Nombre total de cellules dans l’échantillon = cellules/mL x volume total d’échantillon
8. Mélangez environ 10 000 cellules avec 2 μL d’hydrogels contenant du collagène et 98 μL de milieu proliférant sans sérum, pour obtenir un volume final de 100 μL par^{puits 5}pour une plaque en V à 96 puits.
9. Pipeter 100 μL du mélange de cellules dans chaque puits d’une plaque à faible attachement en V à 96 puits. Centrifugez à température ambiante pendant 5 minutes à 100 x g.
10. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 30 minutes.
11. Ajouter un volume supplémentaire de 100 μL de milieu proliférant sans sérum sans hydrogels contenant du collagène dans chaque puits pour fournir la nutrition nécessaire à la croissance des organdies.
12. Compensez l’évaporation du milieu en ajoutant 10 à 20 μL de cellules souches sans sérum proliférant dans chaque puits en cas d’évaporation excessive, ce qui se produit rarement.
13. Cultivez les cellules pendant 7 jours pour la croissance complète des organoïdes, figure 2C-H. Changer le milieu proliflectif des cellules souches sans sérum deux fois par semaine (aspirant doucement l’ancien milieu puis en ajoutant un nouveau substrat) afin de prolonger la culture des organoïdes dérivés des SC jusqu’à 21 jours.

2. Coupe congelée

1. Collectez les cellules de la plaque de 96 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
2. Pour la cryosection, lavez les organoïdes deux fois avec du sérum tampon phosphaté (PBS ; 1x). Ajoutez 500 μL de PBS aux organoïdes, puis centrifugez et jetez le surnageant.
3. Fixez les organoïdes avec 500 μL de paraformoldéhyde (PFA) à 4 % pendant 60 minutes à 4 °C, puis lavez à nouveau avec 1x PBS.
4. Reposez les organoïdes dans 100 μL de bleu de méthylène à 2 % pour colorer pendant 20 minutes. Lavez avec 1x PBS et cryoprotect toute la nuit par suspension dans 500 μL de 30 % de saccharose.
5. Le lendemain, retirez la solution de saccharose par centrifugation. Incorporez les organoïdes dans un composé à température de coupe optimale (OCT) et congelez instantanément à −80 °C.
6. Sectionner les organoïdes dans l’OCT à l’aide d’un cryostat, la profondeur de section optimale est de 10 μm, et placer immédiatement les sections sur les lames, une section par lames.
7. Conservez les lames à 4 °C jusqu’à ce qu’une coloration par immunofluorescence soit réalisée selon la méthode suivante.
8. Lavez la lame 3x avec 100 μL de 1x PBS. Ensuite, ajoutez 100 μL de Triton à 0,1 % dans PBS (1x) pendant 15 minutes à température ambiante.
9. Bloquez les organoïdes avec 5 % de BSA dans 1x PBS pendant 60 minutes et incubez toute la nuit avec des anticorps primaires pour Sox-2 avec dilution (1:500) et α-actine musculaire lisse (α-SMA) avec concentration finale de 1 μg/mL.
10. Lavez les organoïdes avec 100 μL de 1x PBS 3x, puis incubez pendant 1 heure dans le noir avec des anticorps secondaires fluorescents marqués par Alexa Fluor (1:1000).
11. Laver avec 100 μL de 1x PBS 2x puis monter dans un moyen de montage antifade complété par du DAPI (1 ng/mL).
12. Acquérez des images à l’aide d’un microscope fluorescent avec un grossissement de 20x. Voir la Figure 3A et analyser les images avec un logiciel pour l’analyse de bioimagerie.

3. Coloration par immunofluorescence des organoïdes montés entiers

1. Retirez les organoïdes du milieu (étape 1.11) dans un tube de microcentrifuge et lavez deux fois avec 500 μL de PBS 1x.
2. Fixez les organoïdes avec 500 μL de 4 % de PFA pendant 60 minutes à température ambiante. Ensuite, jeter le PFA et laver avec 500 μL de PBS 3x.
3. Perméabiliser les organoïdes fixes avec 0,5 mL de tampon de blocage pendant la nuit à 4 °C.
4. Le lendemain, retirez le tampon bloquant, ajoutez des anticorps primaires (300-500 μL) de collagène III (COL3A1) avec dilution (1:500) et de RHA avec dilution (1:1000), puis incubez les échantillons à 4 °C pendant la nuit.
5. Lavez les organoïdes 3 fois avec 500 μL de 1x PBS, puis incubez avec des anticorps secondaires (594 IgG anti-lapin de chèvre et 488 IgG anti-souris de chèvre) toute la nuit à 4 °C dans le noir.
6. Lavez les organoïdes 3 fois avec 500 μL de 1x PBS, puis incubez avec 5 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 1x PBS (300-500 μL par échantillon) à température ambiante pendant 20 minutes.
7. Lavez les organoïdes trois fois avec 500 μL de PBS 1x et imagez avec un microscope confocal (Figure 3B).

4. Dissociation organoïde

1. Reconstituer 100 mg de papaïne dans une solution d’activation stérilisée filtré à une concentration de 250 U/mL, incuber la solution à 37 °C pendant 30 minutes pour activer l’enzyme
   REMARQUE : Il peut être conservé à 2 à 8 °C pendant jusqu’à 2 semaines.
2. Préparez une solution de dissociation (juste avant utilisation) avec 30 U/mL de papaïne et 125 U/mL de DNase I dans la solution équilibrée de sel de Hanks (HBSS).
3. Transférez les organoïdes (étape 1.11) sur des plaques à 24 puits et ajoutez 500 μL de solution de dissociation.
4. Incubez les échantillons à 37 °C pendant 30 à 60 minutes sur un vibrateur orbital réglé à 90 tr/min.
5. Triturez intermittent 5 à 6 fois en utilisant une pipettrice de 1 mL à température ambiante pour obtenir une suspension composée principalement de cellules uniques.
6. Ajoutez la suspension cellulaire dans un tube centrifugeuse de 15 mL contenant une solution inhibitrice de protéase (1 mL de 10 mg/mL) et centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules et éliminez le surnageant.
7. En resuspendant les cellules dans le tampon approprié, la suspension à cellule unique résultante est illustrée à la Figure 2I.

Results

Dès le premier jour après l’ensemencement, les SC ont commencé à s’auto-agréger, formant des organoïdes, comme illustré. Nous avons déterminé que la densité optimale de semis était de 10 000 SC, qui formaient systématiquement des organoïdes lorsqu’ils étaient cultivés dans un système de culture défini. Ce système utilisait des hydrogels contenant du collagène comme échafaudage ECM pour les cellules souches et le milieu de prolifération des cellules souche...

Discussion

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles qui ressemblent à des organes miniaturisés et sont composées de cellules auto-organisées dérivées de cellules souches ou d’échantillons de^{tissu 11}. Les organoïdes de cellules souches issues des tissus des patients ont le potentiel de révolutionner la recherche biomédicale et les applications cliniques grâce à leur capacité remarquable à reproduire avec précision la physiologie et la maladie^12<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photons confocal  ; Microscope	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, États-Unis	97062-248
Microplaques sphéroïdes Akura 96 & nbsp ;	InSphero	CS-09-004-03	Plaques à bas pied en V à faible attachement
Alexa Fluor 488 anti-chèvre IgG  ;	Life Technologies, CA, États-Unis	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anti-lapins pour chèvres IgG  ;	Life Technologies, CA, États-Unis	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]  ;	GeneTex, Taïwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorps anti-alpha musculaire lisse contre l’actine & nbsp ;	Abcam, MA, États-Unis	(ab7817)	1 & micro ; g/mL
Anticorps anticollagène III   ;	Abcam, MA, États-Unis	(ab7778)	(1:500)
Anticorps anti-SOX1   ;	Abcam, MA, États-Unis	ab242125	(1:500)
Facteur d’attachement   ;	Gibco, États-Unis	S-006-100
Tampon de blocage   ;	Dako	X0909	5 %  ; sérum de cheval   ;+ 0,5 %  ; Triton X-100 & nbsp ; dans 1X  ; PBS
Cryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Thermo Scientific, Allemagne	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Lituanie	EN0521
Dullbecco » s modifié Eagle' DMEM moyen et   ; F12	Gibco, États-Unis	21041-025
Sérum bovin fœtal   ;	Omega Scientific ,   ; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hydrogels contenant du collagène)	Corning, Corning, NY	356237
Milieu MesenCult-ACF Plus (Milieu proliférant des cellules souches sans sérum   ; )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
Composé OCT (composé à température de coupe optimale)	Sakura, États-Unis	4583
Microscope Olympus BX41 & nbsp ;	Olympus America, Center Valley, PA
Solution d’inhibiteur de protéase ovomucoïde   ;	Worthington Biochemical Corporation, États-Unis	LK003182
Papain  ;	Worthington Biochemical Corporation, États-Unis	LK003176	solution d’activation (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoéthanol, 5,5 mM L-cystéine HCl)
PBS (solution saline tamponnée phosphate)	Gibco, États-Unis	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldéhyde) 4 %	Invitrogen, États-Unis	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  ; QuPath : logiciel open source pour l’analyse d’images en pathologie numérique.  ; Rapports scientifiques & nbsp ; (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Logiciels pour l’analyse de bioimagerie
Microscope à accéléré
Fioles de culture tissulaire	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsine & nbsp ;	Gibco, États-Unis	A12859-01	0,25 % de trypsine et 0,1 % d’EDTA dans le HBSS sans calcium ni magnésium & nbsp ;
Média de montage antifade VECTASHIELD complété par DAPI	Laboratoires Vector, CA, États-Unis	#  ; UX-93952-24	1  ; ng/mL