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Évaluation de la glutamine comme source de carburant pour les macrophages alvéolaires exposés à l’éthanol chronique à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire

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DOI :

10.3791/67579

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15 novembre 2024

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, Emory University, 2Atlanta Veterans Affairs Health Care System

Dans cet article

Résumé

L’abus d’alcool altère l’immunité des macrophages alvéolaires (MA) en raison de la suppression de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique. Nous avons récemment démontré que l’exposition à l’éthanol (EtOH) augmente la dépendance à la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA. Dans le présent document, des méthodes sont fournies pour déterminer l’utilisation de la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA traités à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire.

Résumé

Les macrophages alvéolaires (MA) sont la première ligne de défense cellulaire dans les voies respiratoires inférieures contre les agents pathogènes. Cependant, la consommation chronique et excessive d’alcool altère la capacité des MA à phagocyter et à éliminer les agents pathogènes de l’espace alvéolaire, en partie à cause d’un métabolisme de carburant dérégulé et de la bioénergétique. Nos travaux antérieurs ont montré que la consommation chronique d’éthanol (EtOH) altère la bioénergétique mitochondriale et augmente les niveaux de lactate dans les MA. De plus, nous avons récemment démontré que l’EtOH augmente la dépendance à la glutamine et la respiration maximale dépendante de la glutamine tout en diminuant la flexibilité, s’éloignant de la respiration dépendante du pyruvate et se rapprochant de la respiration dépendante de la glutamine. La glutaminolyse est une voie compensatoire importante pour la respiration mitochondriale lorsque le pyruvate est utilisé pour la production d’acide lactique ou lorsque les autres sources de carburant sont insuffisantes. À l’aide d’une lignée cellulaire de souris AM, des cellules MH-S, exposées à l’absence d’EtOH ou d’EtOH (0,08 %) pendant 72 h, nous avons déterminé la dépendance de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique à la glutamine comme source de carburant à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire. Des mesures en temps réel ont été effectuées en réponse au sulfure d’éthyle de bis-2-(5-phénylacétamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES), un inhibiteur de la glutaminase 1, qui empêche la conversion enzymatique de la glutamine en glutamate, dans le véhicule média ou en réponse au véhicule seul, suivies d’un test du stress mitochondrial. Le protocole étape par étape fourni ici décrit nos méthodes et calculs pour analyser les niveaux moyens de respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine, de respiration mitochondriale liée à l’ATP, de respiration mitochondriale maximale et de capacité respiratoire de réserve mitochondriale dans plusieurs répétitions biologiques et expérimentales.

Introduction

Le trouble lié à la consommation d’alcool (AUD) touche plus de 28 millions de personnes aux États-Unis1. Les personnes atteintes de TCA sont 2 à 4 fois plus susceptibles de développer des infections respiratoires 2,3, ce qui augmente le risque de morbidité et de mortalité prématurées 3,4,5. L’abus d’alcool augmente la susceptibilité aux infections respiratoires, en partie en supprimant la fonction immunitaire pulmonaire. Les macrophages alvéolaires (MA) sont la première ligne de défense cellulaire contre les agents pathogènes dans les poumons inférieurs, où ils phagocytent et éliminent les microbes inhalés. Cependant, la consommation chronique d’alcool altère la capacité des MA à engloutir et à tuer les agents pathogènes 6,7.

Les fonctions immunitaires des MA, telles que la phagocytose, sont des processus exigeants en énergie qui nécessitent des voies métaboliquement actives nécessaires à la génération d’une forte production d’adénosine triphosphate (ATP). La phosphorylation oxydative mitochondriale est le processus cellulaire le plus efficace pour produire de l’ATP, mais l’exposition chronique à l’éthanol (EtOH) augmente le stress oxydatif dérivé des mitochondries, ce qui peut entraîner un dysfonctionnement mitochondrial dans les MA 8,9,10. La respiration mitochondriale mesurée à l’aide du taux de consommation d’oxygène cellulaire (OCR) peut être quantifiée à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire en temps réel. Les profils respiratoires mitochondriaux évalués en réponse à l’oligomycine (inhibiteur de l’ATP synthase), au cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP, découpleur de protons) et à la roténone/antimycine A (R/A, inhibiteurs des complexes mitochondriaux I et III, respectivement) sont utilisés pour déterminer la bioénergétique mitochondriale. L’EtOH chronique diminue la bioénergie mitochondriale dans les MA, comme en témoigne la diminution de la respiration basale mitochondriale, de la respiration liée à l’ATP, de la respiration maximale et de la capacité respiratoire de réserve10.

Les cellules ont différents niveaux de dépendance vis-à-vis des sources de carburants, telles que le pyruvate, la glutamine ou les acides gras, pour la production d’ATP. Ils ont également un niveau de flexibilité qui leur permet de changer l’utilisation du carburant pour réguler la bioénergie cellulaire. La glutaminolyse est une voie clé pour la respiration mitochondriale, en particulier lorsque le pyruvate est dérivé vers la production d’acide lactique ou lorsque les acides gras sont insuffisants. Notre étude récente a montré que l’exposition chronique à l’EtOH augmente la dépendance du matin à la glutamine et diminue la flexibilité du matin à utiliser la glutamine et d’autres sources de carburant pour la respiration mitochondriale11. Ces résultats, ainsi que les données démontrant que le traitement des cellules MH-S exposées à l’EtOH avec l’inhibiteur de l’oxydation du pyruvate UK5099 n’a pas altéré la bioénergétique mitochondriale par rapport aux cellules MH-S exposées au contrôle des milieux traitées avec UK5099, suggèrent un changement de la respiration dépendante du pyruvate vers une respiration dépendante de la glutamine dans les cellules MH-S EtOH. Cependant, ce changement est insuffisant pour répondre aux demandes bioénergétiques de la FA11. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d’évaluation de la glutamine en tant que source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les MA chroniques exposées à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire. Ce protocole a été créé et optimisé pour un format de 96 puits (11,04 mm2 surface) et doit être ajusté pour des puits de culture cellulaire de plus grande taille. La dépendance à la glutamine pour la bioénergétique mitochondriale est déterminée à l’aide du sulfure d’éthyle bis-2-(5-phénylacétamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES, inhibiteur de la glutaminase 1) pour inhiber sélectivement la conversion enzymatique de la glutamine en glutamate. Les données présentées dans cette étude sont des réplicats biologiques supplémentaires pour les groupes expérimentaux traités par des témoins et des BPTES dans des milieux de lignée cellulaire de souris non traitées et exposées à l’EtOH, les cellules MH-S, qui sont publiées dans Crotty et al.11.

Protocole

1. Exposition chronique à l’EtOH in vitro

  1. Cultiver des cellules MH-S, une lignée cellulaire de macrophage alvéolaire de souris, dans un milieu complet contenant du RPMI-1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine, 11,9 mM de bicarbonate de sodium, 40 mg/mL de gentamicine et 50 μM de 2-mercaptoéthanol à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
  2. Traiter les cellules MH-S en culture avec ou sans EtOH (0,8 mg/mL ou 0,08 %) pendant 72 h, où l’EtOH doit être changé toutes les 24 h. Incuber les cellules MH-S traitées à l’EtOH à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié séparé contenant 0,08 % d’EtOH dans l’eau de l’incubateur.

2. Placage de cellules MH-S pour évaluer la glutamine comme source de carburant à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire

  1. S’assurer que les cellules MH-S témoins non traitées (Con) et chroniques traitées à l’EtOH sont cultivées jusqu’à une confluence d’au moins 50 % (une confluence de 70 % à 90 % est idéale) dans des flacons T-75 pour passer dans une plaque de microculture de flux extracellulaire à 96 puits. Préparez une carte de plaque pour 5 à 6 répétitions techniques par répétitions biologiques des conditions expérimentales de Con et d’EtOH et des témoins de milieux pour chacune d’entre elles afin de les comparer aux injections de BPTES (quatre groupes au total pour le biologique n = 1).
  2. Rincez les cellules avec un média ou une solution saline tamponnée au phosphate.
  3. Ajouter 6 ml de milieu contenant du sérum dans la fiole.
  4. Grattez les cellules jusqu’à ce qu’elles se détachent et que le bas de la plaque soit dégagé. La trypsine n’est pas nécessaire pour le détachement des cellules MH-S, mais peut être utile dans d’autres types de cellules.
  5. Séparez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique ou d’une pipette de 1 ml.
  6. Transférez les cellules suspendues dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-les à 200 x g pendant 6 min.
  7. Aspirez le surnageant.
  8. Ajouter 1 mL de milieu et remettre les cellules en suspension à fond.
  9. Transférez 10 μL dans un tube de microcentrifugation et ajoutez 10 μL de bleu de trypan. Bien mélanger.
  10. Transférez 10 μL du mélange cellule/bleu trypan d’un côté d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
  11. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un microscope optique ou d’un compteur de cellules.
  12. Calculez la densité cellulaire en nombre moyen de cellules vivantes par millilitre.
  13. Faites des calculs pour les dilutions nécessaires :
    Nombre de puits nécessaires x 10000-15000 cellules = nombre total de cellules nécessaires.
    Nombre de puits nécessaires x 80 μL = volume total de cellules remises en suspension nécessaires.
  14. Appliquez 80 μL de cellules dans les puits nécessaires de la plaque de microculture de flux extracellulaire à 96 puits.
  15. Laissez les puits d’angle complètement dépourvus de cellules ou de supports. Ces puits seront utilisés pour les mesures de fond.
  16. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit pour permettre aux cellules d’adhérer et de s’équilibrer dans la plaque de microculture à flux extracellulaire.
  17. Traitez les cellules MH-S dans la plaque de microculture à flux extracellulaire à 96 puits pendant 72 h à l’aide de l’étape 1.
  18. Au moins 4 h et jusqu’à 24 h avant d’exécuter l’expérience du bioanalyseur de flux extracellulaire, hydratez une cartouche de flux extracellulaire à 96 puits.
    1. Retirez la partie supérieure du flux pak extracellulaire et placez la partie sondée du flux pak face vers le haut sur le banc. Appliquez 200 μL de solution d’étalonnage de flux extracellulaire dans chaque puits de la partie inférieure de la cartouche de flux extracellulaire.
    2. Assemblez les sections et enveloppez la cartouche de flux extracellulaire dans du parafilm. Placez-le dans un incubateur humidifié à 37 °C sans CO2 ou un bain de billes à 37 °C.
  19. Allumez l’ordinateur contenant le modèle de test et ouvrez le logiciel de fonctionnement/d’analyse attaché à l’instrument de bioanalyseur de flux extracellulaire pour lui permettre de se réchauffer au moins 4 h avant d’effectuer l’expérience.

3. Utilisation d’un bioanalyseur de flux extracellulaire pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les cellules MH-S

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu général de cette procédure.

  1. Vérifiez les cellules MH-S cultivées traitées au Con- et EtOH au microscope optique et assurez-vous que les cellules sont saines et adhèrent aux puits en monocouche. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à au moins 70 % (90 % de confluence est idéal) pour effectuer le test de manière fiable.
  2. Préparez le milieu de base de flux extracellulaire avec les suppléments suivants :
    1. Aliquote 35 mL de milieu de base de flux extracellulaire dans un tube de 50 mL.
    2. Ajoutez 350 μL de 100 mM de pyruvate de sodium (concentration finale de 1 mM), 350 μL de D-glucose (concentration finale de 10 mM) et 350 μL de GlutaMAX, qui est plus stable à la conservation que la L-glutamine (concentration finale de 2 mM).
      REMARQUE : La L-glutamine fraîche peut également être utilisée à la même concentration.
    3. Réchauffez la solution à 37 °C et assurez-vous que le pH est de 7,4 ± 0,05 à 37 °C.
  3. Aspirez doucement le milieu de croissance de la plaque de microculture extracellulaire. Laissez le moins de fluide possible sans aspirer les cellules par le bas. Laver une fois avec un maximum de 50 μL de milieu de base complété par le flux extracellulaire.
  4. Ajouter 180 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire dans chaque puits et incuber la plaque de microculture extracellulaire dans un incubateur humidifié à 37 °C sans CO2 pendant 30 min à 1 h pour permettre l’équilibre.
  5. Dissoudre les réactifs d’oxydation de la glutamine :
    1. Dans le tube BPTES, ajoutez 700 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 120 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : Le BPTES provoque une irritation de la peau et des yeux et peut provoquer une irritation respiratoire. Portez des gants de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
    2. Dans le tube d’oligomycine, ajouter 630 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 100 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
    3. Dans le tube FCCP, ajoutez 720 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 100 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : Le FCCP est nocif en cas d’ingestion, provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires, peut provoquer une réaction allergique cutanée et peut avoir des effets nocifs à long terme sur la vie aquatique. Portez des gants de protection, des vêtements de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
    4. Dans le tube R/A, ajoutez 540 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 50 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : La roténone est mortelle en cas d’ingestion ou d’inhalation, provoque une irritation cutanée, une irritation oculaire grave, une irritation respiratoire et est très toxique pour la vie aquatique avec des effets à long terme. Portez des gants de protection, des lunettes de protection, une protection faciale et une protection respiratoire. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée. L’antimycine A est mortelle en cas d’ingestion et est très toxique pour la vie aquatique, avec des effets à long terme. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
  6. Préparer les concentrations de travail des réactifs d’oxydation du substrat et d’essai de stress mitochondrial :
    1. Pour le BPTES, mélanger 1 500 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire avec 500 μL de solution mère de 120 mM de BPTES pour obtenir une solution de travail de 30 μM de BPTES.
    2. Pour l’oligomycine, mélangez 2 520 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire avec 480 μL d’oligomycine 100 mM pour obtenir une solution de travail d’oligomycine de 16 mM.
    3. Pour le FCCP, mélanger 2 865 μL de milieu de base complété par flux extracellulaire avec 135 μL de FCCP 100 mM pour obtenir une solution de travail FCCP de 4,5 mM.
    4. Pour la R/A, mélanger 2 700 μL de milieu de base complété par un flux extracellulaire avec 300 μL de 50 mM R/A pour obtenir une solution de travail de 5 mM R/A.
  7. Chargez les ports de la partie supérieure de la cartouche de flux pak extracellulaire avec les éléments suivants :
    1. Chargez les puits de contrôle de l’arrière-plan et du milieu avec 20 μL de milieu de base complété par le flux extracellulaire dans le port A, 22 μL d’oligomycine dans le port B, 25 μL de FCCP dans le port C et 27 μL de R/A dans le port D.
    2. Chargez les puits contenant des cellules avec 20 μL de contrôle de milieu ou BPTES dans l’orifice A (concentration finale de 3 μM pour le BPTES), 22 μL d’oligomycine dans l’orifice B (concentration finale de 2 μM pour l’oligomycine), 25 μL de FCCP dans l’orifice C (concentration finale de 0,5 μM pour le FCCP) et 27 μL de R/A (concentration finale de 0,5 μM pour R/A) dans l’orifice D.
  8. Réaliser l’expérience du bioanalyseur de flux extracellulaire à l’aide du logiciel informatique de conception et d’analyse du dosage qui est attaché à l’instrument en utilisant la stratégie de synchronisation et d’injection suivante :
    1. Pour l’injection avec l’orifice A pour BPTES, réglez le nombre de mesures à 6. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    2. Pour l’injection avec l’orifice B pour l’oligomycine, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    3. Pour l’injection avec l’orifice C pour FCCP, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mélange sur 3 min, avec un temps d’attente de 6 min et un temps de mesure de 3 min.
    4. Pour l’injection avec l’orifice D pour R/A, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    5. Examinez tous les décors d’arrière-plan, de contrôle des médias et de puits de groupe expérimentaux. Enregistrez et exécutez le test. Tout d’abord, chargez le flux extracellulaire avec des injections A-D. L’étalonnage aura lieu jusqu’à ce que la plaque de cellule soit prête à être chargée.
    6. Retirez la plaque cellulaire immédiatement à la fin du test. Enregistrez les résultats pour les analyser ultérieurement sur un autre appareil.
    7. Vérifiez si les cellules sont toujours respectées à l’aide d’un microscope optique. Laver 1x avec une solution saline tamponnée au phosphate et lyser les cellules avec un tampon de lyse cellulaire préféré. Conserver à -80 °C ou doser immédiatement la concentration en protéines.

4. Analyse des résultats pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les cellules MH-S

  1. Extraire les protéines des cellules de chaque puits pour normaliser les données de taux de consommation d’oxygène (OCR) en protéines :
    1. Calculer la concentration (nanogrammes/microlitre [ng/μL]) de protéines par puits.
    2. Calculer la concentration moyenne en protéines (ng/μL) pour l’ensemble de la plaque de microculture de flux extracellulaire.
    3. Divisez la concentration en protéines de chaque puits par la concentration moyenne en protéines de la plaque pour obtenir un facteur de normalisation.
    4. Appliquer le facteur de normalisation au fichier de données d’intérêt à l’aide du logiciel de conception et d’analyse des essais.
  2. Assurez-vous que les valeurs OCR de tous les puits d’arrière-plan sont proches de 0.
  3. Désélectionnez tous les puits de cellule où l’OCR est < 10 au départ. Les données ne seront pas supprimées, mais les puits en surbrillance apparaîtront dans le fichier de données exporté.
  4. Exporter les données du logiciel pour la conception et l’analyse des tests dans un tableur informatique.
  5. Ouvrez le fichier dans le tableur de l’ordinateur et triez toutes les données en diminuant les valeurs de l’OCR. Supprimez les puits d’arrière-plan, les puits qui ont déjà été désélectionnés (et qui n’ont pas été supprimés), les puits dont la viabilité cellulaire est faible, les puits dont la confluence cellulaire est faible, les puits dont la stratégie d’injection n’est pas complète, les puits dont la concentration en protéines est inexacte, les puits dont la RCO de base est < 10 et tout autre critère prédéterminé.
  6. Triez toutes les données restantes par mesure, puis par groupe, puis par OCR.
  7. Faites la moyenne des réplications techniques de chaque azote biologique indépendamment par mesure. S’assurer qu’il y a un minimum de 18 valeurs différentes (3 valeurs initiales, 3 après milieu/BPTES, 3 après oligomycine, 3 après FCCP et 6 après roténone/antimycine A) par groupe expérimental par N biologique après avoir fait la moyenne des répétitions techniques. Faites-le pour chaque azote biologique séparément afin que l’écart-type ou l’erreur-type de la moyenne puisse être calculé ultérieurement pour les données analysées.
  8. Copiez toutes les valeurs moyennes dans une nouvelle feuille de calcul, séparées par groupe expérimental.
  9. Faites la moyenne des valeurs OCR par stratégie d’injection dans chaque groupe expérimental.
  10. Calculer les paramètres de la bioénergétique mitochondriale en fonction de la consommation d’oxygène :
    1. Calculer Respiration basale :
      1. Calculez la respiration mitochondriale basale comme suit :
        Respiration mitochondriale basale (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #3 - Temps #1])
        REMARQUE : La respiration basale doit être similaire entre les groupes de contrôle des milieux et de BPTES, car c’est avant l’injection de l’inhibiteur.
      2. Calculez la respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #9 - Temps #4])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine doit être inférieure à la respiration mitochondriale basale à moins que les cellules ne soient pas fortement dépendantes de la glutamine.
      3. Calculez la respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Temps #9 - Temps #4])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale basale totale ne doit pas être soustraite de la respiration mitochondriale basale, et elle ne doit pas dépendre de la glutamine puisque celles-ci sont calculées à des points temporels différents.
    2. Calculez la respiration liée à l’ATP comme suit :
      1. Calculez la respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les combustibles comme suit :
        Respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les carburants (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #10, 11, 12] x [Temps #12 - Temps #10])
        REMARQUE : L’OCR moyen pour les mesures #10, 11 et 12 devrait être similaire entre le groupe témoin du milieu et le groupe BPTES, car l’oligomycine devrait inhiber fortement l’ATP synthase, et l’inhibition d’une voie de carburant ne devrait pas modifier la respiration totale liée à l’ATP.
      2. Calculez la respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mesures OCR AVG #10, 11, 12] x [Temps #12 - Temps #10])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale liée à l’ATP qui ne dépend pas de la glutamine doit être inférieure à la respiration mitochondriale liée à l’ATP, à moins que les cellules ne soient pas fortement dépendantes de la glutamine.
      3. Calculez la respiration mitochondriale liée à l’ATP dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale liée à l’ATP dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = Respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les combustibles - Respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine
    3. Calculez la respiration maximale comme suit :
      1. Calculez la respiration mitochondriale maximale totale comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale totale (pmol O2 consommée) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #15 - Temps #13])
      2. Calculez la respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 des groupes BPTES - Mesures OCR AVG #16, 17, 18 des groupes BPTES] x [Temps #15 - #Time 13])
      3. Calculez la respiration mitochondriale maximale dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = Respiration mitochondriale maximale totale de tous les combustibles - Respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine
        REMARQUE : Ce calcul peut être utilisé pour déterminer la dépendance cellulaire de la capacité de réserve de glutamine par rapport à d’autres combustibles. Plus la respiration mitochondriale maximale est grande, plus la dépendance à la glutamine est grande, ce qui peut être exprimé en groupes BPTES - groupes témoins pour montrer une perte de la respiration mitochondriale maximale ou en pourcentage de la respiration totale.
    4. Calculez la capacité respiratoire de réserve comme suit :
      1. Calculez la capacité respiratoire totale de réserve comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve totale (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 - Mesures OCR AVG #1, 2, 3] x [Temps #15 - Temps #13])
      2. Calculez la capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 des groupes BPTES - Mesures OCR AVG #1, 2, 3 des groupes BPTES] x [Temps #15 - Temps #13])
      3. Calculez la capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine (pmol O2 consommée) = Capacité respiratoire de réserve totale de tous les combustibles - Capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine
        REMARQUE : Ce calcul représente la flexibilité des cellules dépendantes de la glutamine et si elles peuvent obtenir une plus grande respiration sans glutamine en cas de besoin.
  11. Soustraire les témoins de milieux par groupes d’inhibiteurs et normaliser la consommation de pmol O2 par rapport au groupe témoin si vous le souhaitez.
  12. Créez des graphiques des profils bioénergétiques OCR (pmol O2/min), de la respiration basale (pmol O2), de la respiration liée à l’ATP (pmol O2), de la respiration maximale (pmol O2) et de la capacité respiratoire de réserve (pmol O2) dépendante de la glutamine.
  13. Représenter les valeurs des paramètres bioénergétiques mitochondriaux dans des graphiques à barres ou les exprimer comme moyennes des groupes inhibiteurs par rapport aux groupes témoins dans les milieux. Si chaque N biologique est calculé séparément, calculez l’écart-type ou l’erreur-type de la moyenne des données analysées pour tous les N biologiques.

5. Analyse statistique

  1. Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.
  2. Pour les points linéaires des profils bioénergétiques OCR, effectuez une ANOVA à deux facteurs suivie des analyses post hoc de Tukey pour comparer les données de ces quatre groupes expérimentaux avec deux facteurs (stratégie de traitement et d’injection) : Con + milieux, Con + BPTES, EtOH + milieu et EtOH + BPTES.
  3. Pour les graphiques à barres de la respiration basale, de la respiration liée à l’ATP, de la respiration maximale et de la capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine, effectuez des analyses du test t de Student pour comparer les données de deux groupes expérimentaux, Con + BPTES et EtOH + BPTES.
  4. Présentez les données sous forme de moyennes ±erreur type de la moyenne (MEB). Considérons p < 0,05 comme statistiquement significatif.

Résultats

L’exposition chronique à l’EtOH diminue la dépendance à la glutamine dans les cellules MH-S.
La glutaminolyse est une voie critique pour la respiration mitochondriale, soutenant la glutamine en tant que source de carburant importante pour la bioénergétique cellulaire. Pour déterminer si l’exposition chronique à l’EtOH modifie la dépendance des cellules MH-S à la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale, les cellules MH-S ont été traitées sans contrôle EtOH (Con) ou EtOH, et l’OCR a été mesurée au fil du temps en réponse à des injections en série de réactifs associés à la respiration mitochondriale. Les profils bioénergétiques OCR en réponse à des injections en série d’oligomycine (inhibiteur de l’ATP synthase), de FCCP (découpleur de protons) et de R/A (inhibiteurs du complexe mitochondrial I et du complexe III, respectivement) sont utilisés pour calculer d’autres paramètres de la bioénergétique mitochondriale, tels que la respiration liée à l’ATP, la respiration maximale et la capacité respiratoire de réserve. Toutes les données présentées sont des réplicats biologiques supplémentaires de milieux Con +, Con + BPTES et EtOH + milieux, EtOH + BPTES MH-S qui ont été publiés dans Crotty et al.11. Comme le montre la figure 2A, l’oligomycine a diminué l’OCR en raison de l’inhibition du complexe V, le FCCP a augmenté l’OCR en raison du découplage mitochondrial du potentiel membranaire et de la génération d’ATP dépendante des mitochondries12, et la R/A a efficacement arrêté l’OCR dépendant des mitochondries. Ces profils de réponses bioénergétiques OCR aux injections en série sont cohérents avec le guide de l’utilisateur pour l’évaluation du stress mitochondrial à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire13,14.

Après la mesure de l’OCR basale dans les cellules MH-S traitées par Con- et EtOH, une injection de contrôle des milieux ou BPTES, un inhibiteur de la glutaminase 1, a été mise en charge. Les cellules Con + milieu par rapport aux cellules Con + BPTES MH-S et EtOH + milieu par rapport aux cellules EtOH + BPTES MH-S n’ont pas montré de différences dans les profils bioénergétiques OCR (Figure 2A). Les cellules MH-S EtOH + BPTES ont montré une diminution de la respiration basale dépendante de la glutamine par rapport à Con + BPTES (mesure #4 comparée à la mesure #3 dans les figures 2A et 2B), suggérant que l’EtOH diminue l’oxydation basale de la glutamine des cellules MH-S contribuant à la respiration mitochondriale. Les cellules MH-S EtOH + BPTES ont montré une perte de respiration mitochondriale liée à la glutamine-dépendante de l’ATP par rapport à Con + BPTES (Figure 2C). Bien que les cellules MH-S EtOH + BPTES aient montré une perte émoussée de la respiration maximale dépendante de la glutamine par rapport à Con + BPTES (Figure 2D), les cellules MH-S EtOH + BPTES ont montré une diminution de la capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine par rapport à Con + BPTES (Figure 2E). Ces résultats suggèrent que les cellules EtOH MH-S ont la capacité d’être plus dépendantes de la glutamine pour la respiration, comme lorsqu’elles sont stressées par le FCCP, mais qu’elles peuvent être incapables de le faire en raison d’une augmentation de la demande de glutamine compensée par une diminution de la biodisponibilité de la glutamine.

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Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail pour mesurer la respiration mitochondriale dépendante de la glutamine et la bioénergétique dans les cellules MH-S, une lignée cellulaire de macrophages alvéolaires de souris. Des monocouches de cellules MH-S cultivées dans des puits de microculture de flux extracellulaire (étape 3.1) ont été incubées avec un milieu de base de flux extracellulaire avec des suppléments ajoutés (étape 3.2) à 37 °C dans un incubateur humidifié sans CO2 pendant 30 min-1 h (étape 3.4). Le milieu de base de flux extracellulaire avec des suppléments ajoutés (étape 3.2) a été utilisé comme milieu de contrôle et pour diluer les concentrations de travail de l’inhibiteur de l’oxydation de la glutamine BPTES à la concentration finale de 3 μM, de l’inhibiteur du complexe mitochondrial V oligomycine (Oligo) à une concentration finale de 0,5 μM, du découpleur mitochondrial carbonyle cyanure-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) à une concentration finale de 0,5 μM, et des inhibiteurs du complexe mitochondrial I et du complexe III roténone/antimycine A (R/A) à 0,5 μM concentration finale pour les orifices de chargement A-D dans la cartouche supérieure de flux extracellulaire (étape 3.7). La stratégie d’injection pour les temps de mélange, d’attente et de mesure pour l’expérience à l’aide du bioanalyseur de flux extracellulaire était la suivante : 3 min de temps de mélange, 0 min de temps d’attente et 6 mesures de 3 min de temps de mesure pour le port A (contrôle du milieu ou BPTES) ; 3 min de temps de mixage, 0 min de temps d’attente, et 3 mesures de 3 min de temps de mesure pour le port B (Oligo) ; Temps de mélange de 3 min, temps d’attente de 6 min et 3 mesures de temps de mesure de 3 min pour le port C (FCCP) ; et 3 min de temps de mixage, 0 min de temps d’attente, et 3 mesures de 3 min de temps de mesure pour le port D (R/A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : L’éthanol chronique (EtOH) diminue la respiration mitochondriale dépendante de la glutamine dans les cellules MH-S, une lignée cellulaire de macrophages alvéolaires de souris. Les cellules MH-S n’ont pas été traitées (Con) ou ont été traitées avec de l’EtOH (0,08 %, 72 h), et le taux de consommation d’oxygène (OCR) au fil du temps a été mesuré à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire avant et après l’injection avec un contrôle de milieu ou d’un inhibiteur de l’oxydation de la glutamine (GLN) (3 μM de BPTES), suivi d’injections en série d’inhibiteur du complexe mitochondrial V (0,5 μM d’oligomycine, Oligo), découpleur mitochondrial (0,5 μM de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone, FCCP) et inhibiteurs du complexe mitochondrial I et du complexe III (0,5 μM de roténone/0,5 μM d’antimycine A, R/A). (A) Les profils bioénergétiques OCR ont été utilisés pour calculer la respiration basale dépendante de la glutamine (B), (C) la respiration liée à l’ATP, (D) la respiration maximale et (E) la capacité respiratoire de réserve. Les points linéaires représentent les moyennes ± SEM (n = 4, #p < 0,05 contre Con + media et *p < 0,05 contre Con + BPTES, ANOVA à un facteur avec post hoc de Tukey). Les barres représentent les moyennes ± MEB (n = 4, *p < 0,05 par rapport à Con + BPTES, test t de Student). Les données présentées sont des répétitions biologiques supplémentaires pour les groupes expérimentaux de cellules MH-S témoins non traitées et traitées par BPTES de cellules MH-S exposées à l’EtOH non traitées, qui sont publiées dans Crotty et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les données présentées dans le présent document sont des réplicats biologiques supplémentaires pour les cellules MH-S exposées à l’EtOH non traitées et chroniques traitées avec un contrôle en milieu ou BPTES, qui sont publiées dans Crotty et al.11. Le protocole décrit est utilisé pour évaluer la dépendance des cellules MH-S exposées à l’EtOH à la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergétique à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire. Le protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, la formation et la confluence des cellules MH-S sont importantes. Les cellules MH-S sont initialement cultivées dans des puits de microculture à flux extracellulaire à faible confluence et utilisées lorsque les cellules sont dans une monocouche à une confluence finale de 90 %. Étant donné que l’exposition à l’EtOH des cellules MH-S a duré 72 h, la confluence finale de 90 % a été atteinte avant l’essai sur le bioanalyseur de flux extracellulaire. Ceci est cohérent avec d’autres rapports sur la formation de monocouches cellulaires et une confluence de 90 % à 100 % avant l’exécution de ces expériences 15,16,17. Deuxièmement, la normalisation des valeurs de la respiration mitochondriale en protéines dans chaque échantillon est essentielle. Certaines études normalisent la bioénergétique mitochondriale au nombre de cellules18, 19, 20. Cependant, la stratégie d’injection en série dans ce test est destinée à stresser séquentiellement les mitochondries. Dans les cellules qui dépendent principalement de la phosphorylation oxydative, telles que les MA, cela peut conduire à la mort cellulaire pendant l’expérience sur le bioanalyseur de flux extracellulaire. Par conséquent, le nombre de cellules peut ne pas être cohérent du début de l’expérience à la fin de l’expérience, et la normalisation des valeurs de la respiration mitochondriale en protéines est optimale21,22. Un facteur de normalisation des protéines utilisant une protéine moyenne dans tous les puits est suggéré ici afin de rapporter des profils OCR plus précis spécifiques aux cellules. Troisièmement, l’analyse des résultats sur les réplicats biologiques est essentielle. Parfois, des images représentatives des profils bioénergétiques mitochondriaux sont présentées22,23 plutôt que la respiration mitochondriale moyenne à travers plusieurs réplicats biologiques 10,11,24. Cependant, ces images représentatives ne fournissent pas une image complète des variations entre les expériences. En calculant chaque réplication biologique séparément, l’erreur-type de la moyenne peut montrer la variation des valeurs moyennes de la respiration mitochondriale entre toutes les répétitions biologiques et être utilisée pour calculer les différences statistiques entre les profils bioénergétiques mitochondriaux.

Avant d’exécuter le test sur le bioanalyseur de flux extracellulaire, il fallait déterminer la densité cellulaire optimale des cellules MH-S pour la culture dans la plaque de microculture de flux extracellulaire afin d’obtenir une monocouche de cellules dans chaque puits. Étant donné qu’il fallait également établir les concentrations appropriées d’Oligo et de FCCP pour les cellules MH-S, des tests de différentes densités de cellules MH-S avec des dilutions en série d’Oligo et de FCCP ont été effectués21,25. La culture initiale de 10 000 à 15 000 cellules MH-S a permis d’obtenir une monocouche de cellules à 90 % de confluence après 72 h d’exposition avec et sans EtOH10. Sur la base de ces expériences d’optimisation, il a été déterminé que 2 μM d’Oligo et 0,5 μM de FCCP étaient les concentrations minimales de ces réactifs qui ont provoqué des altérations de la respiration mitochondriale10.

Des mesures en temps réel de la respiration mitochondriale au départ et après le traitement par BPTES, un inhibiteur de la glutaminase 1, qui empêche la conversion enzymatique de la glutamine en glutamate, sont utilisées pour déterminer la dépendance à la glutamine pour la respiration basale dans les cellules MH-S exposées à Con- et EtOH. Une limite des données présentées dans cette étude est que les rôles des acides gras à chaîne courte et moyenne comme sources de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergétique, en plus de la glutamine dans les cellules MH-S exposées à l’EtOH, n’ont pas été étudiés. Les résultats de l’étude précédente de Crotty et al.11 suggéraient que les cellules MH-S EtOH présentaient un passage de la respiration dépendante du pyruvate à la respiration dépendante de la glutamine sans compensation complète de la perte de respiration mitochondriale totale. De plus, en effectuant la même expérience avec une injection combinée de UK5099 (un inhibiteur de l’oxydation du pyruvate) et d’étomoxir (un inhibiteur de l’oxydation des acides gras à longue chaîne), la contribution de la glutamine en l’absence de pyruvate et d’acides gras comme sources de carburant pour la respiration mitochondriale a pu être déterminée dans les cellules MH-S exposées à l’EtOH.

La respiration mitochondriale a été mesurée à l’aide d’une électrode Clark pendant près de soixante-dix ans26, et il existe également des tests de fluorescence sur plaque pour mesurer la respiration mitochondriale27. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup plus de temps et/ou n’ont pas la sensibilité des mesures qui peuvent être obtenues avec un bioanalyseur de flux extracellulaire. L’avantage d’utiliser un bioanalyseur de flux extracellulaire pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergétique est que des expériences avec plusieurs réplicats biologiques peuvent être menées en même temps. De plus, le bioanalyseur de flux extracellulaire permet d’expérimenter sur des mitochondries isolées ou des cellules intactes. Pour les cellules qui n’ont pas une forte concentration de mitochondries, telles que les cellules musculaires lisses de l’artère pulmonaire, il est difficile d’isoler suffisamment de mitochondries à partir d’échantillons limités. À l’aide du bioanalyseur de flux extracellulaire, la respiration mitochondriale peut être mesurée dans les cellules musculaires lisses intactes de l’artère pulmonaire28 ou les MA primaires de souris10,11. Le protocole utilisé dans cette étude pourrait être utilisé pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergétique d’autres échantillons de taille limitée, tels que les MA humains primaires. Nous avons précédemment montré que le stress oxydatif et les dérangements dérivés des mitochondries induits par l’EtOH dans les cellules MH-S présentent un profil similaire de dysrégulation mitochondriale dans les MA primaires de souris et les MA humains 6,7,11,28,29,30. Collectivement, les études soutiennent l’utilisation de cette méthode pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergie dans les MA dans des conditions pathologiques caractérisées par un stress oxydatif dérivé des mitochondries.

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier pertinent à signaler.

Remerciements

Nous reconnaissons les contributions de Sarah S. Chang, BS, pour la culture cellulaire initiale et la préparation des cellules MH-S pour l’expérimentation. Ce travail a été soutenu par NIAAA R01-AA026086 à SMY (ORCID : 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 à KMC et NIGMS T32-GM008602 à Randy Hall, Département de pharmacologie et de biologie chimique, Université Emory. Le contenu de ce rapport ne représente pas les opinions du ministère des Anciens combattants ou du gouvernement américain.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 ml  ;VWR International, Inc.21008-670Utilisé pour préparer les concentrations mères de réactifs liés aux mitochondries.
2-mercaptoéthanol  ;Sigma Aldrich Co.M6250Utilisé pour la culture des cellules MH-S.
Grattoir cellulaireDot Scientific, Inc.70-1180Utilisé pour racler les cellules MH-S des flacons T-75.
Countess 3 FL Instrument : compteur de cellulesFisher Scientific CompanyAMQAF2000Utilisé pour compter le nombre de cellules MH-S à plaquer pour les expériences.
D-glucose  ;Sigma Aldrich Co.G8270Utilisé pour le milieu de base de flux extracellulaire.
EthanolFisher Scientific Company4355720Traitement expérimental des cellules MH-S.
Sérum fœtal bovinSciencell Research Laboratories500Utilisé pour la culture de cellules MH-S.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Utilisé pour la culture des cellules MH-S.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Utilisé pour le milieu de base de flux extracellulaire.
GraphPad Prism 10.2.3Logiciel GraphPadN/ALogiciel pour l’analyse statistique. Téléchargeable après achat chez https://www.graphpad.com/features.
Cellules MH-SCollection de cultures de type américainCRL-2019Lignée cellulaire de macrophages alvéolaires de souris.
Tube de microcentrifugation  ;États-Unis Scientific, Inc.4036-3212Utilisé pour la préparation des concentrations de travail de réactifs liés aux mitochondries.
Microsoft 365 Excel : tableur informatiqueMicrosoftN/ALogiciel pour l’organisation des données et les calculs bioénergétiques mitochondriaux. Téléchargeable après achat chez https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Pénicilline/streptomycineFisher Scientific Company15140122Utilisé pour la culture de cellules MH-S.
Saline tamponnée au phosphateVWR International, Inc.45000-446Utilisé pour le lavage des cellules MH-S.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Utilisé pour la culture de cellules MH-S.
Seahorse Wave Pro Software : logiciel informatique pour la conception et l’analyse d’analysesAgilent Technologies, Inc.N/AL’ordinateur est connecté à l’instrument Seahorse XF Pro Analyzer. Téléchargeable sur  ; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium : milieu de base de flux extracellulaire, pH 7,4Agilent Technologies, Inc.103334-100Utilisé pour préparer les concentrations mères et de travail de réactifs liés aux mitochondries et pour cultiver des cellules MH-S avant les essais expérimentaux.
Kit de test de stress d’oxydation de la glutamine Seahorse XFAgilent Technologies, Inc.103674-100Contient du BPTES de base, de l’oligomycine, du FCCP et de la roténone/antimycine A.
Seahorse XF Pro Analyzer : bio-analyseur de flux extracellulaireAgilent Technologies, Inc.N/ABioanalyseur de flux extracellulaire.
Seahorse XFe96 FluxPak : cartouches de flux pak extracellulaire à 96 puits, plaques de microculture à flux extracellulaire à 96 puits et solution d’étalonnageAgilent Technologies, Inc.102416-100Utilisé pour préparer les cellules MH-S pour les dosages à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire.
Pipette sérologique  ;Biotechnologie Santa Cruz, Inc.sc-550678Utilisé pour retirer les supports des cellules MH-S.
Bicarbonatede sodium Sigma Aldrich Co.S6014Utilisé pour la culture de cellules MH-S.
Pyruvate de sodium  ;Sigma Aldrich Co.P4562Utilisé pour le milieu de base de flux extracellulaire.
Fioles T-75 SantaCruz Biotechnology, Inc.sc-200263Utilisé pour la culture de cellules MH-S.

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