Manipulation des forces mécaniques dans le cœur du poisson-zèbre en développement à l’aide de billes magnétiques

Summary

Ce protocole décrit une méthode pour greffer une bille magnétique dans le cœur du poisson-zèbre en développement par microchirurgie, permettant la manipulation des forces mécaniques in vivo et déclenchant un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique dans les cellules endocardiques.

Abstract

Les forces mécaniques fournissent en permanence une rétroaction aux programmes morphogénétiques des valves cardiaques. Chez le poisson-zèbre, le développement des valves cardiaques dépend de la contraction cardiaque et des stimuli physiques générés par le cœur battant. L’hémodynamique intracardiaque, pilotée par le flux sanguin, apparaît comme une information fondamentale façonnant le développement du cœur embryonnaire. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour manipuler les forces mécaniques in vivo en greffant une perle magnétique de 30 à 60 m de diamètre dans la lumière cardiaque. L’insertion de la bille est réalisée par microchirurgie chez des larves anesthésiées sans perturber la fonction cardiaque et permet une modification artificielle des conditions limites, modifiant ainsi les forces d’écoulement dans le système. Par conséquent, la présence de la bille amplifie les forces mécaniques subies par les cellules endocardiques et peut déclencher directement un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique. Cette approche facilite l’étude des voies de mécanotransduction qui régissent le développement cardiaque et peut fournir des informations sur le rôle des forces mécaniques dans la morphogenèse des valves cardiaques.

Introduction

Depuis son introduction à la^{fin des années} 19701, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système modèle pour étudier les subtilités du développement cardiaque et des cardiopathies congénitales. Contrairement à la plupart des vertébrés, y compris les embryons de souris et de poussins, qui dépendent d’un système cardiovasculaire fonctionnel et ne peuvent pas survivre à des malformations cardiaques précoces, le poisson-zèbre offre un avantage unique en permettant l’étude de phénotypes cardiaques graves. Cela est dû à leur petite taille, qui facilite un apport suffisant en oxygène par diffus....

Protocol

Les procédures de travail avec les embryons de poisson-zèbre décrites dans ce protocole sont conformes à la directive européenne 2010/63/UE et aux directives du ministère de l’Intérieur dans le cadre de la licence de projet PP6020928.

1. Obtention d’embryons de poisson-zèbre pour la greffe de perles

1. Franchissez la ligne de poisson-zèbre appropriée et faites pousser les embryons dans le milieu de Danieau à 28,5 °C. Pour des instructions plus détaillées sur le croisement des lignes de poisson-zèbre, reportez-vous à la base de données JoVE Science Education²⁷....

Results

Des exemples de greffes de billes réussies sont présentés dans la figure 3, la vidéo 3 et la vidéo 4. La perle magnétique a été correctement positionnée dans l’oreillette du cœur du poisson zèbre, ce qui a permis une circulation sanguine sans obstruction et aucune hémorragie observée. De plus, les parois du cœur ont conservé leur intégrité structurelle sans s’effondrer (Figure 3 et Vidéo 3). Après 24 heures, l’e.......

Discussion

Étapes critiques du protocole et dépannage

Montage d’embryons de poisson-zèbre

La quantité d’agarose utilisée pour monter les embryons est importante. Le dôme formé ne doit pas être excessivement grand, car cela peut entraver la manipulation de la perle de la surface vers les embryons. À l’inverse, il ne doit pas être trop petit ; Le fait d’avoir plusieurs billes au sommet de l’agarose, pos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériaux
Équipement essentiel pour l’élevage, la reproduction et la collecte d’embryons
Plat à fond de verre (35 mm x 15  ; mm)	VWR International	734-2905
Bloc chauffant	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Pince de bijoutier	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont n° 5, L 4 1/4 po, Alliage d’inox
Tubes à microcentrifuger 2 mL	Pipette
Pasteur
Stéréomicroscope
réactifs
4 mg/mL solution
milieu de Danieau (solution mère 60x)
PureCube Glutathion MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phényl-2-thiourée)	Sigma-Aldrich	P7629
Agarose à bas point de fusion UltraPure	Invitrogen	16520-050
Danieau’s medium (solution mère 60x)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2· ; 2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9,78 g MgCl2· ; 6H2O  ;	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissoudre les ingrédients dans H2O jusqu’à un volume final de 2 L. Ajuster le pH à 7,2 à l’aide de NaOH, puis d’un autoclave.
4 mg/mL de solution mère de tricaïne
400 mg de poudre de tricaïne (sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate)	Sigma-Aldrich	A5040
97,9 mL de H2O
2,1 mL 1 M Tris (pH 9)
Ajuster le pH à 7, puis aliquote et stocker à -20 ° ;C.