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Article de méthode

Modèle murin d’immunomodulation induite par l’épi-peau

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DOI :

10.3791/67578

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24 juin 2025

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1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’étude démontre le rôle de la peau dans la modulation des réponses immunitaires chez la souris par l’immunisation épicutanée (EC). L’immunisation par EC avec un antigène protéique peut supprimer les réponses immunitaires en cas d’hypersensibilité de contact ou inverser la suppression induite par la peau lorsqu’elle est associée à des profils moléculaires associés à des agents pathogènes. L’immunisation EC est prometteuse en tant qu’approche efficace et sans aiguille de l’immunothérapie.

Résumé

La peau, en tant que plus grand organe du corps humain en interface avec l’environnement extérieur, joue des rôles physiologiques cruciaux, notamment (1) la protection de l’organisme contre les xénobiotiques et les micro-organismes, (2) la facilitation de la thermorégulation, (3) le maintien de l’équilibre hydrique et électrolytique, (4) la synthèse de la vitamine D et (5) la participation à l’immunité. Cet article met en évidence l’implication centrale de la peau dans les mécanismes immunologiques, mettant en évidence sa capacité à immunomoduler en supprimant ou en potentialisant la réponse immunitaire. Des résultats antérieurs révèlent que, chez la souris, l’immunisation épicutanée (EC) avec un antigène, seule ou en conjonction avec des motifs moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), peut supprimer ou potentialiser les réponses immunitaires, respectivement. Plus précisément, il a été observé que l’immunisation de la CE avec un antigène peut supprimer les réponses immunitaires dans divers modèles murins de maladies auto-immunes ou de dermatite de contact allergique. Les résultats indiquent que l’immunisation de la CE avec un antigène associé à des PAMP pourrait constituer une stratégie efficace pour renforcer l’immunité contre les agents pathogènes ou soulager les allergies dépendantes des lymphocytes T auxiliaires de type 2 (Th2). Ce protocole décrit une méthode pour induire une suppression cutanée par l’application épicutanée d’un antigène dans un modèle murin de dermatite de contact allergique humaine (DCA)-hypersensibilité de contact (CHS) médiée par les cellules Th1. Cependant, il peut également être appliqué à divers modèles de troubles murins. L’article présente l’immunomodulation induite par la CE comme un modèle murin attrayant pour l’immunothérapie sans aiguille dans divers troubles.

Introduction

Cet article présente une méthode permettant d’induire une tolérance (appelée « suppression » tout au long de ce texte) dans un modèle murin d’hypersensibilité de contact (CHS) et d’inverser cette tolérance (appelée « contrasuppression » dans ce texte) par l’application épicutanée (EC) d’un antigène seul ou en combinaison avec des ligands pour les récepteurs de reconnaissance des agents pathogènes (PRR), respectivement1. Dans le protocole décrit, (a) les immunoglobulines de souris hapténisées (TNP-Ig) sont utilisées comme antigène pour supprimer l’hypersensibilité de contact ou (b) l’antigène avec des motifs moléculaires associés à l’agent pathogène (PAMP), ligands pour les récepteurs de type Toll (TLR) et les récepteurs de type protéine contenant un domaine d’oligomérisation de liaison aux nucléotides (NOD) (NLR), pour inverser la suppression induite par la peau 2,3,4. Les résultats indiquent que l’immunomodulation induite par la CE est médiée par les cellules T suppressives (Ts) non spécifiques de l’antigène et les cellules T contrasuppressives spécifiques de l’antigène (Tcs). Ces cellules peuvent être examinées dans un modèle murin de transfert de cellules adoptives afin de déterminer le mécanisme des réactions testées. Le protocole actuel décrit deux modèles de transfert cellulaire, le « transfert adoptif IN » et le « transfert adoptif OUT ». Le transfert adoptif IN est utile pour tester l’immunomodulation dans les phases afférente et efférente du SHC. D’autre part, le « transfert adoptif OUT » ne reflète l’effet de l’immunomodulation que dans la phase efférente du SHC.

L’article décrit une méthode de suppression cutanée par l’application épicutanée d’un antigène dans un modèle murin de dermatite de contact allergique humaine (DCA) - hypersensibilité de contact (CHS) médiée par les lymphocytes T auxiliaires de type 1 (Th1)5. Cependant, cette approche a également été testée pour son efficacité dans la régulation (suppression, tolérance) de modèles expérimentaux de CHS 6,7 médiée par les lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1), les maladies auto-immunes telles que l’arthrite induite par le collagène (CIA)8,9 , l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE)10,11 et la colite ulcéreuse12. De plus, le protocole décrit la méthode de contresuppression induite par la peau (suppression inversée) via l’application d’un antigène avec des ligands PRR dans un modèle murin de CHS 13,14,15,16. Les résultats présentés indiquent que la suppression non spécifique de l’antigène induite par la CE peut être inversée en purifiant les ligands TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 et NOD2. La méthode de contrasuppression induite par la peau a également été utilisée dans un modèle animal de dermatite atopique (MA), montrant que le traitement EC avec un antigène en présence de molécules d’ADN monocaténaire synthétiques contenant des oligodésoxynucléotides non méthylés (CpG) - ligand pour TLR9 peut supprimer les réponses médiées par Th2 d’une manière spécifique à l’antigène (déplace la réponse immunitaire vers un phénotype Th1/Th17)17. La méthode décrite a également été testée dans la pneumonie à pneumocoque, démontrant que l’immunisation par EC avec un polysaccharide pneumococcique conjugué à de l’albumine sérique bovine (PC-BSA), associée à CpG, pourrait potentiellement renforcer l’immunité contre Streptococcus pneumoniae18.

Un aspect essentiel de l’immunomodulation induite par la CE est la sélection du modèle et de la nature de l’antigène. L’article comprend un tableau détaillant les antigènes utilisés, la durée d’exposition à l’antigène et la spécificité des lymphocytes T des modèles testés (voir le tableau 1). La méthode décrite pour l’immunomodulation cible les maladies impliquant des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. L’efficacité de cette méthode a été évaluée en utilisant un antigène compatible appliqué par la CE dans le processus. La compatibilité de l’antigène est cruciale pour s’assurer qu’il interagit efficacement avec les lymphocytes T impliqués dans le processus de la maladie. L’application d’un patch protéique ou peptidique sur une peau intacte facilite la pénétration de l’antigène à travers l’épiderme19,20. Cette pénétration accrue de l’antigène est attribuée à une transpiration accrue sous le pansement. Des altérations de la perméabilité épidermique se produisent dans les 4 à 10 heures suivant l’application du timbre, tandis que l’immunomodulation induite par la CE peut rester efficace jusqu’à deux semaines 5,14.

Bien que le traitement CE soit largement utilisé, l’existence de nombreuses variantes de cette méthode pourrait soulever des questions. Les connaissances actuelles suggèrent que l’étendue des lésions épidermiques avant l’administration de l’antigène peut influencer la nature de la réponse immunitaire résultante21. Les lésions superficielles de l’épiderme déclenchent la libération de cytokines anti-inflammatoires par les cellules de Langerhans, favorisant l’initiation de la réponse Th222. En revanche, des lésions épidermiques plus étendues favorisent la libération de cytokines pro-inflammatoires et facilitent l’administration d’antigènes aux cellules dendritiques dermiques23. Le protocole présenté met l’accent sur (a) la reconnaissance des défis liés à l’application de cette méthode chez les animaux petits et actifs, en particulier les souris ; (b) en tenant compte de facteurs tels que l’état de la peau après le rasage au rasoir, le bon contact des substances avec la peau, le temps d’exposition et les conditions d’hygiène de la peau pendant le traitement CE qui peuvent déterminer l’efficacité du traitement. Il est crucial de considérer la méthode d’épilation de la peau, qu’elle soit physique ou chimique, avant l’application de l’antigène, car différentes préparations cutanées peuvent affecter l’état de la peau de diverses manières. Il est reconnu que toutes ces procédures peuvent activer les cellules immunitaires de la peau, entraînant potentiellement des infections cutanées ou influençant la progression de la maladie. Les effets secondaires potentiels sur les affections cutanées après l’épilation doivent être une considération primordiale lors du choix de la méthode d’épilation. Les chercheurs ont décrit une méthode d’immunosuppression médiée par les lymphocytes T induite par l’application d’un antigène par EC sur la peau dorsale rasée au rasoir, démontrant son effet sur divers modèles murins de réponses immunitaires. L’application de la CE de l’antigène, ainsi que les PAMP, induisent des cellules T contrasuppressives spécifiques de l’antigène. De plus, la méthode d’application de la CE, en particulier en cas d’exposition répétée à des antigènes ou à des PAMP, ne provoque pas d’effets secondaires préoccupants.

Le protocole décrit souligne l’importance de divers facteurs pour obtenir des résultats fiables et reproductibles avec cette méthode, en particulier chez les petits animaux comme les souris. La nature non invasive de cette approche entraîne généralement un risque plus faible d’effets indésirables (comme la douleur, l’infection ou la cicatrisation) par rapport aux techniques d’immunisation intradermique ou injectable. L’immunisation épicutanée est conviviale et facile à administrer dans des contextes non cliniques, ce qui améliore l’accessibilité et l’observance par rapport aux méthodes plus invasives.

Tableau 1 : Modulation de la réponse immunitaire induite par la CE dans différents modèles de maladies chez la souris. Abréviations : ACD = dermatite de contact allergique ; DA = dermatite atopique ; Ag = antigène ; CIA = arthrite induite par le collagène ; CHS = hypersensibilité de contact ; CFA = adjuvant de Freund complet ; COLL II = collagène de type II ; DNFB = 2,4-dinitrofluorobenzène ; DNP-BSA = dinitrophényle conjugué à l’albumine sérique bovine ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; EC = épicutanée ; LPS = lipopolysaccharide ; OVA = ovalbumine ; PAMP = motif moléculaire associé à l’agent pathogène ; PC-BSA = polysaccharide pneumococcique conjugué à l’albumine sérique bovine ; Th1 = lymphocyte T auxiliaire de type 1 ; Tc1 = lymphocyte T cytotoxique de type 1 ; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzène ; TNP-Ig = immunoglobulines de souris conjuguées au 2,4,6-trinitrophényle ; Ts = cellules T suppressives ; Tcs = cellules T contrasuppressives. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Protocole

Toutes les expériences présentées dans cet article ont été approuvées et menées conformément aux directives du1er et 2ecomité local d’éthique de l’expérimentation animale à Cracovie, en Pologne. Les procédures étaient conformes aux recommandations locales, notamment en ce qui concerne l’administration de kétamine/xylazine ou d’isoflurane comme anesthésiques, le rasage de la peau de souris à l’aide de lames de rasoir, l’application de substances/haptènes sur la peau rasée et les deux côtés des oreilles, et le prélèvement d’organes immunitaires périphériques. L’étude a utilisé des souris mâles et femelles CBA/J (H-2k), âgées de 6 à 12 semaines, avec des poids corporels allant de 20 à 25 g. Les détails sur les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des animaux

  1. Souris domestiques ensemble ; Il est important de prévenir les effets négatifs de l’isolement sur leur humeur. Pour une signification statistique, utilisez 10 à 12 animaux par groupe.

2. Préparation de la zone de fonctionnement

  1. Nettoyez la table d’opération avec une solution d’éthanol à 70 % avant et après toutes les procédures. Si l’utilisation de souris nécessite des conditions stériles, effectuez toutes les opérations à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.

3. Induction de cellules suppressives (Ts) pour la réaction CHS médiée par Th1

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la figure 1A.

  1. Le jour « 0 », anesthésier les souris avec 30 % d’isoflurane dans du propylène glycol. Tenez la souris dans la main gauche, en exposant la face dorsale de son corps. Avec la main droite, faites mousser le savon gris avec de l’eau abondante et appliquez-le sur la peau.
    1. À l’aide d’une lame de rasoir stérile, rasez doucement une zone de peau de 2 cm². Évitez de blesser la peau. Toute lésion cutanée disqualifiera les souris pour d’autres procédures.
      REMARQUE : Le savon gris est un produit naturel et hypoallergénique fabriqué à partir d’une base végétale douce. Il régénère et hydrate efficacement les peaux sèches et sensibles. Ce savon ne contient pas de colorants artificiels, de parfums synthétiques ou d’ingrédients d’origine animale. Les ingrédients comprennent du palmaté de sodium, du palmiste sodique, de l’eau (eau), de la glycérine, de l’extrait de fleur/feuille/tige de Taraxacum Officinale (pissenlit), de l’acide de palme, de l’acide de palmiste, du chlorure de sodium, du propylène glycol, de l’EDTA tétrasodique, de l’acide étidronique. Le savon gris est conçu pour les peaux sensibles et délicates sujettes aux irritations et au psoriasis. Il nettoie efficacement les peaux à problèmes tout en prévenant la sécheresse excessive et la sensation de tiraillement. Ce savon apaise également les irritations, hydrate et favorise une régénération plus rapide de la peau. Il est important de noter qu’il ne compromet pas la barrière protectrice de la peau.
  2. Placez les souris dans la cage. Après le rasage, attendez au moins six heures avant d’appliquer l’antigène pour permettre à la peau de sécher et d’être nettoyée par l’animal.
  3. Le jour « +1 », préparer une solution de 1 mg/mL d’immunoglobuline de souris conjuguée à l’antigène 2,4,6-trinitrophényle (TNP-Ig), dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (DPBS). Préparez le volume d’un antigène de 1200 μL pour dix souris. Mélanger les solutions juste avant l’utilisation dans un flacon de 2 ml. Protégez le TNP-Ig de la lumière en recouvrant le flacon d’une feuille d’aluminium.
    REMARQUE : Inclure un groupe témoin de souris traitées uniquement avec le véhicule (DPBS) pour évaluer les réactions inflammatoires non spécifiques causées par le rasage et l’application du solvant sur l’endroit rasé. Un autre type d’antigène doit être utilisé pour l’induction de Ts afin de tester leur spécificité antigénique. Des immunoglobulines (Ig) de souris ont été préparées à partir de sérums de souris et conjuguées avec de l’haptène TNP (fichier supplémentaire 1). Une seule préparation avec un niveau de substitution de 40 TNP par molécule d’Ig (TNP40-Ig) a été utilisée tout au long de24,25.
  4. Le même jour, anesthésez les souris avec 30 % d’isoflurane dans du propylène glycol. Appliquez l’antigène sur l’endroit préalablement rasé en plaçant un timbre de gaze de1 cm 2 imbibé de 100 μL de l’antigène (préparé à l’étape 3.3). Recouvrez-le d’un mince patch en plastique (2 cm²) et fixez-le avec du ruban adhésif en tissu. Dans le groupe témoin CHS, appliquez uniquement DPBS.
    REMARQUE : Des pochettes transparentes de 30 μm peuvent être utilisées pour le patch en plastique. Le ruban adhésif en tissu doit être facilement amovible, flexible, s’adapter aux formes du corps et permettre une perméabilité à l’air et à la vapeur d’eau.
  5. Le jour « +5 », anesthésez les souris avec 30 % d’isoflurane dans du propylène glycol. Coupez soigneusement le patch avec des ciseaux de sécurité aux coins arrondis, puis retirez délicatement le ruban adhésif. Laissez les souris bouger librement et nettoyez naturellement leur peau pendant au moins 4 h. Si nécessaire, rasez les poils qui repoussent au site d’application de l’antigène, bien que cela ne soit généralement pas nécessaire.
    REMARQUE : Coupez le ruban adhésif uniquement au niveau de la zone d’administration de l’antigène (gaze et zone en plastique), où il n’adhère étroitement qu’aux bords du pansement. Attendez au moins 4 h avant d’appliquer l’antigène pour permettre à la peau de sécher et d’être nettoyée par l’animal.
  6. Le jour « +5 », répétez l’étape 3.3 et l’étape 3.4.
  7. Le jour « +8 », répétez l’étape 3.5. Cela marque la fin d’une exposition cutanée d’une semaine à l’antigène. Après cette période, utilisez les souris pour tester la suppression de la réaction CHS - modèles actifs in vivo (étape 6) ou euthanasiez-les pour servir de donneurs de cellules T dans le « transfert adoptif IN » (étape 8) ou dans le « transfert adoptif OUT » (étape 9).

4. Induction de lymphocytes T contrasuppresseurs (Tcs) pour la réaction CHS médiée par Th1

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la Figure 1B.

  1. Le jour « 0 », exécutez les étapes 3.1-3.2.
  2. Le jour « +1 », préparez un mélange de 100 μg d’antigène TNP-Ig et de 100 μg de LPS (exemple de PAMP) dans 100 μL de DPBS. Préparez la solution immédiatement avant de l’utiliser dans un flacon de 2 ml et protégez-le de la lumière en enveloppant le flacon dans du papier d’aluminium si l’antigène est photosensible.
    REMARQUE : Pour évaluer la contre-suppression (inversion de la suppression induite par la peau), un groupe témoin pour la suppression (groupe témoin de Ts) doit être inclus, où les souris sont traitées uniquement avec l’antigène TNP-Ig. De plus, les souris traitées uniquement avec le DPBS (contrôle CHS) et le LPS seul (contrôle PAMP) devraient être inclus pour déterminer l’étendue de la modulation non spécifique des réponses immunitaires. Le LPS est un exemple de particule26 immunostimulante. Les caractéristiques spécifiques de tout stimulateur immunitaire dépendent du modèle de souris utilisé, des types de cellules immunitaires impliquées dans la réponse immunitaire étudiée et de la pharmacocinétique des substances étudiées.
  3. Le même jour, anesthésez les souris avec 30 % d’isoflurane dans du propylène glycol. Placez un patch de gaze de1 cm 2 sur la peau préalablement rasée, saturée d’une solution contenant 100 μL du mélange (préparée à l’étape 4.2). Fixez la gaze à l’aide d’une fine plaque en plastique (2 cm²) et fixez-la à l’aide d’un enduit adhésif pour tissu. Dans les groupes de contrôle, appliquez DPBS (contrôle CHS) ou LPS (contrôle PAMP), ou TNP-Ig seul (groupe témoin Ts).
    REMARQUE : Des pochettes transparentes de 30 μm peuvent être utilisées pour le patch en plastique. Le ruban adhésif en tissu doit être facilement amovible, flexible, s’adapter aux formes du corps et permettre une perméabilité à l’air et à la vapeur d’eau.
  4. Le jour « +5 », exécutez l’étape 3.5.
  5. Le jour « +5 », répétez les étapes 4.2-4.3.
  6. Le jour « +8 », répétez l’étape 3.5. Une semaine d’exposition cutanée à l’antigène mélangé au LPS est terminée. Après cette période, tester les souris dans la réaction CHS - modèles actifs in vivo (étape 6), ou euthanasier pour servir de donneurs de cellules Tcs dans le « transfert adoptif OUT » (étape 10).

5. Induction de cellules effectrices T (Teff) pour la réaction CHS médiée par Th1 (phase de sensibilisation de CHS)

  1. Le jour « 0 », rasez la poitrine et l’abdomen des souris (zone de 2 × 2 cm) avec du savon gris avec de l’eau suivi d’une lame de rasoir. Laissez la peau reposer pendant 6 heures avant d’appliquer l’haptène pour assurer l’absence d’irritation.
  2. Le même jour, juste avant l’utilisation, préparez la solution d’haptène (5 %) dans un flacon en verre et couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière : 2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB) dans un mélange acétone-éthanol (rapport 1 : 3).
  3. Le même jour, sensibilisez les souris en appliquant 150 μL d’haptène sur l’endroit préalablement rasé. Appliquez le véhicule seul (mélange acétone-éthanol) dans le groupe témoin négatif pour évaluer la réaction inflammatoire non spécifique. Avant de remettre l’animal dans la cage, attendez 30 s pour laisser sécher la peau.
    ATTENTION : Utilisez des gants ; Le TNCB provoque des réactions allergiques graves chez la plupart des gens.

6. Modèle actif : test des cellules Ts ou Tcs dans le CHS médié par Th1

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la Figure 2.

  1. Induisez la cellule Ts ou Tcs en suivant l’étape 3 et l’étape 4. Cette procédure durera du jour « 0 » jusqu’au jour « +8 ».
  2. Le jour « +8 », commencez à induire les cellules Teff en suivant l’étape 5.
  3. Quatre jours plus tard, évaluez la réponse CHS en effectuant la phase d’élicitation (provocation). En bref, appliquez le TNCB des deux côtés des oreilles. Ensuite, quantifiez l’épaisseur des oreilles en les mesurant au micromètre. Une description détaillée de cet essai et d’autres paramètres possibles est présentée ailleurs (Zemelka-Wiacek, M. et coll.27).

7. Isolement des cellules Teff, T ou Tcs à partir de souris donneuses

  1. Stérilisez la table d’opération avec une solution d’éthanol à 70 % avant et après chaque procédure. Effectuer toutes les procédures à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité et utiliser des instruments stérilisés. Pour isoler les cellules Ts, Tcs et Teff le jour « +8 », utilisez des souris immunisées par EC décrites aux étapes 3, 4 et 5, respectivement.
    REMARQUE : Respectez un ratio donneur-receveur de 1:1.
  2. Anesthésier les donneurs avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg). Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée pendant au moins 5 min.
  3. Désinfectez toute la zone abdominale de la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70 %, puis incisez la couche abdominale (3-4 cm) pour exposer la cavité péritonéale. Isolez les ganglions lymphatiques auxiliaires et inguinaux (ALN) et la rate (SPL) à l’aide de la pince stérile dans des tubes remplis de DPBS stériles complétés par 1 % de sérum fœtal bovin (FBS). Regroupez les ALN de tous les donateurs dans un flacon et les SPL dans un autre, et gardez les flacons sur de la glace. Chaque aisselle contient deux ganglions lymphatiques axillaires, tandis qu’un seul ganglion lymphatique inguinal est situé dans la région de la hanche, à côté de trois vaisseaux sanguins. Les LPP sont positionnés sur le côté gauche du corps, derrière l’intestin et l’estomac.
    REMARQUE : Travaillez avec des outils stériles sous l’enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles. Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées selon les protocoles approuvés par l’établissement.
    1. Écrasez du tissu entre les extrémités givrées de deux lames de microscope. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de cellules avec une taille de pores de 70 μm.
  4. Rincez les cellules avec 30 ml de DPBS complété par 1 % de FBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 à 5 mL de DPBS.
  5. Comptez la viabilité de la cellule à l’aide d’un hémocytomètre et de Trypan Blue. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 90-990 μL de Trypan Blue, en ajustant le volume en fonction du nombre de cellules. Intégrez ce facteur de dilution dans le calcul de la viabilité.
  6. Préparez un mélange d’ALN et de SPL (rapport 1:1). Respectez le nombre de cellules : utilisez 1 à 5 x 10cellules 7 T ou Tcs par receveur dans 1 mL de DPBS complété par 1 % de FBS et 7 x 107 cellules de teff/receveur dans 1 mL de DPBS. Maintenir le ratio donneur-receveur pour toutes les populations cellulaires de 1:1 et également le rapport donneur-DPBS 1:1. Conservez les flacons avec les cellules sur la glace.
    REMARQUE : La réalisation d’autres expériences in vitro nécessite une augmentation proportionnelle du nombre de donneurs de cellules.
    REMARQUE : De plus, les cellules Teff, Ts et Tcs isolées peuvent faire l’objet d’une purification ou d’analyses supplémentaires à l’aide de la cytométrie en flux, telles que le phénotypage ou l’évaluation de la sécrétion de cytokines. Il est également possible d’initier des cultures cellulaires pour explorer la capacité de prolifération cellulaire ou quantifier les niveaux de cytokines dans les surnageants de culture. La réalisation d’expériences supplémentaires nécessite une augmentation proportionnelle du nombre de donneurs de cellules.

8. Transfert adoptif IN : Test de Ts dans le CHS médié par Th1

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la figure 3. Travaillez stérilement et utilisez une solution d’éthanol à 70 % avant et après chaque procédure. Assurez-vous que toutes les opérations cellulaires sont effectuées dans une enceinte de biosécurité pour maintenir la stérilité et utilisez des instruments stérilisés.

  1. Induire et isoler les lymphocytes T (donneurs) en suivant les étapes 3 et 7. Rincez les cellules avec 30 mL de DPBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de DPBS par receveur (rapport donneur-receveur 1:1).
  2. Receveurs (souris syngéniques naïves) : anesthésier les receveurs avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg). Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée pendant au moins 5 min.
  3. Administrer une injection intraveineuse (i.v.) d’un mélange préparé de 1 à 5 cellules 10 x 10cellules 7 T (étape 8.2) dans 200 μL au receveur anesthésié.
  4. Le même jour, induire une réaction CHS médiée par Th1. En bref, induire la cellule de teff (phase de sensibilisation) décrite aux étapes 5.1-5.3). Quatre jours plus tard, évaluez la réponse de la SCH en effectuant la phase d’élicitation (provocation) décrite à l’étape 6.3.

9. Transfert adoptif OUT : test des Ts dans le CHS médié par Th1

  1. Induire et isoler les cellules T et Teff (donneurs) en suivant les étapes 3, 5 et 7. Conservez les T et le Teff isolés dans deux flacons séparés. Divisez les cellules de teff en deux flacons : un pour le « groupe test Ts » et un pour le « groupe témoin CHS ».
    REMARQUE : Travaillez stérilement et utilisez une solution d’éthanol à 70 % avant et après chaque procédure. Assurez-vous que toutes les opérations cellulaires sont effectuées dans une enceinte de biosécurité pour maintenir la stérilité et utilisez des instruments stérilisés. Inclure un groupe témoin de receveurs à qui seules des cellules de Teff seront administrées (« contrôle CHS »). Pour ce groupe, il faut utiliser des donneurs supplémentaires pour respecter le ratio donneur-bénéficiaire de 1:1. Pour améliorer la qualité des résultats, il faut ajouter des cellules receveuses recevant des cellules témoins transférées de donneurs traités par EC avec une solution solvante. La décision d’ajouter un groupe supplémentaire de receveurs et de donateurs doit être soigneusement planifiée, car cette approche nécessite beaucoup de souris, ce qui ne respecte pas le principe des 3R (Réduire, Affiner, Remplacer).
  2. Ajoutez des cellules T aux cellules Teff pour le « groupe de test Ts ». Ajouter suffisamment de DPBS aux cellules de teff dans le flacon de contrôle CHS.
    REMARQUE : Conservez le nombre de 1 à 5 cellules1-5 x 10 7 Ts et de 7 x 10cellules 7 Teff par receveur.
  3. Mélangez doucement tous les flacons. Conservez les flacons dans le bain-marie (37 °C) pendant 30 min, en mélangeant doucement toutes les 5 min.
  4. Rincez chaque flacon de cellules avec 30 ml de DPBS complété par 1 % de FBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellules dans 200 μL de DPBS/récepteur.
  5. Passez chaque suspension cellulaire à travers une crépine de cellules interstitielles de 70 μm. Si nécessaire, ajustez le volume de 200 μL de DPBS/récipient.
  6. Receveurs (souris syngéniques naïves) : anesthésier les receveurs avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg). Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée pendant au moins 5 min.
  7. Administrer une injection intraveineuse (i.v.) de cellules préparées.
  8. Le même jour, induire la phase d’élicitation de la SHC (provocation) décrite à l’étape 6.3. Inclure le « contrôle négatif », où la conduite seulement la contestation du SHC.

10. Transfert adoptif OUT : test de Tcs dans le CHS médié par Th1

  1. Induire et isoler les cellules Ts, Tcs et Teff (donneurs) en suivant les étapes 3 à 5 et l’étape 7.
    REMARQUE : Travaillez stérilement et utilisez une solution d’éthanol à 70 % avant et après chaque procédure. Assurez-vous que toutes les opérations cellulaires sont effectuées dans une enceinte de biosécurité pour maintenir la stérilité et utilisez des instruments stérilisés. Inclure deux groupes témoins de receveurs : un « témoin CHS » dans lequel seules les cellules Teff seront administrées et un « contrôle T » dans lequel les cellules Teff seront incubées uniquement avec des cellules Ts. Pour ces groupes, utilisez des donneurs supplémentaires pour respecter le ratio donneur-receveur de 1:1.
  2. Conservez les cellules Ts et Tcs isolées dans des flacons séparés. Divisez les cellules de teff en trois flacons : un pour le « groupe d’essai Tcs », un pour le « témoin T » et un pour le « témoin CHS ».
  3. Première incubation : Pour le (a) « groupe d’essai Tcs », ajouter des cellules Tcs aux cellules Teff. Pour les options (b) « témoin Ts » et (c) « témoin CHS », ajouter une quantité adéquate de DPBS dans les cellules de Teff (voir le tableau 2).
    REMARQUE : Conservez le nombre de 1 à 5 cellules 1 x 107 Tcs et de 7 x 10cellules 7 Teff par receveur.
  4. Mélangez doucement tous les flacons. Conserver au bain-marie (37 °C) pendant 30 min en mélangeant doucement toutes les 5 min.
  5. Rincez chaque flacon de cellules avec 30 ml de DPBS complété par 1 % de FBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez le surnageant et mettez en suspension la pastille de cellules dans 1 mL de DPBS complété par 1 % de FBS par receveur. Maintenir un rapport mélange de cellules-DPBS de 1:1.
  6. Deuxième incubation : Pour le (a) « groupe d’essai Tcs », ajouter des cellules T au mélange de cellules Teff et Tcs préincubées. Pour le (b) « témoin Ts », ajouter des cellules Ts au mélange de cellules de teff préincubées avec du DPBS. Pour le (c) « contrôle CHS », ajouter suffisamment de DPBS aux cellules de teff préincubées.
    REMARQUE : Conservez le nombre de cellules 1-5 x 107 T par destinataire. Effectuer des incubations dans tous les groupes expérimentaux (a, b et c) pour assurer l’uniformité de la perte de cellules pendant les procédures de lavage et de centrifugation.
  7. Mélangez doucement tous les flacons. Conserver au bain-marie (37 °C) pendant 30 min en mélangeant doucement toutes les 5 min.
  8. Rincer chaque fiole de cellules avec 30 mL de DPBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellules dans 200 μL de DPBS/récepteur.
  9. Passez chaque suspension cellulaire à travers une crépine de cellules interstitielles de 70 μm. Si nécessaire, ajustez le volume de 200 μL de DPBS/récipient.
  10. Receveurs (souris syngéniques naïves) : anesthésier les receveurs avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg). Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée pendant au moins 5 min.
  11. Administrer une injection intraveineuse (i.v.) de cellules préparées.
  12. Le même jour, induire la phase d’élicitation de la SHC (provocation) décrite à l’étape 6.3. Inclure le « contrôle négatif », où la conduite seulement la contestation du SHC.

Tableau 2 : Calendrier des incubations cellulaires pendant le « transfert OUT » de Tcs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Résultats

Cette étude examine si les antigènes appliqués par la peau seuls ou combinés avec le PAMP peuvent induire des cellules T ou Tcs, respectivement, qui modulent la réaction CHS. L’immunisation des souris CBA/J par EC avec 100 μg de TNP-Ig ou TNP-Ig plus 100 μg de LPS induit des cellules T ou Tcs, respectivement. Les souris ont ensuite été sensibilisées avec 5 % de TNCB et testées avec le même hapten 4 jours plus tard. La réaction a été évaluée en mesurant le gonflement de ...

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Discussion

Les recherches ont été menées sur de nombreux modèles animaux différents et en utilisant de nombreuses souches de souris comme BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 et B10.PL et SJL démontrent que l’immunisation par EC avec un antigène attribué peut servir de moyen polyvalent et potentiellement illimité de créer une tolérance et de contrôler les réponses immunitaires indésirables. Le protocole actuel décrit deux modèles de transfert cellulaire : (1) le « transfert adoptif IN », qui est utile...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions du Comité polonais de la recherche scientifique (subventions 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29) et du Centre national des sciences (National Science Center) N N401 3554 33 (N° N401 3554 33) à M.S. Les graphiques ont été dessinés à l’aide du logiciel GraphPad Prism 10.2.3, et les figures 1 à 3 ont été créées dans BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025) : (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Les auteurs remercient Dorota Woźniak de s’être occupée des colonies de souris.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JaponC0307
Immunoglobuline murine conjuguée au 2,4,6-trinitrophényl (TNP-Ig)Président des sciences biomédicales, Faculté des sciences de la santé, Collège médical de l’Université Jagellonne, Cracovie, Pologne
l’acétone (réactif ACS, &ge ; 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne179124
Papier aluminiumMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneZ185140  ;   ;
bilan analytique & nbsp ;Sartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, AllemagnePRACTUM224-1, 29105177
Albumine sérique bovine (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneA9418
CBA/J (H-2k)  ;Unité de sélection de la chaire des sciences biomédicales, Faculté des sciences de la santé, Collège médical de l’Université Jagellonne, Cracovie, Pologne
Filtre cellulaire, taille de pores 70 et mu ; mBIOLOGIX, Chine15-1070
Capacité des pipettes jetables : 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco & prime ; s solution tampon phosphate (DPBS)ThermoFisher Scientific,   ; Waltham, Massachusetts, États-Unis14190144
Tubes Eppendorf Safe-Lock 1,5 mlEppenforf, Allemagne30120086
Tubes Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlEppenforf, Allemagne30120094
Éthanol 100 % (alcool absolu)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.07017
Éthanol 96 %Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.59010
Sérum bovin fœtal (FBS)ThermoFisher Scientific,   ; Waltham, Massachusetts, États-UnisA3160802
lames de microscope en verre (sablées à l’une et givrées)ThermoScientific, Portsmouth, NH, États-Unis421-004T
Prisme Graph PadGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
savon gris (Gelée de Bialy en barre)Pollena Ostrzeszó ; w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Pologne163057
hémocytomètreVWR, Avantor, États-Unis612-5719
Incubateur Heracell 150iThermo Electron  ; LED Gmbh, Allemagne41071068
isoflurane (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, États-Unis8AGG9623
Kétamine 100 mg/mL, solution pour injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polognecat.# non disponible
Centrifugeuse de laboratoire (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Allemagne75002425
Centrifugeuse de laboratoire (Heraeus Megafuge 1.0R)  ; Thermo Scientific, AllemagneB00013899
Lipopolysaccharide (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneL-8274
masque (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis111-0917
MicromètreMitutoyo, Tokyo, Japon193-111
Microscope avec objectifsLeica Microsystems CMS GmbH, AllemagneDM1000, 294011-082007
propylène glycol   ;Chempur, Piekary figure-materials-1 Pologne114489005
Lame de rasoirVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisPERS94-0462
Enveloppes transparentes pour documents 30 & Micro ; mSCHÉMA5906961126542
Bleu de trypanMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneT8154
tubes 15 mL stérilesMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneCLS430055 (Corninig)
tubes 50 mL, stérilesMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneCLS430290 (Corning)
fioles, bouchon à vis, verre transparent (flacon uniquement) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne27173
Viscoplast Polovis, adhésif soie, 5x0,0125 m3M Pologne, Nadarzyn, Pologne7100231620
bain marie & nbsp ;AJL Electronic, PologneLW102
Solution d’injection de xylazine (xylapan 20 mg/mL)Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polognecat.# non disponible

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