Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris

Summary

Le présent protocole décrit une méthode rentable pour purifier, étendre et caractériser des cellules souches mésenchymateuses (BMSC) de moelle osseuse hautement homogènes provenant de souris. Cette approche facilite l’acquisition de grandes quantités de BMSC à fort potentiel de prolifération et de différenciation, soutenant les modèles murins et faisant progresser la recherche préclinique.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une population de cellules souches qui peuvent s’auto-renouveler et se différencier en plusieurs lignées cellulaires. Parmi elles, les CSM présentes dans la moelle osseuse, connues sous le nom de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC), jouent un rôle crucial dans l’ostéogenèse, le soutien hématopoïétique, le homing/migration et l’immunosuppression. Les BMSC sont largement utilisés dans la recherche en biologie cellulaire et en ingénierie tissulaire en raison de leur potentiel pour les stratégies thérapeutiques cellulaires, ainsi que de leur facilité d’accès, de leur stabilité génétique et de leur faible immunogénicité. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les BMSC coexistent dans la moelle osseuse mais ont des cellules progénitrices distinctes. Lors de l’extraction de cellules de la moelle osseuse, plusieurs types de cellules sont généralement obtenus, ce qui peut entraîner une hétérogénéité dans la population cellulaire, ce qui peut entraîner des biais et ne pas répondre à des normes expérimentales élevées. Par conséquent, il est crucial de développer des techniques efficaces pour améliorer l’homogénéité et le rendement des BMSC in vitro. Cette étude présente un protocole détaillé pour la purification, l’expansion et le phénotypage basé sur la cytométrie en flux des BMSC obtenues à partir de souris BALB/c. L’homogénéité et le phénotype des cellules souches des BMSC de troisième passage ont été caractérisés à l’aide de la cytométrie en flux, démontrant une positivité pour CD29, CD44 et Sca-1, une négativité pour CD45 et CD31, et confirmant leur capacité de différenciation ostéogénique et adipogénique. Ce protocole rentable fournit une méthode simple et efficace pour obtenir un nombre suffisant de BMSC homogènes avec un potentiel de prolifération et de différenciation élevé, ce qui est essentiel pour faire avancer la recherche sur les modèles murins et les études précliniques approfondies.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont connues pour leurs caractéristiques multipotentes et sont largement utilisées dans le traitement de diverses maladies en raison de leurs propriétés autorenouvelables, de différenciation et immunomodulatrices ^1,2. Les BMSC sont facilement accessibles, capables d’une expansion étendue, présentent des propriétés immunosuppressives et ne déclenchent pas de réactions immunitaires immédiates³, ce qui les rend attrayantes pour les applications d’ingénierie tissulaire et les vecteurs efficaces pour la thérapie cellulaire.

Dans la moelle osseuse, deux principales populations de cellules souches et leur descendance, les cellules souches hématopoïétiques et les BMSC, sont les résidentes primaires⁴. Traditionnellement, les BMSC sont obtenues par aspiration ciblée de la moelle osseuse et identifiées comme des cellules adhérentes au plastique in vitro. Cependant, cette méthode est insuffisante pour différencier les BMSC des autres sous-populations de moelle osseuse, y compris les cellules endothéliales, les péricytes, les leucocytes et les cellules souches hématopoïétiques⁵. Par conséquent, un protocole simple et efficace pour l’isolement des BMSC est nécessaire.

Les travaux actuels détaillent la séparation et la purification des BMSC par leur adhérence physique à des plaques de culture cellulaire en plastique. Des expériences de cytométrie en flux ont été menées sur des BMSC de troisième passage à l’aide des marqueurs de surface CD29, CD44 et Sca-1, comme l’a décrit le comité⁶ des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) de l’International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT). Selon les critères de l’ISCT, les CSM de souris sont caractérisées par une positivité pour CD29, CD44 et l’antigène 1 des cellules souches (Sca-1), et une négativité pour le marqueur de cellules hématopoïétiques CD45 et le marqueur de cellules endothéliales CD31. De plus, les BMSC doivent être multipotentes, démontrant une différenciation trilinéaire en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes. Dans cette expérience, l’ostéogenèse a été induite dans les BMSC extraites, avec une coloration ALP effectuée le jour 7 et un test de rouge d’alizarine S le jour 21 pour évaluer la différenciation. La différenciation adipogénique des BMSC isolées et purifiées a également été induite, avec une coloration au rouge d’huile O effectuée le jour 21 pour évaluer l’adipogenèse.

Protocol

La manipulation des animaux a été approuvée conformément aux directives d’éthique des animaux de laboratoire (approbation éthique n° : PZSHUTCM2211070009) de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Des souris BALB/c femelles âgées de huit semaines (FPS, 20 ± 1 g de poids corporel) ont été utilisées dans cette étude. Ce protocole décrit la purification, le passage, le phénotypage basé sur la cytométrie en flux et la différenciation ostéogénique et adipogénique des BMSC dérivées de souris. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Manipulation des animaux

1. Hébergez des souris dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques (FPS) dans des cages ventilées individuellement, avec cinq souris par cage. Fournir des aliments de qualité SPF et de l’eau stérile. Maintenez un cycle lumière/obscurité de 12 heures.
   REMARQUE : Cette méthode a été testée et s’est avérée réalisable dans les souches de souris BALB/c et C57BL/6. Cet article utilise principalement BALB/c comme exemple.

2. Récolte des fémurs et des tibias des membres postérieurs de souris

1. Euthanasier les animaux par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale⁷ selon les directives éthiques.
2. Faites tremper les souris dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 min (figure 1A).
   REMARQUE : Les cellules souches ont été prélevées dans les 30 minutes² suivant l’euthanasie, et l’ensemble du processus, y compris le rinçage de la moelle, la filtration et l’ensemencement dans des plaques de culture, a été terminé dans les 2 heures pour assurer une viabilité cellulaire optimale.
   REMARQUE : Utilisez des souris adultes (≥8 semaines) pour un rendement optimal des BMSC ; Les souris de 8 à 12 semaines sont idéales⁸.
3. Faites une incision d’environ 1 cm au niveau du membre postérieur du tendon d’Achille à l’aide de ciseaux de dissection stériles (Figure 1B).
4. Faites une incision circulaire autour de la patte postérieure du tendon d’Achille à l’aide de ciseaux stériles pour exposer le tibia distal (Figure 1C).
5. Retirez la peau de l’incision vers la hanche pour l’enlever des deux membres postérieurs (figure 1D).
6. Coupez le long de l’os iliaque pour séparer la tête fémorale de l’os de la hanche (figure 2A).
   REMARQUE : Évitez d’endommager les articulations bilatérales du fémur lors de la dissection pour prévenir la perte de moelle osseuse.
7. Placez les fémurs et les tibias collectés dans une boîte de 60 mm contenant du PBS pré-froid stérile contenant 2 % de pénicilline/streptomycine (figure 2B).
8. Coupez autant de tendon et de muscle que possible du tibia et du péroné à l’aide d’un scalpel stérile pour faciliter le rinçage ultérieur (Figure 2C).
9. Retournez les os traités dans un PBS contenant 2 % de pénicilline/streptomycine et transférez-les dans le capuchon stérile pour les étapes d’isolement ultérieures.

3. Purification et culture de BMSC de souris

1. Préparez un milieu complet de modification alpha MEM (αMEM) pour la culture de BMSC en complétant l’αMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine.
   REMARQUE : Choisissez un milieu αMEM car il contient 1000 mg / L de glucose, ce qui est une concentration relativement faible. Cela permet d’éviter l’inhibition de la prolifération cellulaire qui peut se produire dans des environnements à forte teneur en glucose⁹
2. Prenez une seringue de 50 ml et fixez-y l’aiguille fournie avec la seringue.
3. Prélevez 20 ml de milieu αMEM dans la seringue de 50 ml, puis remplacez l’aiguille par celle fournie avec la seringue de 1 ml.
   REMARQUE : Utilisez une aiguille de seringue de 1 ml pour s’adapter à la taille de l’os et minimiser les dommages cellulaires. Une seringue de 50 ml permet un rinçage efficace de la moelle osseuse avec un risque réduit de contamination cellulaire par des insertions répétées.
4. À l’aide de ciseaux, coupez les deux extrémités du fémur ou du tibia séparé dans un capuchon stérile.
5. Insérez l’aiguille dans l’os le long du bord coupé et rincez la moelle osseuse dans une boîte de culture de 100 mm contenant un milieu αMEM complet (Figure 2D).
6. Rincer les cavités osseuses à plusieurs reprises jusqu’à ce que les morceaux d’os semblent pâles pour s’assurer que la plus grande partie de la moelle osseuse a été extraite (figure 2E).
7. Pipetez de haut en bas 40 fois doucement avec une pointe de pipette pour disperser autant que possible les cellules agrégées.
8. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube à centrifuger de 50 ml pour éliminer les débris, les fragments de tissu et les amas non dispersés.
9. Transférez la suspension cellulaire filtrée dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm et ajoutez un milieu αMEM complet à un volume final de 15 ml par boîte.
   REMARQUE : Cultivez toutes les cellules de moelle osseuse prélevées sur les fémurs et les tibias de chaque souris dans une boîte de culture de 100 mm pour faciliter la croissance cellulaire. D’après des expériences antérieures, environ 1 × 10⁷ BMC peuvent être isolés chez une souris de 8 semaines (à partir de deux fémurs et de deux tibias). Ces cellules sont ensemencées dans une boîte de culture de 100 mm à une densité de 1,8 ×^10,5 cellules/^cm2 pour la culture primaire.
10. Tenez le plat à deux mains et faites-le tourner doucement en forme de huit 15 fois pour assurer une répartition uniforme des cellules dans le bol.
11. Placez la boîte de culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ et cultivez pendant 5 jours (Figure 3A).
    REMARQUE : Évitez de déplacer la boîte de culture pendant cette période pour assurer une croissance cellulaire uniforme.

4. Remplacement du milieu αMEM pour la culture BMSC

1. Observez les cellules au microscope pour déterminer si elles ont atteint 80 % de confluence. Si ce n’est pas le cas, procédez au remplacement du support le 5^ème jour.
2. Prélever 3 mL de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et le distribuer à partir d’une hauteur de 1 cm au-dessus de la boîte de culture à différentes positions.
   REMARQUE : Évitez de distribuer du liquide sur un côté du bol, car cela pourrait éliminer les cellules adhérentes en raison d’une force d’impact excessive et empêcher l’élimination efficace des cellules indésirables.
3. Après avoir ajouté 3 ml de PBS, secouez doucement la boîte de culture pour bien laver les cellules et retirez le PBS de la boîte à l’aide d’une pipette. Répétez le processus de lavage une fois de plus pour vous assurer que les cellules sont bien lavées.
4. Prélevez 15 ml de milieu αMEM complet à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et distribuez-le à 1 cm au-dessus de la boîte de culture à différentes positions.
5. Remettez la boîte de culture dans l’incubateur et surveillez jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence avant la sous-culture (figure 3B).

5. Passage des BMSC

1. Laver 80 % des cellules confluentes deux fois avec du PBS (Figure 3C).
   REMARQUE : Le lavage des cellules avec du PBS avant la digestion aide à éliminer le milieu résiduel et les sécrétions cellulaires et réduit l’adhésion des CSM à la boîte de culture.
2. Digérer les cellules avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % en les incubant à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 2 à 3 min.
3. Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu αMEM complet à la suspension cellulaire.
4. Aspirez la suspension cellulaire de la boîte de culture à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et rincez doucement le fond de la boîte pour détacher toutes les cellules adhérentes.
5. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante.
6. À l’aide d’une pipette, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 2 mL de milieu αMEM complet.
   REMARQUE : Pour la sous-culture, une densité de semis d’environ 4 × 10⁴ cellules/^cm2 s’est avérée optimale pour la croissance et la prolifération continues.
7. Divisez les cellules selon un rapport de 1:1–1:2 dans de nouvelles boîtes de culture cellulaire de 100 mm (cela constitue le^{1er passage,} P1) (Figure 3D).
8. Divisez les cellules environ tous les trois jours selon un rapport de 1:1,5 lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 % pour générer le deuxième passage (P2) (figure 3E) et le troisième passage (P3) (figure 3F) des BMSC.

6. Préparation des BMSC P3 pour l’identification phénotypique et la différenciation ostéogénique

1. Jetez le milieu de culture cellulaire.
2. Lavez deux fois les BMSC P3 avec 3 ml de PBS.
3. Digérer les BMSC P3 avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % en les incubant à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 2 à 3 minutes lorsqu’ils atteignent 80 % de confluence.
4. Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu αMEM complet à la suspension cellulaire.
5. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL, centrifuger à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante et jeter le surnageant.
   REMARQUE : Les pastilles de BMSC P3 préparées ici seront utilisées pour l’identification phénotypique par cytométrie en flux et pour l’évaluation de la différenciation ostéogénique ou adipogénique.

7. Identification phénotypique des BMSC par cytomètre en flux

1. Remettre en suspension les pastilles de cellules de BMSC P3 avec 1,5 mL de solution PBS contenant 2 % de FBS et ajuster la concentration à 5 × 10⁶ cellules/mL.
2. Aliquote 100 μL de suspension cellulaire dans chacun des 11 tubes pour obtenir 5 × 10⁵ cellules par tube. Préparez les groupes suivants : ébauche d’étiquette, contrôle d’isotype CD29, CD29, contrôle d’isotype CD44, CD44, contrôle d’isotype Sca-1, Sca-1, contrôle d’isotype CD31, CD31, contrôle d’isotype CD45 et CD45.
   REMARQUE : Dans la présente étude, les fluorochromes suivants ont été utilisés : CD29-FITC, CD29 isotype-FITC, CD44-APC, CD44 isotype-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotype-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotype-PerCPcy5.5, CD31-PE et CD31 isotype-PE (comme indiqué dans le tableau des matériaux). Ces fluorochromes peuvent être modifiés en fonction des configurations des différents cytomètres en flux.
3. Pour chaque groupe, ajouter les réactifs suivants : 2 μL de PBS dans le groupe blanc de l’étiquette, 2 μL d’isotype CD29 dans le groupe témoin de l’isotype CD29 (dilution 1:50), 2 μL de CD29 dans le groupe CD29 (dilution 1:50), 0,5 μL d’isotype CD44 dans le groupe témoin de l’isotype CD44 (dilution 1:200), 0,5 μL de CD44 dans le groupe CD44 (dilution 1:200), 0,5 μL d’isotype Sca-1 par rapport au groupe témoin d’isotype Sca-1 (dilution 1:200), 0,5 μL d’isotype Sca-1 par rapport au groupe Sca-1 (dilution 1:200), 2 μL d’isotype CD31 par rapport au groupe témoin d’isotype CD31 (dilution 1:50), 2 μL d’isotype CD31 par rapport au groupe CD31 (dilution 1:50), 2 μL d’isotype CD45 par rapport au groupe témoin d’isotype CD45 (dilution 1:50), et 2 μL de CD45 dans le groupe CD45 (dilution 1:50).
   REMARQUE : Les anticorps ont été utilisés conformément aux recommandations optimisées du fabricant pour la cytométrie en flux. Des expériences préliminaires ont confirmé une coloration et une spécificité optimales pour les cellules cibles. Référez-vous aux directives posologiques du fabricant et effectuez des pré-tests de titre au besoin.
4. Mélangez délicatement, centrifugez à l’aide d’une centrifugeuse à palme et incubez pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
5. Ajouter 900 μL de PBS dans chaque tube, mélanger en inversant et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant pour éliminer l’excès d’anticorps.
6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans chaque tube avec 300 μL de PBS et analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de fixer les cellules avec du formaldéhyde neutre à 2,5 % si le test de cytomètre en flux peut être effectué dans un délai de 1 à 2 heures. Si l’analyse ne peut pas être effectuée dans un délai de 1 à 2 heures, fixer les cellules avec du formol tamponné neutre à 2,5 % (préparé en mélangeant du formol tamponné neutre à 10 % avec du PBS dans un rapport de 1:3) et les stocker à 4 °C dans l’obscurité pendant la nuit pour un test ultérieur de cytométrie en flux.
7. Ajustez la tension du cytomètre en flux à l’aide du groupe de blancs de l’étiquette pour vous assurer que l’autofluorescence de la cellule se situe à environ 1/4-1/3 de l’axe de coordonnées. Chargez séquentiellement les cellules des groupes CD29, CD29, CD44, CD44, Sca-1, Sca-1, CD31, CD31, CD45 et CD45. Réglez la porte P1 (telle que définie dans le graphique FSC/SSC) pour capturer 10 000 cellules, fonctionnant à vitesse moyenne.
   REMARQUE : Assurez-vous que le cytomètre en flux est équipé des canaux appropriés, tels que ceux couramment utilisés dans les expériences : FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 et APC, ou d’autres canaux qui correspondent à des fluorescéines couplées aux anticorps.

8. Différenciation ostéogénique des BMSC

1. Remettre en suspension les pastilles P3 BMSC dans un milieu αMEM complet, en ajustant la concentration à 1 × 10⁵ cellules/mL.
2. Implantez les BMSC P3 dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits en ajoutant 1 mL de milieu αMEM complet contenant 1 × 10⁵ cellules dans chaque puits.
3. Cultivez les BMSC P3 à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 3 à 5 jours jusqu’à ce qu’ils atteignent plus de 90 % de confluence. Remplacez le milieu αMEM complet par un milieu frais tous les 2 jours.
4. Divisez les différents puits de manière égale en deux groupes : le groupe témoin négatif (sans induction de différenciation ostéogénique) et le groupe de différenciation ostéogénique
5. Préparez le milieu d’induction de la différenciation ostéogénique en complétant le milieu αMEM complet avec 10 mmol/L de β-glycérophosphate, 50 mg/L d’acide L-ascorbique et ^10-8 mol/L de dexaméthasone.
6. Jeter le milieu de culture cellulaire et laver les BMSC P3 avec 1 mL de PBS.
7. Ajouter le milieu d’induction de la différenciation ostéogénique dans les puits du groupe de différenciation ostéogénique pour l’induction de la différenciation ostéogénique (1 mL/puits).
8. Ajouter le milieu αMEM complet dans les puits du groupe témoin (1 mL/puits).
9. Cultivez les BMSC P3 à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 7 ou 21 jours, en remplaçant tous les 3 jours le milieu d’induction de différenciation ostéogénique ou le milieu αMEM complet par le même milieu frais.
   REMARQUE : Les cellules avec une induction de 7 jours sont utilisées pour la coloration à la phosphatase alcaline (ALP). Des cellules avec une induction de 21 jours sont utilisées pour le dosage du rouge d’alizarine S.

9. Identification des cellules ostéogéniques différenciées par coloration ALP

1. Lavez une fois les cellules dans chaque puits de la plaque à 24 puits avec 1 mL de PBS.
2. Fixez les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de formol tamponnée à 10 % et laissez incuber pendant 20 min.
3. Lavez à nouveau les cellules de chaque puits avec 1 mL de PBS une fois.
4. Ajouter 0,5 mL de réactif de coloration à la phosphatase alcaline 1-Step NBT/BCIP dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 minutes avec un emballage en papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
5. Jetez la solution, lavez une fois les cellules de chaque puits avec 1 ml d’eau distillée et laissez sécher la plaque.
6. Observez et acquérez des images de colonies colorées à l’aide d’une caméra pour identifier les cellules positives à l’ALP avec un précipité noir-violet.
   REMARQUE : Le réactif de coloration à la phosphatase alcaline (ALP) en 1 étape NBT/BCIP produit un précipité noir-violet fort et insoluble lors de la réaction avec l’ALP, qui peut être facilement visualisé.

10. Identification de cellules ostéogéniques différenciées par dosage du rouge d’alizarine S

1. Lavez une fois les cellules dans chaque puits de la plaque à 24 puits avec 1 mL de PBS.
2. Fixez les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de formol tamponnée à 10 % et laissez incuber pendant 20 min.
3. Lavez une fois les cellules dans chaque puits de la plaque à 24 puits avec 1 mL de PBS.
4. Ajouter 0,5 mL de rouge d’alizarine S à 0,1 % dans 0,1 mol/L de Tris-HCl (pH 8,3) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 à 60 min.
5. Jetez la solution, lavez une fois les cellules de chaque puits avec 1 ml d’eau distillée et laissez sécher la plaque.
6. Observer et acquérir des images des colonies colorées à l’aide d’une caméra pour identifier les cellules S positives au rouge d’alizarine.
   REMARQUE : Le dosage du S rouge d’alizarine pour la différenciation des CSM en cellules osseuses minéralisées matures entraîne la formation d’un complexe S-calcium rouge d’alizarine, qui produit une coloration rouge vif qui peut être observée visuellement.

11. Préparation du milieu de différenciation de l’induction adipogénique A pour les BMSC

REMARQUE : Pour la différenciation adipocytaire des BMSC, un kit de différenciation adipogénique des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de souris (voir le tableau des matériaux) est souvent utilisé conformément aux directives.

1. Placez le sérum fœtal de veau (un composant de la trousse, appelé sérum) dans le réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 6 h avant la décongélation complète.
2. Placer le Supplément A-I (composant du Kit) dans le réfrigérateur 4°C au moins 30 min avant la préparation ; placez le supplément A-II (composant du kit) à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé.
3. Retournez ou tapotez doucement le tube de réactif pour mélanger le contenu.
4. Centrifuger le tube de réactif du supplément A-II à 300 × g pendant 30 s à température ambiante pour s’assurer que le réactif s’accumule au fond pour une récupération facile.
5. Nettoyez soigneusement l’emballage extérieur de tous les composants avec de l’alcool médical à 75 % et ouvrez-les dans une enceinte de biosécurité.
6. Ajoutez du sérum, du supplément A-I et du supplément A-II dans le médium.
   REMARQUE : Pour assurer une dissolution correcte, préchauffez le milieu basal (un composant du kit) à 37 °C, ou le supplément A-II peut précipiter en raison de l’exposition au froid.
7. Utilisez une petite quantité de milieu basal pour rincer chaque bouteille et tube, en vous assurant de transférer tous les composants dans le milieu basal.
8. Fixez le bouchon sur le flacon de Basal Medium et secouez doucement pour bien mélanger.
9. Scellez la bouteille avec un film de paraffine, enveloppez-la dans du papier d’aluminium et étiquetez-la avec le nom, la date de préparation et d’autres détails.

12. Préparation du milieu de différenciation de l’induction adipogénique B pour les BMSC

1. Placez le sérum fœtal de veau au réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 6 h avant la décongélation complète.
2. Placez le supplément B (un composant de la trousse) dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé pendant au moins 30 minutes avant la préparation.
3. Retournez ou tapotez doucement le tube de réactif pour mélanger le contenu.
4. Centrifugez le tube de supplément B pour concentrer le réactif au fond et faciliter la collecte.
5. Nettoyez soigneusement l’emballage extérieur de tous les composants avec de l’alcool médical à 75 % et ouvrez-les dans une enceinte de biosécurité.
6. Ajoutez du sérum et du supplément B dans le milieu basal.
7. Utilisez une petite portion du milieu de base pour laver chaque bouteille et tube, en vous assurant que tous les composants sont entièrement transférés dans le milieu.
8. Fixez le bouchon sur le flacon de Basal Medium et secouez doucement pour bien mélanger.
9. Scellez la bouteille avec du parafilm, enveloppez-la dans du papier d’aluminium et étiquetez-la avec le nom, la date de préparation et d’autres détails.

13. Différenciation adipocytaire des BMSC

1. Ajouter 1 mL de gélatine à 0,1 % dans une assiette à six puits, en secouant pour enrober uniformément le fond de chaque puits.
2. Placez la plaque à six puits recouverte de gélatine à 0,1 % dans une hotte stérile ou un incubateur de CO₂ pendant au moins 30 min.
3. Aspirez la gélatine et la plaque est prête pour l’ensemencement cellulaire, ou attendez que les puits sèchent avant de semer après 30 min.
4. Ensemencer les BMSC P3 à une densité de 4 × 10⁴ cellules/^cm2 dans chaque puits de la plaque à six puits, en ajoutant 2 mL de milieu complet dans chaque puits.
5. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de CO₂ avec 5 % de CO₂ et une humidité saturée.
6. Aspirez soigneusement le milieu et ajoutez 2 mL de milieu d’induction de différenciation adipogénique A dans chaque puits lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence.
7. Aspirer le milieu A des puits après 3 jours d’induction et ajouter 2 mL de milieu de différenciation adipogénique B.
8. Aspirez le milieu B après 1 jour, et revenez au milieu A pour une induction ultérieure.
9. Alternez entre le milieu A et B, et observez les cellules quotidiennement. Si la contraction ou la mort cellulaire se produit pendant l’induction avec le milieu A, passez rapidement au milieu B.
10. Répétez le processus d’induction et d’entretien jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de gouttelettes lipidiques de taille appropriée apparaissent, puis préparez-vous à la coloration.

14. Coloration Oil Red O (ORO)

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures aussi doucement que possible pour éviter le détachement des gouttelettes lipidiques.

1. Aspirez le milieu de différenciation de l’induction adipogénique de la plaque à 6 puits une fois la différenciation de l’induction adipogénique terminée et lavez-le doucement avec du 1×PBS 2 à 3 fois.
2. Ajouter 2 ml de formol tamponné neutre à 10 % par puits et fixer pendant 20 minutes à température ambiante.
3. Préparez la solution de travail d’Oil Red O en mélangeant le bouillon d’Oil Red O avec de l’eau distillée dans un rapport de 3:2. Après le mélange, centrifuger à 250 × g pendant 4 min et utiliser le surnageant.
4. Aspirez le fixateur et lavez-le doucement avec du PBS 2 à 3 fois, en veillant à ce qu’il soit complètement retiré.
5. Ajouter 0,8 mL de solution de coloration rouge O dans chaque puits, laisser à température ambiante pendant 30 min.
6. Aspirez la solution de teinture, lavez deux fois avec 1 ml d’éthanol à 75 %.
7. Ajouter 1 mL de contre-coloration à l’hématoxyline dans chaque puits pendant 2 min, puis aspirer.
8. Ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits et observer les résultats de la coloration adipogénique au microscope.
9. Scellez la plaque à six puits tachée avec du parafilm et conservez-la à 4 °C.
   REMARQUE : Ne pas conserver plus de 1 semaine. Les gouttelettes lipidiques peuvent fusionner, perdant l’état de coloration.

Results

Des CSGB dérivées de souris ont été isolées et cultivées pendant environ 2 semaines pour générer les CSGB de troisième passage (P3) (figure 3). Comme le montre la figure 3A, les cellules fraîchement extraites de la moelle osseuse sont restées mononucléaires avec des gouttelettes de graisse visibles. Des cellules fusiformes sont apparues dans la boîte de culture, atteignant une confluence de 60 % à 80 % le 5^e jour de cu...

Discussion

La thérapie par cellules souches a suscité un intérêt considérable en raison de son potentiel à révolutionner la médecine régénérative. Les études précliniques ont fourni des preuves substantielles à l’appui de l’application clinique des cellules souches, en particulier des BMSC¹³. Cependant, des défis tels que le faible rendement cellulaire, la contamination et la lenteur de la croissance ont entravé leur application clinique. Par conséquent, il est urgent de men...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue de 1 ml (aiguille de seringue 22G)	GROUPE AIMABLE (KDL)	60017031
1 étape NBT/BCIP  ;	Pierce Biotechnology, Inc.	34042	Coloration à la phosphatase alcaline
10 % de formol tamponné neutre	Wexis	5200250	Fixation cellulaire
Plaque à 6 puits	Labselect	11110	Culture cellulaire
Plaque à 24 puits	Labselect	11310	Culture cellulaire
40 &mu ; m Crépine de cellule	Cornig	352340	Filtration pour éliminer les agglomérats
Seringue de 50 ml	GROUPE AIMABLE (KDL)	60017040
75 % d’éthanol	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	31009001	Désinfecter la peau des souris
Rouge Alizarine S	Sigma-Aldrich  ;	A5533	Détection des dépôts de calcium et des nodules calcifiés
Anticorps monoclonal APC CD44 (clone : IM7)	eBiosciences	17-0441-82	Cytométrie en flux  ;
Contrôle d’isotype APC Rat IgG2b kappa (Clone :eB149/10H5)	eBiosciences	17-4031-82	Cytométrie en flux  ;
Autoclave	Japon Hiryama Company	HVE-50	Stérilisation des instruments chirurgicaux
Incubateur CO2	Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.	300583057	Culture cellulaire
Débitmétrie Cytoflex	Beckman Coulter  ;	N° A00-1-1102	Cytométrie en flux  ;
dexaméthasone	Sigma-Aldrich  ;	D4902	BMSC différenciation ostéogénique
Plat (100mm)	Corning	430167	Culture cellulaire
Plat (60mm)	Corning	430166	Mise en place de l’échantillon lors de la transplantation
Boules de coton désinfectantes	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Désinfecter la peau des souris
Gants stériles jetables	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd	YT21131	Opération stérile
Régime alimentaire des rongeurs irradiés Double lion	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Alimentation animale
Sérum de Bovin Fœtal  ;	Shanghai Biosun Sci& Tech Co., Ltd.	BS-0002-500	Culture cellulaire
FITC Hamster Anti-Rat CD29 (clone : Ha2/5)	BD Biosciences	555003	Cytométrie en flux  ;
FITC Hamster IgM, &lambda ; 1 contrôle d’isotype (clone : G235-1)	BD Biosciences	553960	Cytométrie en flux  ;
gélatine (0,1 %)	OriCell	GLT-11301	Améliorer la capacité d’adhésion des cellules
Cage à souris IVCs	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Barrière animale
Acide L-ascorbique	Sigma-Aldrich  ;	A8960	BMSC différenciation ostéogénique
Stylo de marquage	Zebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd.  ;	YYST5	Marquez les informations cellulaires sur la boîte de Pétri
Modification MEM Alpha (1X)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	SH30265	Culture cellulaire
Kit de différenciation adipogénique des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de souris	Cyagen	MUXMX-90031	BMSC différenciation adipogénique  ;
Microscope inversé Nikon Eclipse Ti2 Synstem	Japon Nikon Corporatin	Ti2-U	Observez les cellules et prenez des photos
Ciseaux ophtalmiques  ;	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Coupez la peau
Pince à épiler ophtalmique	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Obtenez du tissu osseux de souris.
PASTEUR PIPETTE	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-XG-03M	Aspirer le milieu de culture
PE Rat Anti-Souris CD31 (clone :Ha2/5)	BD Biosciences	553373	Cytométrie en flux  ;
PE Rat IgG2a, &kappa ; Contrôle d’isotype (clone : R35-95)	BD Biosciences	553930	Cytométrie en flux  ;
Anticorps monoclonal PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) (clone : D7)	eBiosciences	25-5981-82	Cytométrie en flux  ;
Contrôle d’isotype PE-Cyanine7 Rat IgG2a kappa (clone : eBR2a)	eBiosciences	25-4321-82	Cytométrie en flux  ;
Pénicilline-streptomycine	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	2585636	Culture cellulaire
PerCP-Cy5.5 Anti-souris pour rat CD45 (clone : Ha2/5)	BD Biosciences	561869	Cytométrie en flux  ;
PerCP-Cy5.5 Rat IgG2b, &kappa ; Contrôle d’isotype (clone : A95-1)	BD Biosciences	550764	Cytométrie en flux  ;
Scalpels	Usine d’instruments chirurgicaux oShanghai Medical Devices ? Groupe ?Co., Ltd.  ;	J11010-10# JZ	Isolez les membres arrière et le torse de la souris et retirez les tissus étrangers de l’os
Cagoule stérile	Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.	ECO0.9	Table d’opération chirurgicale
champs opératoires stériles	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160900	Fournir une zone de chirurgie stérile
Tube (50 ml)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Stocker la solution de cellule filtrée
trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	Digester les cellules adhérentes
&bêta ;-glycérophosphate	Sigma-Aldrich  ;	Référence G5422	BMSC différenciation ostéogénique