Article de méthode

Tests d’immunofluorescence multiplex automatisés à haut débit pour la recherche translationnelle

DOI :

10.3791/67584

⸱

10 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce rapport décrit un protocole automatisé pour les tests d’immunofluorescence multiplex (mIF) sur un colorateur de lames automatisé. Il démontre la haute reproductibilité de la protéomique spatiale sur des autocolorateurs tissulaires standard à haut débit et des imageurs de fluorescence sur lames entières, ce qui est idéal pour les tests mIF personnalisés sur un grand nombre de lames de tissus dans la recherche translationnelle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’immunofluorescence multiplex (mIF) est une technique avancée qui permet une analyse détaillée et spatialement résolue d’échantillons de tissus en visualisant plusieurs biomarqueurs protéiques dans une seule section. Cependant, la plupart des technologies mIF sont confrontées à des compromis importants entre la sensibilité et le débit lors du multiplexage, ce qui pose une limitation critique pour la détection robuste de biomarqueurs de faible abondance dans plusieurs sections de tissus. Une nouvelle approche pour mIF utilise des codes-barres d’ADN uniques liés à des anticorps, qui sont amplifiés par un mécanisme d’amplification parallèle d’une seule molécule. Cette méthode permet d’obtenir une qualité de coloration très comparable à celle de l’immunohistochimie (IHC) de qualité clinique tout en offrant des capacités de multiplexage élevées et une imagerie à haut débit de lames entières. Ce test consiste à amplifier un cocktail d’anticorps à code-barres d’ADN sur le tissu, suivi de séries séquentielles d’étapes de détection pour visualiser quatre oligonucléotides marqués par fluorescence par cycle. Ce procédé permet ainsi de détecter huit biomarqueurs ou plus par échantillon de tissu. Les étapes clés de cette méthode comprennent la préparation automatisée des tissus, l’application d’anticorps primaires conjugués à des codes-barres d’ADN, l’amplification du signal et les cycles itératifs de détection, d’imagerie et de suppression du signal. L’acquisition d’images est suivie d’un recalage d’images et d’une analyse de cellules uniques à l’aide d’une plateforme de science des données d’images spatiales améliorée par l’IA. Pour cette étude, le protocole a été appliqué à des microréseaux multi-tissus (TMA) fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), y compris les noyaux d’amygdales, de mélanomes, de côlons et de ganglions lymphatiques en trois exemplaires. Les technologies avancées mIF fournissent plus d’informations sur la réponse tumorale, le microenvironnement tumoral et le paysage immunitaire. En surmontant les compromis inhérents entre la sensibilité, les capacités de multiplexage et le débit d’imagerie, les chercheurs peuvent désormais viser à comprendre l’hétérogénéité des signatures moléculaires difficiles et des biomarqueurs des réponses thérapeutiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’immunofluorescence hautement multiplexée (mIF) est une technique avancée qui révolutionne le domaine de l’analyse tissulaire en permettant la visualisation simultanée de plusieurs biomarqueurs protéiques au sein d’une seule section de tissu 1,2. Cette capacité offre un niveau de détail et une résolution spatiale inégalés, ce qui est souvent crucial pour comprendre les interactions entre les types de cellules ayant des morphologies complexes au sein du microenvironnement tissulaire à plusieurs échelles spatiales3. La technique est particulièrement précieuse dans la recherche en oncologie, où elle peut être utilisée pour co-localiser les biomarqueurs tumoraux, les cibles protéiques médicamenteuses, l’état immunitaire local et les points de contrôle, les interactions entre différents types de cellules et même les modèles de colocalisation subcellulaire liés au métabolisme des médicaments dans le tissu 4,5,6.

Malgré son potentiel, la plupart des technologies mIF sont encore confrontées à des défis importants, notamment en ce qui concerne l’équilibre entre sensibilité et débit et capacités de multiplexage. Cette limitation est particulièrement critique pour la détection de biomarqueurs cliniques qui peuvent montrer une très faible expression, tels que HER2 et-L1 7,8,9. Pour comprendre pourquoi, il est essentiel de comprendre d’autres modalités de mIF. Ces méthodes traditionnelles ont ouvert la voie à des plates-formes mIF plus sophistiquées, mais elles présentent leurs propres avantages et limites.

L’immunofluorescence directe (DIF) utilise des anticorps directement conjugués à des fluorophores, ou à un oligonucléotide capable de recruter des fluorophores10. Cette méthode est simple à multiplexer, mais souffre d’une sensibilité plus faible et d’une difficulté à résoudre le signal provenant du fond tissulaire ou des artefacts de coloration.

L’immunofluorescence indirecte (IIF) utilise un anticorps secondaire qui se lie à l’anticorps primaire. Cela a permis d’augmenter le signal par rapport au DIF primaire. Lorsqu’il est combiné à des conceptions améliorées de cellules à flux, l’IIF séquentiel peut détecter jusqu’à 40 biomarqueurs en un seul test 2,11. Cependant, ceux-ci souffrent toujours d’un manque relatif de sensibilité par rapport aux stratégies enzymatiques d’amplification du signal, telles que celles trouvées dans les techniques d’immunohistochimie (IHC).

L’immunofluorescence basée sur la catalyse enzymatique est le plus souvent observée dans les méthodes IHC utilisant la peroxydase de raifort (HRP) pour le dépôt de colorants chromogènes (DAB) ou fluorescents (par exemple, l’amplification du signal tyramide (TSA)). Comme ces tests sont basés sur la même enzyme catalytique, leur sensibilité de détection est similaire, ce qui rend les tests mIF multispectraux basés sur TSA adaptés aux applications cliniques 2,12. L’avantage de l’amplification du signal basée sur l’ADN est le haut degré de multiplexage possible tout en conservant une excellente amplification du signal et une modularité. En revanche, les méthodes basées sur la HRP sont moins modulaires et difficiles à optimiser, ce qui nécessite des cycles supplémentaires de développement et de test de panels.

Immunofluorescence d’anticorps à code-barres d’ADN
Le test mIF démontré ici utilise une ADN polymérase pour amplifier simultanément les anticorps à code-barres de l’ADN, suivis de cycles de coloration et de décoloration de la sonde rapporteure à l’aide de quatre oligonucléotides fluorescents par cycle d’imagerie (Figure 1).

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Figure 1 : Illustration graphique du protocole de test d’immunofluorescence multiplex. Les anticorps conjugués aux codes-barres sont ajoutés en une seule étape, et les codes-barres sont amplifiés simultanément. Des groupes de quatre sondes fluorescentes sont ajoutés dans chaque cycle, ce qui permet de visualiser quatre marqueurs à la fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’ajout d’anticorps à un tour et l’amplification en une seule étape simplifient considérablement le protocole de test. Le processus est facilité par des systèmes automatisés de coloration et de balayage à haut débit, qui garantissent des résultats reproductibles d’une lame à l’autre et d’un lot à l’autre sur un grand nombre d’échantillons utilisés dans les études cliniques13.

L’un des principaux avantages de cette technologie est sa capacité à maintenir une sensibilité élevée tout en permettant un multiplexage étendu2. Le flux de travail garantit également que le débit d’imagerie reste élevé, répondant ainsi à l’une des principales limites des technologies mIF hautement multiplexées (par exemple, > 8 biomarqueurs) pour les études cliniques. Ceci est particulièrement important dans la recherche clinique, où des variations subtiles dans les cibles médicamenteuses de faible abondance (par exemple, un faible HER2) entre les patients peuvent fournir des informations essentielles sur la réponse thérapeutique.

En plus de ces attributs clés, ce test offre également une configurabilité de panel, des capacités d’imagerie à haut débit de lames entières et la résolution optique nécessaire pour étudier les processus et les compartiments subcellulaires, ainsi que les protubérances cellulaires associées aux macrophages et aux cellules dendritiques. La capacité d’étudier des phénotypes cellulaires complexes à plusieurs échelles spatiales est un avantage essentiel de l’imagerie optique par rapport aux méthodes basées sur la cytométrie de masse (IMC)2.

Dans ce travail, un protocole pour un test mIF 8-plex est présenté à l’aide d’un autocolorant et d’un scanner de lames entières. Ce test comprend un panel de huit anticorps primaires : CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3,-1,-L1 et pan-cytokératine14. Ce panel de marqueurs permettra l’immunoprofilage du tissu tumoral et l’identification des cellules présentes dans l’environnement de la tumeur ou du stroma. Ce protocole utilise un colorateur de lames automatisé pour les premières séries de coloration et d’échange de sonde, et la coloration et l’imagerie peuvent être terminées en 2 jours. Les méthodes de validation d’un test mIF et d’analyse des images résultantes sont également présentées.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences doivent suivre les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur l’être humain de l’établissement. Toutes les coupes de tissus utilisées dans ce protocole ont été obtenues auprès d’un fournisseur de tissus externe.

1. Préparation de l’échantillon de tissu

  1. Sélectionnez le bloc tissulaire FFPE à colorer à l’aide du test mIF. Si vous utilisez des lames de tissu FFPE, assurez-vous que les échantillons ont une épaisseur comprise entre 3 et 5 μm, qu’ils sont montés sur des lames de verre chargées positivement et qu’ils sont exempts de plis ou d’autres déchirures qui pourraient avoir un impact négatif sur les résultats finaux.
    REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, évitez de colorer des échantillons de tissus qui ont été sectionnés plus de 2 mois auparavant. De plus, évitez les blocs qui ont été stockés pendant plus de 10 ans ou qui semblent visuellement secs.
  2. Si vous travaillez avec des blocs de tissu FFPE, utilisez un microtome pour couper le nombre requis de lames de tissu à une épaisseur de 4 μm, en montant les lames sur une lame de verre chargée positivement. Pour obtenir les résultats les plus cohérents, montez toutes les diapositives dans la même orientation. Assurez-vous que le tissu est exempt de rides et de déchirures.
  3. Si les échantillons ne doivent pas être colorés immédiatement, conservez-les dans une boîte à lames sous azote jusqu’à 2 mois.

2. Enregistrement des réactifs auxiliaires et de l’anticorps primaire pour la mise en place initiale

  1. Dans le logiciel d’autostainer, accédez à l’onglet Configuration du réactif en haut de l’écran. Cliquez sur Ajouter pour ajouter de nouveaux réactifs.
  2. Les tests de coloration et d’échange utiliseront neuf contenants de réactifs, conformément aux informations trouvées dans le tableau 1. Pour les utiliser, par exemple, pour le premier réactif nommé Wash Buffer, avec le nom abrégé ISPWsh1, suivez les étapes. Sélectionnez le type comme Auxiliaire et vérifiez que *BWash et DI sont répertoriés sous Blocs compatibles. Cochez la case Préféré avant d’enregistrer.
  3. Répétez ce processus pour les réactifs auxiliaires restants, en utilisant les noms et les noms abrégés indiqués au tableau 1.
    1. Le réactif de solution d’amplification (ULTAmp1) n’est pas compatible avec le Bond Wash. Dans la fenêtre de configuration du réactif, veuillez sélectionner *BWash et cliquer sur le bouton << pour déplacer ce réactif de la liste des réactifs compatibles vers la section des réactifs disponibles. Le fait de ne pas éliminer le Bond Wash en tant que réactif compatible avec le réactif de la solution d’amplification peut entraîner une réduction significative des performances de coloration du dosage.
  4. Une fois que tous les contenants de réactifs sont enregistrés, créez un kit de détection de recherche avant de commencer l’exécution initiale. Le kit de détection aura besoin d’un récipient de titrage de 30 ml.
  5. Ajouter le récipient de titrage de 30 mL au kit de détection. Pour éviter que les deux ne soient séparés, collez le récipient de titrage sur la baguette.
  6. Scannez le code-barres sur le côté gauche du kit de détection. Dans la fenêtre contextuelle suivante, nommez le kit de détection (par exemple, InSituPlex Kit). Fixez la date d’expiration à 10 ans à compter de la date d’enregistrement.
    REMARQUE : La date d’expiration définie ici n’est pas la date indiquée sur le réactif, mais est la date d’expiration du réactif dans le récipient de titrage. Le fait de définir la date d’expiration loin dans le futur garantit que le kit n’expirera pas inutilement.
  7. Pour la première position de réactif du kit, sélectionnez Tampon de lavage comme réactif dans le menu déroulant.
  8. Cliquez sur le champ du code-barres pour cette position de réactif et scannez le code-barres du récipient de titrage de 30 ml collé pour enregistrer ce récipient comme tampon de lavage et lier le récipient de réactif à la baguette de détection.
  9. Une fois que le récipient de titrage est lié au kit, cliquez sur le bouton Ajouter pour enregistrer et fermer la fenêtre contextuelle.
  10. Remplissez le récipient de titrage avec 30 ml de 1x Bond Wash et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C entre les cycles de coloration.

Tableau 1 : Réactifs auxiliaires pour la configuration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Configuration initiale du protocole

  1. Une fois l’enregistrement réussi de tous les conteneurs de réactifs, accédez à l’onglet Configuration du protocole en haut de l’écran du logiciel de coloration automatique.
  2. Vérifiez la version du logiciel en cours d’exécution en cliquant sur le logo en haut à droite de l’écran. La fenêtre contextuelle qui s’affiche affiche la version du logiciel actuellement installée sous l’en-tête Informations sur le logiciel.
  3. S’il s’agit de la version 7.0 ou ultérieure du logiciel, il y aura un modèle préinstallé du protocole de coloration. En bas de l’écran, vérifiez que la sélection Statut préféré est définie sur Tous. Nommez le protocole de modèle *ISP Staining Assay. Pour les versions antérieures du logiciel, le protocole se trouve dans le Tableau 2.
  4. Faites un clic droit sur le *ISP Staining Assay et copiez le protocole. Dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche, renommez le protocole Staining Assay 1 avec le nom abrégé (ISP_IHC1)
  5. Sous le système de détection préféré, sélectionnez celui qui a été créé lors de la configuration initiale du réactif à l’étape 2.6.

Tableau 2 : Protocole pour le protocole de coloration par immunofluorescence multiplex. *MARKER correspond à la solution d’anticorps et Wash Buffer correspond à la solution BOND Wash. Tous les autres réactifs auxiliaires ont des composants de kit nommés en conséquence. Ce protocole est compatible avec les versions logicielles 7.0 et supérieures, BXD 39 et supérieures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

4. Configuration du réactif

  1. Décongelez tous les réactifs du kit, à l’exception des conjugués d’anticorps, de l’enzyme d’amplification, de l’initiateur d’échange et du neutralisant d’échange à température ambiante. Stockez le reste des composants du kit à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Si ce n’est pas déjà fait, enregistrez un nouveau récipient de titrage pour chacun des réactifs définis à l’étape 2.3. Placez un nouvel insert de titrage dans chacun.
  3. Prenez le système de détection de recherche enregistré à l’étape 2.6 et assurez-vous que le contenant de tampon de lavage associé est rempli à 30 ml avec 1x la solution de lavage Bond. Placez les récipients de titrage de chaque réactif dans le système.
  4. Préparez le diluant Ab dans le récipient correspondant. Le volume requis est de 350 + (150 μL x nombre de lames) et est composé du diluant d’anticorps fourni. Vortex le tampon à mélanger après décongélation.
  5. Préparez la solution de coloration des anticorps dans la solution de coloration des anticorps 1 récipient. Ajouter tous les anticorps à une dilution de 1:100 dans le diluant d’anticorps fourni. Le volume requis est de 350 + (150 μL x nombre de lames). Ne pas vortex les stocks d’anticorps ou la solution complète de coloration des anticorps, mélanger par pipetage uniquement.
  6. Préparez le mixage de préamplification dans le récipient de mixage de préamplification. Le volume requis est de 350 + (150 μL x nombre de lames) et est composé d’un mélange de préamplification tel que fourni. Vortex cette solution après décongélation.
  7. Préparez la solution d’amplification dans le contenant de la solution d’amplification. Le volume requis est de 350 + (150 μL x nombre de lames), et il est composé d’enzyme d’amplification diluée 1:10 dans un tampon d’amplification. Ne pas vortex l’enzyme d’amplification ou la solution d’amplification complète, mélanger par pipetage uniquement.
  8. Préparez la contrecoloration nucléaire dans un récipient de contre-coloration nucléaire. Le volume requis est de 350 + (300 μL x nombre de lames) et est composé de la solution de contre-coloration nucléaire fournie diluée à 1:100 dans de l’eau ultrapure. Mélanger par vortex.
  9. Préparez le mélange de sondes fluorescentes correspondant au premier cycle d’imagerie dans le conteneur de la sonde fluorescente. Le volume requis est de 350 + (450 μL x nombre de lames), composé des sondes fluorescentes 1 solution diluée 1:20 dans le tampon de la sonde. Vortex les composants après décongélation ainsi que le mélange final complet.
  10. Une fois que tous les réactifs sont préparés et placés dans leurs récipients correspondants, placez la baguette de réactif pleine dans le logiciel pour permettre de mesurer le volume de réactif.

5. Exécuter la configuration

  1. Une fois tous les réactifs préparés, accédez à l’onglet Configuration des lames en haut du logiciel et sélectionnez le bouton Nouvelle étude . Ajoutez l’ID de l’étude, le nom de l’étude et les commentaires de l’étude si vous le souhaitez. Reportez-vous à la figure 2 à titre d’exemple.
  2. Sous le volume de distribution, sélectionnez 150 μL et *Dewax 4 étapes comme protocole de préparation. Si *Dewax 4 steps n’apparaît pas dans le menu déroulant, localisez ce protocole dans le menu Configuration du protocole et cochez la case Préféré . Appuyez sur OK.
  3. Une fois l’étude créée, sélectionnez le bouton Ajouter une diapositive sur le côté droit de l’écran de configuration de la diapositive. Sous Commentaires de diapositive, nommez la diapositive de manière unique.
  4. Pour les champs supplémentaires de cet écran, réglez Type de tissu sur Test du tissu et réglez le volume de distribution sur 150 μL, le mode de coloration étant Unique dans la liste déroulante de gauche et Routine dans la liste déroulante de droite. En cours de processus, sélectionnez IHC, le marqueur étant Solution de coloration d’anticorps.
  5. Dans la section protocole de la fenêtre Ajouter une diapositive, sélectionnez Dosage de coloration 1 pour la coloration, * Déparaffinage 4 étapes comme préparation, et *HIER 20 min avec ER2 comme HIER. Le protocole Enzyme restera *----. Une fois cette opération terminée, cliquez sur Ajouter une diapositive. Reportez-vous à la figure 2 à titre d’exemple.
  6. Répétez ce processus si nécessaire pour le nombre de diapositives à exécuter dans l’étude, en vous assurant que le champ Commentaires de diapositive est mis à jour pour chaque diapositive ajoutée afin qu’elles puissent être identifiées de manière unique par la suite. Une fois toutes les diapositives ajoutées, fermez la fenêtre Ajouter une diapositive et imprimez toutes les étiquettes, en les apposant sur les sections de tissu correspondantes.
  7. Chargez chaque diapositive sur le plateau et placez les tuiles de couverture sur chaque section avant de charger le plateau sur le logiciel. Une fois les réactifs et les lames ajoutés, sélectionnez l’autocolorateur correspondant sur le côté droit du logiciel. Une fois cette option sélectionnée, les trois plateaux de lames et les informations relatives à tous les réactifs sur le logiciel seront visibles, y compris les réactifs en vrac et ceux ajoutés lors de la préparation des réactifs.
  8. Assurez-vous que les conteneurs de réactifs en vrac sont remplis et que les conteneurs de déchets ont suffisamment de volume pour terminer le cycle, puis appuyez sur le bouton Play pour commencer le cycle.
  9. Chaque course dure environ 5 h et 15 min. Notez le temps d’arrêt et assurez-vous que les lames sont retirées rapidement de l’autostainer une fois le protocole terminé.

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Figure 2 : Invites pour le logiciel. (A) Nouvelle invite d’étude sur le logiciel Autostainer, montrant les paramètres corrects pour le protocole de coloration par immunofluorescence multiplexée (mIF). (B) Ajouter une invite Slide sur le logiciel, montrant les paramètres corrects pour le protocole de coloration mIF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Imagerie

  1. Une fois le protocole de coloration terminé, retirez les lames et les lamelles tachées dans le support de montage. Laissez le support de montage durcir dans l’obscurité jusqu’à ce que la lamelle soit fermement fixée en place (généralement 1 h ou plus, point de pause).
  2. Imagez les lames sur un microscope à fluorescence ou un scanner de lames entières avec des filtres appropriés pour le dosage. Les colorants utilisés dans ce test sont généralement compatibles avec les filtres pour DAPI, FITC, TRITC, Cy5 et Cy7.
  3. Les images apparaîtront similaires à celles de la figure 3A. Assurez-vous visuellement que toutes les zones du tissu sont correctement mises au point et que les signaux apparaissent à un niveau d’intensité approprié (pas sur/sous-exposé). Si nécessaire, réimagez les diapositives avec des paramètres d’exposition différents.
  4. Après l’imagerie, si une série supplémentaire d’imagerie est nécessaire, faites tremper les lames dans 1x PBS jusqu’à ce que les lamelles tombent d’elles-mêmes. (point de pause)

7. Configuration initiale du protocole Exchange

  1. S’il s’agit de la version 7.0 ou ultérieure du logiciel, il y aura un modèle préinstallé du protocole autostainer. En bas de l’écran, vérifiez que la sélection Statut préféré est définie sur Tous. Le protocole modèle sera nommé *ISP Signal Exchg. Pour les versions antérieures du logiciel, le protocole se trouve dans le Tableau 3.
  2. Faites un clic droit sur *ISP Signal Exchg et copiez le protocole. Dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche, renommez le protocole Exchange Protocol 1 avec le nom abrégé ISPEXCH1. Assurez-vous que la case Préféré est cochée avant de continuer et attribuez le même nom de kit que celui établi à l’étape 2.6.

Tableau 3 : Protocole pour le protocole d’échange de signaux d’immunofluorescence multiplex. Wash Buffer correspond à la solution de lavage BOND. Tous les autres réactifs auxiliaires ont des composants de kit nommés en conséquence. Ce protocole est compatible avec les versions logicielles 7.0 et supérieures, BXD 39 et supérieures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

8. Configuration et exécution du protocole Exchange

  1. Décongelez le tampon d’échange à température ambiante. Maintenez le neutralisant d’échange et l’initiateur d’échange à -20 °C jusqu’à l’utilisation. Deux récipients de titrage de réactifs et le kit de détection sont nécessaires pour effectuer le protocole d’échange.
  2. Préparez la solution d’échange dans le récipient correspondant. Le volume requis est de 350 + (450 μL x nombre de lames), et il est composé d’un initiateur d’échange dilué 1:500 dans le tampon d’échange. Ne pas vortex l’enzyme d’échange ou la solution d’échange complète, mélanger par pipetage uniquement.
  3. Préparez le deuxième mélange de sondes fluorescentes dans le récipient des sondes fluorescentes 2. Le volume requis est de 350 + (450 μL x nombre de lames) et se compose de la solution des sondes fluorescentes 2 diluée 1:20 et du neutralisant d’échange dilué 1:40 dans le tampon de sonde 2. Le mélange de sonde fluorescente et le tampon de sonde peuvent être vortexés, mais le neutralisant d’échange et la solution combinée finale ne doivent être mélangés qu’à la pipette.
  4. Une fois que tous les réactifs sont préparés, placez la baguette pleine sur l’autocolorateur et laissez les réactifs être testés par trempage par la machine.
  5. Ajoutez toutes les diapositives en suivant l’étape 5. Lors de l’ajout de diapositives, remplacez le marqueur par *Négatif. Pour Preparation, HIER et Enzyme, sélectionnez l’option *----, car aucune récupération de dépafin ou d’antigène n’est nécessaire pour le protocole d’échange. Une fois cette opération terminée, cliquez sur Ajouter une diapositive.
  6. Répétez ce processus si nécessaire pour le nombre de diapositives à exécuter dans l’étude, en vous assurant que le champ Commentaires de diapositive est mis à jour pour chaque diapositive ajoutée afin qu’elles puissent être identifiées de manière unique par la suite.
  7. Une fois toutes les diapositives ajoutées, fermez la fenêtre Ajouter une diapositive et imprimez toutes les étiquettes, en les apposant sur les sections de tissu correspondantes.
  8. Chargez chaque diapositive sur le plateau et placez les tuiles de couverture sur chaque section avant de charger le plateau sur le logiciel.
  9. Une fois que tous les réactifs et lames sont ajoutés, sélectionnez l’autocolorant correspondant dans le logiciel ; Ce sera sur le côté droit. Une fois cette option sélectionnée, les trois plateaux de lames et les informations relatives à tous les réactifs sur le logiciel seront visibles, y compris les réactifs en vrac et ceux ajoutés lors de la préparation des réactifs.
  10. Assurez-vous que les contenants de réactifs en vrac sont remplis et que les contenants de déchets ont suffisamment de volume pour terminer le cycle.
  11. Une fois que cela est confirmé, appuyez sur le bouton Play pour commencer la course. Le protocole prend environ 90 minutes. Notez le temps d’arrêt et assurez-vous que les diapositives sont retirées rapidement une fois l’exécution terminée.

9. Imagerie

  1. Répétez l’imagerie pour la nouvelle série de sondes, comme à l’étape 5. Les images s’affichent comme dans la figure 3B.

10. Empilement (pour l’imagerie des protéines >4-plex)

  1. Il existe désormais plusieurs images pour la même diapositive. Combinez les images dans le logiciel de co-enregistrement d’images pour générer une image 8-plex empilée.
  2. Co-enregistrez les images de chaque tour comme suit.
    1. Chaque image ronde est nommée comme suit : _ où est le nom unique de la diapositive (code-barres) et est une chaîne qui, lorsqu’elle est triée par ordre alphabétique, placera l’image du tour 1 en premier, l’image du tour 2 en second. Par exemple, pour = 1234ABC, les fichiers peuvent être nommés 1234ABC_Round1 et 1234ABC_Round2, tous les fichiers ayant l’extension appropriée (par exemple, .czi) du scanner. Mettez toutes les images rondes dans un seul dossier appelé par exemple, Images sources.
    2. Dans le logiciel de co-enregistrement, cliquez sur le bouton Définir dans la section du répertoire des images sources de l’interface utilisateur et, lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le dossier créé ci-dessus.
    3. Définissez le type de fichier dans la section Images sources sur l’extension des images sources (par exemple, .czi, .qptiff, etc.). Le logiciel affichera maintenant les deux images rondes ensemble dans un tableau montrant que la diapositive 1234ABC comporte 2 images rondes.
    4. Si vous le souhaitez, définissez l’emplacement des images empilées de sortie dans un répertoire différent de celui du dossier des images sources à l’aide du bouton Définir dans la section du répertoire des images empilées de l’interface utilisateur et, lorsque vous y êtes invité, choisissez le dossier de sortie souhaité . Sinon, le dossier des images sources sera utilisé par défaut.
    5. Par défaut, seule une représentation de fichier .afi de la pile est créée. Cochez l’option permettant d’enregistrer un fichier OME.tif de l’ensemble de la pile dans la section des options de traitement de l’interface.
    6. Afin de valider la précision du co-enregistrement sur l’ensemble de l’échantillon, cochez l’option Validation dans la section de sortie de l’interface.
    7. Appuyez sur le bouton START pour démarrer le co-enregistrement de l’image.

11. Analyse d’images

  1. Une fois les diapositives imagées, visualisez-les et analysez-les à l’aide de la méthode d’analyse de votre choix, telle que la suite de traitement d’images STARVUE d’Ultivue ou QuPath15.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En suivant le protocole ci-dessus, le tissu FFPE sera coloré avec plusieurs cibles, et des images de haute qualité de tous les marqueurs en groupes de quatre ont été obtenues (Figure 3A,B). Le logiciel de co-enregistrement d’images permettra de combiner et de co-enregistrer les images d’une même diapositive, comme le montre la figure 3C. Des résultats similaires sont présentés à la figure 4 pour une lame de tissu de cancer colorectal (CCR).

Le succès du protocole doit être déterminé en évaluant le modèle de coloration attendu. Dans l’exemple du CCR présenté, chacune des cibles colorées est exprimée dans le compartiment subcellulaire attendu, par exemple, FoxP3 nucléaire, CD3 membraneux, CD68 cytoplasmique (Figure 4B-D). Chacune des cibles fonctionnelles est exprimée sur le type de cellule approprié, comme le démontre l’exemple de la co-localisation de PD1 et CD3 ou de PDL-1 et CD68, qui montrent respectivement des lymphocytes T épuisés et des macrophages immunosuppresseurs. L’évaluation d’un bon rapport signal/bruit de fond, permettant de distinguer avec succès le signal positif véritable du bruit de fond potentiel, est généralement effectuée qualitativement par des pathologistes ou des experts en analyse d’images qui confirment la qualité de la coloration, permettant une analyse d’image réussie. Pour confirmer davantage la qualité et les performances de la coloration, une comparaison avec l’IHC (DAB chromogène) de référence sur des coupes en série peut être ajoutée (voir l’exemple de la figure 5), ainsi qu’un échantillon de tissu témoin positif tel que l’amygdale humaine qui, pour la plupart des cibles immunitaires, peut être utile pour confirmer le succès de la coloration. Notez que les cancers peuvent présenter une expression plus faible des cibles que les amygdales16 humaines.

Une fois les résultats confirmés qualitativement, une analyse quantitative peut être effectuée. Dans ce travail, il s’agit principalement de calculer la densité cellulaire de différents phénotypes (nombre de cellules/mm2) exprimant une ou plusieurs cibles spécifiques, ainsi que de calculer les niveaux d’intensité moyens des cibles fonctionnelles qui peuvent présenter une large gamme dynamique d’expression. Lors de l’évaluation de la précision des tests mIF, les coupes en série colorées avec les mêmes marqueurs doivent montrer des signaux comparables entre les lames, ce qui peut être vu qualitativement sur la figure 6. La figure 7 montre des exemples de résultats quantitatifs de densités de marqueurs uniques dans différents types de tissus. L’analyse d’images sur ces images permet d’identifier les cellules positives, et une densité de cellules positives correspondante peut être calculée pour chaque marqueur, ainsi que l’intensité moyenne du signal par cellule positive. Cela permet de calculer un coefficient de variabilité (CV) pour chaque marqueur afin d’évaluer la précision du test de multiplexage (tableau 4).

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Figure 3 : Images d’une carotte de microréseau de tissus (TMA) obtenues à partir de cycles successifs de coloration dans le protocole d’immunofluorescence 8-plex. (A) Image obtenue lors de la première série d’imagerie, avec les marqueurs CD8, PD1,-L1 et CD68. Après le protocole d’échange, (B) montre la deuxième série d’images sur la même lame pour la deuxième série de marqueurs CD3, CD4, FoxP3 et CK/SOX10, et (C) montre une image co-enregistrée combinant les images (A) et (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Coloration représentative du tissu du cancer colorectal (CCR) avec coloration par immunofluorescence 8-plex. La figure montre des phénotypes cellulaires qui peuvent être identifiés en co-localisant plusieurs cibles dans la même cellule. (haut) Image de la lame entière du tissu du CCR. (en bas) Vues détaillées des régions tissulaires mettant en évidence (A) les cellules T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) les cellules exprimant-1 et-L1 dans la tumeur et le stroma, (C) les cellules T cytotoxiques épuisées (CD3+/CD8+/-1), (D) les cellules tumorales évadant le système immunitaire (-L1+/CK+) et les macrophages immunosuppresseurs (CD68+/PDL1+). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Comparaison qualitative de l’immunohistochimie (IHC) à la coloration par immunofluorescence (IF). Coupes en série colorées par immunohistochimie à marqueur unique (DAB, rangée du haut), immunofluorescence à marqueur unique (ISP monoplex) et vue monocanal de l’immunofluorescence multiplex (ISP multiplex) démontrant une concordance qualitative entre les différentes méthodes de coloration. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6 : Coloration en coupe en série. (A) Schéma montrant la disposition d’une TMA multi-tissulaire. (B) Images 8-plex représentatives des carottes de tissus de chaque type de tissu dans la TMA. (C) Images représentatives de CD8 dans une carotte amygdale sur six sections TMA en série colorées en une seule fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Quantification de la densité à marqueur unique par type de tissu inclus dans l’AMT. Les densités par tissu sont les densités moyennes sur trois carottes représentatives de chaque type de tissu sur la lame de TMA. L’axe des y représente les densités de marqueurs uniques dans différents types de tissus sur l’axe des x, en unités de cellules positives/mm2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Analyse de la région d’intérêt (ROI) du signal fluorescent relatif comparant la mIF ISP amplifiée décrite dans ce protocole à la FI indirecte. (A) Lame représentative colorée pour CK (à gauche) ou-L1 (à droite) avec cinq zones d’intérêt indiquées. (B) Images représentatives du retour sur investissement de CK (en haut) et-L1 (en bas). Intensité moyenne du signal obtenue avec mIF amplifié (violet) et IF indirect (bleu) pour (C) CK et (D)-L1 sur cinq ROI, chacun mesurant 100 μm x 100 μm et contenant environ 200 cellules. Les valeurs de l’axe Y indiquent des unités fluorescentes arbitraires et les barres d’erreur indiquent des écarts-types (n = 3). (E) L’intensité relative du signal obtenue avec le mIF ISP amplifié (violet) et le FI indirect (bleu) a été calculée en prenant le rapport entre le signal mIF amplifié moyen et le signal FI indirect moyen sur l’ensemble des ROI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 4 : Coefficient de variance (CV) calculé. Le CV de densité cellulaire positive et l’intensité moyenne du signal pour les images des amygdales sont illustrés à la figure 6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

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Ce rapport décrit un protocole de coloration par immunofluorescence multiplex à haut débit et haute sensibilité à l’aide d’un autocolorant. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, les étapes de préparation des réactifs sont essentielles et méritent une attention particulière. Il est nécessaire de s’assurer que les réactifs sont mélangés de manière appropriée et correctement mesurés afin de minimiser la variabilité de la coloration entre les différentes lames d’un même cycle ou entre différents cycles utilisant les mêmes composants.

Les problèmes courants lors de l’application de ce protocole comprennent le fait de ne pas mélanger correctement les réactifs avant le chargement et le risque de perte de tissu en raison d’une procédure de découverture inappropriée. Bien que ce protocole de coloration soit applicable à tous les types de tissus FFPE, y compris les types de cancer, certains types de tissus peuvent nécessiter une manipulation plus soigneuse (par exemple, les tissus à forte teneur en matières grasses). Pour éviter la perte de tissu, laissez les lames glissées de la housse tremper pendant une période suffisamment longue pour que la lamelle se détache d’elle-même. Ne forcez pas la lamelle pour déloger ou soulever le verre.

Une limite est que, bien que bon nombre des cibles les plus couramment utilisées en immuno-oncologie soient validées et prêtes à l’emploi, certaines cibles peuvent nécessiter le développement d’un test avant d’être incluses dans un panel multiplexe. Bien que ce processus soit relativement rapide, il peut s’écouler quelques semaines supplémentaires avant de pouvoir utiliser un panneau multiplexe personnalisé.

Il existe plusieurs différences entre ce test et les autres technologies d’immunofluorescence multiplex. Par rapport aux technologies basées sur l’immunofluorescence directe et indirecte, le test démontré ici a un niveau d’amplification significativement plus élevé, permettant une amélioration significative du rapport signal/bruit, en particulier dans les canaux qui ont tendance à montrer une autofluorescence tissulaire, tels que le canal FITC. Il en résulte un signal ~30 fois plus fort que l’immunofluorescence directe et un signal ~10 fois plus fort que l’immunofluorescence indirecte, tel que quantifié à l’aide de l’analyse de l’intensité de la lame entière et de l’analyse manuelle basée sur le retour sur investissement (Figure 8). Cette méthode permet une détection beaucoup plus sensible des protéines cibles à des temps d’exposition nettement plus courts et élimine le besoin de manipulation d’image, y compris la soustraction d’arrière-plan qui risque de supprimer les signaux de faible intensité.

Par rapport aux tests mIF basés sur l’amplification catalysée par des enzymes, le test démontré ici présente une capacité considérablement améliorée à effectuer un multiplexage, en plus d’avoir un flux de travail plus simple et une durée d’exécution généralement plus courte (Figure 1). Dans ce test, les anticorps sont additionnés en une seule étape et amplifiés simultanément, ce qui simplifie considérablement le protocole de test. De plus, certaines technologies à base d’enzymes, telles que l’amplification du signal tyramide (TSA), peuvent montrer des interférences entre différents anticorps, dans ce que l’on appelle l’effet parapluie 12,17,18. La technologie d’amplification utilisée ici permet d’éviter ce problème, permettant la détection de plusieurs marqueurs colocalisés et co-exprimés sur la même cellule, comme on peut le voir sur la figure 4.

Environ 90 % des cancers humains se développent à partir des cellules épithéliales19. En effet, ils forment souvent la première ligne de défense contre l’environnement extérieur et prolifèrent plus rapidement, ce qui entraîne une accumulation plus rapide de mutations potentiellement oncogènes. Ici, l’inflammation joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse, la progression et la dissémination. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses thérapies ciblant les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et les cellules immunitaires sont devenues un puissant arsenal contre de nombreux types de tumeurs 5,20,21. Cependant, une partie importante des patients ne répondent toujours pas. Il est probable que le microenvironnement tumoral (TME) et le paysage immunitaire local jouent un rôle critique. En profilant les signatures moléculaires des EUT associées à la réponse différentielle aux médicaments chez de nombreux patients, il pourrait être possible de mieux définir les biomarqueurs thérapeutiques. Ce rapport démontre que la technologie mIF peut être utilisée pour profiler plusieurs biomarqueurs protéiques en parallèle, y compris des marqueurs à faible expression, sur des centaines de lames d’échantillons entiers ou de microréseaux tumoraux.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. et A. Vasaturo sont des employés d’Ultivue, qui produit les kits d’immunofluorescence multiplex utilisés dans ce travail.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par Ultivue.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-CD3UltivueClone BC33 (BioCare). Fait partie de ULT50801
anti-CD4Ultivueclone SP35 (Abcam). Fait partie de ULT50801
anti-CD68UltivueKP1 (BioCare). Fait partie de ULT50801
anti-CD8UltivueC8/144B (BioCare). Fait partie de ULT50801
Ultivueanti-cytokératine + anti-SOX10AE1/AE3 (Bethyl Labs) et BC34 (BioCare). Fait partie de ULT50801, fourni sous forme de mélange
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Fait partie de ULT50801
anti-PD1Ultivueclone CAL20 (Abcam). Fait partie de ULT50801
anti-PDL1UltivueClone 73-10 (Abcam). Fait partie de ULT50801
Axioscan.Z1 MicroscopeZeissappelé microscope à fluorescence dans le texte
Bond Dewax SolutionLeicaAR9222
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700
Bond Research Detection KitLeicaDS9455
Inserts de titrage BondLeicaOPT9049
Kit de titrage BondLeicaOPT9719
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Bond Wash Solution 10x ConcentréLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicadit « autostainer » dans le texte
LogicielBondRXLeicaversion 6.0 ou ultérieure
Couvre-filets, épaisseur #1.5Corning2980-244
Éthanol, 200 proofVWR89370-084
Blocs de tissus FFPEde tissus BioIVTvarient
OmniVUE 8-plex test (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3,-1,-L1, pan-Cytokératine/SOX10)UltivueULT50801contient tous les autres composants Ultivue
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 avec 2,7 mM KCl et 137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144appelé « support de montage » dans le texte
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue Ultivue
Amplification BufferUltivue Ultivuefait partie de ULT50801
Ultivue Diluant d’anticorpsUltivuefait partie de ULT50801
Tampon d’échange UltivueUltivuefait partie de ULT50801
Initiateur d’échangeUltivuefait partie de ULT50801
Ultivue Neutralisateur d’échangeUltivuefait partie de ULT50801
Sondes fluorescentes Ultivue 1Ultivuepartie de ULT50801
Sondes fluorescentes Ultivue 2Ultivuefait partie de ULT50801
Ultivue Mélange de préamplificationUltivuefait partie de ULT50801
Tampon de sonde UltivueUltivuefait partie de ULT50801
Eau ultrapureSigma-AldrichW4502
clonecloneclones Les types

Références

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