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Approches de biologie structurale et de chimie analytique pour caractériser les enzymes métaboliques C-glycosides dans le microbiote intestinal humain

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DOI :

10.3791/67629

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23 mai 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Des études récentes mettent en évidence le rôle des enzymes du microbiote intestinal humain dans le métabolisme des C-glycosides. Nous présentons ici une méthodologie complète intégrant les techniques de chimie analytique (LC-MS/MS et RMN) aux approches de biologie structurale pour caractériser systématiquement les chaînes réactionnelles structurales et enzymatiques de ces enzymes métabolisantes des C-glycosides.

Résumé

Le microbiote intestinal est devenu un modulateur clé de la santé de l’hôte, notamment en raison de sa capacité à métaboliser les glycosides alimentaires. Alors que les glycosides C présentent une stabilité chimique et une résistance au clivage enzymatique supérieures à celles des glycosides O, des bactéries intestinales spécialisées peuvent les métaboliser de manière sélective, améliorant ainsi leur biodisponibilité. Depuis l’identification des enzymes microbiennes C-glycosidase, les mécanismes de réaction précis restent incomplètement compris, et les méthodologies standardisées pour étudier ces processus ne sont pas encore bien établies. Pour combler cette lacune, nous avons introduit une approche multidisciplinaire intégrée combinant la biologie structurale, l’enzymologie et des techniques analytiques, y compris la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN), afin de caractériser systématiquement ces activités enzymatiques. Cette approche complète permet une caractérisation précise du métabolisme des glycosides C aux niveaux moléculaire, enzymatique et métabolique.

Introduction

Récemment, le microbiote intestinal humain a fait l’objet d’une attention considérable pour son rôle crucial dans le soutien de la santé de l’hôte 1,2. Ces communautés microbiennes métabolisent des composés dérivés de l’hôte, produisant des métabolites biologiquement actifs 1,2,3. Par exemple, les flavonoïdes, parmi les composés naturels les plus abondants dans notre alimentation quotidienne, existent principalement sous forme de glycosides O ou C, qui sont eux-mêmes mal absorbés dans l’intestin humain4. Cependant, le microbiote intestinal peut transformer ces glycosides en dérivés plus bioactifs, tels que des glycosides secondaires ou des aglycones, réduisant ainsi leur solubilité et améliorant leur absorption, améliorant ainsi leurs bioactivités par rapport à leurs formes natives 5,6.

Historiquement, les mécanismes d’hydrolyse des O-glycosides ont été largement étudiés 7,8. Les glycosides C, caractérisés par leurs liaisons glycosidiques C-C, présentent une plus grande stabilité chimique et une résistance au clivage 9,10. Malgré cela, certaines bactéries intestinales ont développé la capacité de déglycosyler les C-glycosides11,12. En 1988, Hattori et al. ont démontré pour la première fois que certaines bactéries intestinales pouvaient éliminer les groupes glycosyles des C-glycosides 13. Des études ultérieures ont isolé la première souche bactérienne capable de cette activité, ce qui a permis d’explorer davantage les mécanismes de clivage des glycosides C 14. À ce jour, cependant, seul un nombre limité de souches bactériennes intestinales et d’enzymes métabolisantes des glycosides C ont été identifiées et caractérisées 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Des études récentes ont montré que les enzymes de déglycosylation de la puérarine (daidzéine-8-C-glucoside) (DgpA/B/C) de la souche PUE sont capables de cliver la puéraline en daidzéine et en glucose par un processus en deux étapes : la DgpA, une oxydoréductase de la famille Gfo/Idh/MocA, oxyde la puérarine en 3''-oxo-puérane, qui subit ensuite une réaction de β-élimination médiée par le complexe DgpB/C pour produire l’aglycone et le glucose 10, 26. Planche à outils Néanmoins, les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des enzymes métabolisantes des glycosides C, en particulier le système DgpA/B/C, restent incomplètement comprises, et il est nécessaire de disposer de méthodologies plus avancées, en particulier l’intégration de stratégies biologiques et chimiques, pour faire avancer la recherche dans ce domaine24.

Pour combler cette lacune, nous utilisons des approches multidisciplinaires intégrées pour étudier la réaction métabolique du glycoside C catalysée par le microbiote intestinal humain DgpA/B/C. Dans cette réaction, DgpA catalyse l’oxydation glycosylique des C-glycosides, par la suite, DgpB et DgpC forment un complexe DgpB/C qui clive spécifiquement les produits C-glycosides oxydés 10,26,27. Nous avons d’abord effectué l’expression recombinante et la purification de DgpA et de DgpB/C séparément. Les protéines DgpA et DgpB/C purifiées ont ensuite été cristallisées, et leurs structures tridimensionnelles ont été déterminées par cristallographie aux rayons X. Enfin, nous avons reconstitué la fonction de clivage du glycoside C à l’aide du système enzymatique complet DgpA/B/C, avec une analyse complète du produit métabolique réalisée par LC-MS/MS couplée et spectroscopie RMN27. Sur la base de ces approches, nous avons étudié le métabolisme des glycosides C catalysé par le système enzymatique DgpA/B/C.

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Protocole

1. Production et purification des protéines

  1. Construction du vecteur d’expression
    REMARQUE : Dans cette étude, les gènes DgpA, DgpB et DgpC du microbiote intestinal humain, souche PUE , servent de système modèle. La première étape consiste à utiliser des plasmides d’expression pour produire les protéines recombinantes correspondantes.
    1. Obtenez la séquence du groupe de gènes DgpA/B/C (GenBank : LC422372.1) auprès du NCBI. Ensuite, synthétisez commercialement l’ADN DgpA/B/C et clonez individuellement les gènes DgpA, DgpB et DgpC dans un vecteur pET-28a modifié, qui produira la protéine cible avec le SUMO N-terminal et l’étiquette 6×His (balise His-SUMO)28.
    2. Transformez chacun des plasmides DgpA, DgpB ou DgpC en cellules compétentes pour E. coli BL21 (DE3). Par la suite, cultiver des bactéries dans un milieu LB avec 50 μg/mL de kanamycine à 37 °C.
    3. Ajouter 0,2 mM d’IPTG au milieu lorsque la densité bactérienne (OD600) atteint 0,6. Cultivez les bactéries à 16 °C pendant 16 h.
    4. Centrifuger chacun des DgpA, DgpB et DgpC exprimant une culture bactérienne à 4 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de tampon A (tableau 1) pour 1 L de culture bactérienne.
  2. Purification des protéines
    REMARQUE : Des quantités suffisantes d’enzymes recombinantes de haute pureté sont essentielles pour la caractérisation fonctionnelle et les études de biologie structurale. DgpB et DgpC forment un complexe protéique stable (forme spontanément le complexe DgpB/C pendant le processus de lyse) pour la fonctionnalité10,26. La purification de la protéine DgpA et du complexe DgpB/C est ensuite effectuée.
    1. Ajouter 1 mM de PMSF à la remise en suspension bactérienne. Mélangez les suspensions bactériennes DgpB et DgpC de l’étape 1.1.4, puis lysez la suspension bactérienne DgpA ou le mélange DgpB et DgpC (pour former un complexe DgpB/C fonctionnel) à l’aide d’un perturbateur cellulaire à ultrasons.
    2. Centrifuger le lysat bactérien à 48 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Conservez le surnageant contenant la protéine et jetez la pastille bactérienne.
    3. Purifier le complexe DgpA ou DgpB/C du surnageant à l’aide d’une colonne de chromatographie d’affinité nickel (Ni-NTA). Éluer les protéines liées en appliquant un gradient de concentration d’imidazole de 0 à 50 % avec le tampon A et le tampon B (tableau 1) dans le purificateur ÄKTA.
    4. Prélever 10 μL d’échantillons élués et les mélanger avec 2 μL de colorant protéique 5 ×, puis effectuer une électrophorèse SDS-PAGE à 220 V pendant 45 min à l’aide d’un système d’électrophorèse vertical, suivie d’une coloration au bleu de Coomassie pour visualiser les bandes protéiques. Collecter des fractions contenant du DgpA ou le complexe DgpB/C sur la base de l’analyse SDS-PAGE pour une utilisation future.
      REMARQUE : Le DgpA (44 kDa) avec une bande His-SUMO (17 kDa) migre à environ 61 kDa (Figure 2D), tandis que DgpC (33 kDa) avec une balise His-SUMO (17 kDa) migre autour de 50 kDa, et DgpB (15 kDa) avec une balise His-SUMO (17 kDa) migre autour de 33 kDa (Figure 2J).
    5. Dialyser les échantillons du complexe DgpA ou DgpB/C à partir de l’étape 1.2.3 à l’aide d’une membrane de dialyse de coupure de poids moléculaire de 10 kDa contre le tampon C pour éliminer l’imidazole, et avec la protéase 1 de type ubiquitine (ULP1 ; Table des matériaux) enzyme pour retirer l’étiquette His-SUMO29.
    6. Chargez l’échantillon de protéine dialysée dans le tampon C (Tableau 1) à travers la colonne de chromatographie échangeuse d’ions (colonne Q). Ensuite, éluer la protéine liée de la colonne à l’aide d’un gradient de concentration en chlorure de sodium allant de 100 mM à 600 mM, préparé avec le tampon C et le tampon D (tableau 1) dans le purificateur ÄKTA.
    7. Effectuer l’analyse SDS-PAGE de DgpA et du complexe DgpB/C élué de la colonne Q à l’étape 1.2.3, en notant les masses moléculaires : balise His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), bandes oligomères de DgpA (au-dessus de 95 kDa) (Figure 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), bandes oligomères de DgpB et DgpC (entre 53 kDa et 95 kDa) (Figure 2K).
    8. Purifier la protéine à l’aide d’une colonne d’exclusion stérique (SEC) avec le tampon E (tableau 1). Effectuer une analyse SDS-PAGE à l’aide de protéines de la fraction d’élution, suivie d’une coloration au bleu de Coomassie pour visualiser les bandes de protéines. Collecter les fractions contenant la protéine cible DgpA ou le complexe DgpB/C après analyse par SDS-PAGE.
      REMARQUE : La bande DgpA est d’environ 44 kDa avec une bande DgpA oligomérisée supérieure à 95 kDa (Figure 2F), tandis que DgpC est à environ 33 kDa, et DgpB est à environ 15 kDa avec DgpB et DgpC oligomérisés (entre 53 kDa et 95 kDa) (Figure 2L).
    9. Mesurez la concentration protéique de DgpA ou du complexe DgpB/C à l’aide d’une nanogoutte à 280 nm. Ensuite, concentrez le complexe DgpA ou DgpB/C à environ 20 mg/mL avec des tubes d’ultrafiltration, aliquotez-les et congelez-les avec de l’azote liquide. Stockez le DgpA ou le complexe DgpB/C à -80 °C pour une utilisation future.
  3. Collecte de données spectrales sur le dichroïsme circulaire (CD)
    REMARQUE : Étant donné que l’oxydation du glycosyle catalysée par la DgpA sert d’étape d’initiation cruciale dans la voie métabolique, la spectroscopie CD a été spécifiquement utilisée pour vérifier à la fois l’état de repliement approprié et l’intégrité structurelle secondaire de la DgpA. Ces paramètres structurels sont d’une importance cruciale pour l’activité enzymatique et la cristallisation réussie des protéines.
    1. Diluer la protéine DgpA à 0,2 mg/mL avec 1 tampon PBS (pH 7,4) (tableau 1).
    2. Chargez 1 tampon PBS (pH 7,4) dans une cuvette à quartz et enregistrez le spectre CD de référence sur 200 à 260 nm à l’aide d’un spectromètre CD pour détecter avec sensibilité les différences de structure secondaire et d’état de repliement27.
    3. Remplacez la cuvette tampon par des échantillons de protéines de la version 1.3.1, enregistrez le spectre CD sur 200 à 260 nm et soustrayez la ligne de base du tampon pour obtenir le spectre CD de l’échantillon de protéines.
    4. Collectez trois balayages pour en vérifier la précision et analysez les données pour les caractéristiques de la structure secondaire et l’état de repliement des protéines (Figure 3G, 3H).

2. Cristallographie des protéines et détermination de la structure

REMARQUE : Après avoir confirmé que DgpA maintenait un pliage et une intégrité structurelle appropriés, des approches de biologie structurale ont été utilisées pour déterminer les structures tridimensionnelles des deux DgpA. Étant donné que la compétence catalytique du complexe DgpB/C avait été confirmée biochimiquement par des tests fonctionnels précédents 10,26,27, l’étape de vérification spectrale CD a été omise.

  1. Croissance et optimisation des cristaux de protéines
    1. Mélanger 0,5 μL de DgpA purifié (20 mg/mL) ou de complexe DgpB/C (20 mg/mL) avec un volume égal (0,5 μL) de solution réservoir provenant de kits de cristallisation sur des plaques cristallines à 48 puits selon la méthode30. Transférez les plaques de cristaux à 16 °C pour la croissance des cristaux.
      REMARQUE : Observez ces gouttes assises avec un microscope pour identifier les conditions (y compris la concentration en protéines et les précipitants, tels que le PEG 3350, le formiate de magnésium, etc.) pour la croissance cristalline complexe DgpA ou DgpB/C.
    2. Effectuez l’optimisation de la cristallisation pour le DgpA et le complexe DgpB/C à l’aide de la méthode de diffusion de vapeur suspendue30.
    3. Pour le DgpA, commencer par la condition identifiée à l’étape 2.1.1 (20 mM de formiate de magnésium, 20 % PEG3350) et appliquer une approche d’optimisation orthogonale en testant six gradients de concentration de PEG3350 (17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 % et 22 %) par rapport à quatre gradients de concentration de formiate de magnésium (16 mM, 18 mM, 20 mM et 22 mM)30.
    4. Préparez les gouttes de cristallisation en mélangeant 0,8 μL de solution protéique DgpA (10 ou 20 mg/mL) avec 0,8 μL de solution réservoir sur des lamelles de verre silanisé. Ensuite, retournez les lamelles sur des plaques de cristallisation à 24 puits et incubez à 16 °C pour la croissance cristalline.
    5. Pour l’optimisation du complexe DgpB/C, suivez la même approche : mélangez 0,8 μL de complexe protéique (10 ou 20 mg/mL) avec 0,8 μL de solution réservoir contenant de l’acétate de magnésium (16, 18, 20 ou 22 mM) et du PEG 8000 (8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 % ou 13 %). De même, installez des gouttes suspendues sur des lamelles silanisées sur des plaques de 24 puits et incubez à 16°C.
    6. Laissez les cristaux de protéines du complexe DgpA et DgpB/C croître jusqu’à ce qu’ils cessent de croître, puis transférez les cristaux dans une solution de trempage contenant un tampon réservoir et 5 mM des composés du substrat (glucose et puérane) du complexe DgpA et DgpB/C à 16 °C pendant 30 min.
    7. Transférez les cristaux, y compris le complexe DgpA (avec glucose ou sans substrat) et le complexe DgpB/C (sans substrat), dans une solution cryoprotectrice contenant le tampon de trempage complété par 25 % de glycérol et stockez-les immédiatement dans de l’azote liquide pour la collecte de données.
      REMARQUE : Bien que les cristaux de DgpA et du complexe DgpB/C aient été imbibés de substrats (glucose et puérarin), seul le glucose a été incorporé avec succès dans le centre catalytique de DgpA. Par conséquent, trois formes cristallines distinctes ont été obtenues pour l’analyse structurale : DgpA avec glucose (Figure 3E) ; DgpA sans substrat (figure 3B-C) ; et complexe DgpB/C sans substrat (Figure 3D). La solution cryoprotectrice protège les cristaux de protéines en empêchant la formation de glace lors du refroidissement instantané dans l’azote liquide, préservant ainsi leur intégrité structurelle et minimisant les dommages induits par les radiations. Généralement formulée à partir de la liqueur mère comme base, la solution est complétée par des concentrations optimisées de cryoprotecteurs (par exemple, le glycérol ou l’éthylène glycol).
  2. Collecte de données et détermination de la structure
    1. Collecter les données de diffraction des rayons X du cristal pour le DgpA avec du glucose ou sous des formes sans substrat, et le complexe DgpB/C sous forme sans substrat à l’installation de rayonnement synchrotron de Shanghai (SSRF) de l’installation nationale de science des protéines de Shanghai (NFPS) avec une longueur d’onde incidente de 0,978 Å.
    2. Traiter les trois ensembles de données de diffraction des rayons X, y compris le complexe DgpA et DgpB/C, à l’aide d’un logiciel de traitement de données cristallographiques31. Tout d’abord, chargez les données brutes, puis exécutez séquentiellement les fonctions d’indexation, d’intégration et de mise à l’échelle en cliquant sur les boutons correspondants dans le logiciel. Générez un fichier de sortie traité (output.sca) adapté à la détermination ultérieure de la structure.
    3. Déterminer les structures de DgpA avec du glucose ou sous des formes sans substrat (Figure 3B-C, 3E), et du complexe DgpB/C sans substrat (Figure 3D) à l’aide de la méthode de remplacement moléculaire (Tableau des matériaux). Ensuite, affinez les structures et les cartes électroniques en incorporant des ligands pertinents (tels que le glucose, Mn2+, H2O, etc.)31. Planche à billets

3. Surveillance de l’activité réactionnelle et détermination des paramètres cinétiques

REMARQUE : Le système DgpA/B/C médie les transformations du C-glycoside par le biais d’une cascade définie en deux étapes : DgpA initie la catalyse en oxydant la fraction sucre, générant un intermédiaire que le complexe DgpB/C clive ou isomérise par la suite 10,26,27. Dans cette étude, DgpA/B/C fait référence aux enzymes responsables de cette cascade de réactions, alors qu’il convient de noter qu’aucune interaction directe ne se produit entre DgpA et le complexe DgpB/C. Cette activité couplée peut être rigoureusement quantifiée à l’aide de trois approches complémentaires : l’analyse de produits HPLC, les tests spectrophotométriques couplés à la DCPIP surveillant le transfert d’électrons, ou la caractérisation cinétique détaillée des paramètres de réaction27,32. Plus précisément, les produits de clivage du glycoside C (daidzéine) générés par la catalyse DgpA/B/C ont été analysés par HPLC (détection UV à 265 nm). La formation du produit a été quantifiée à l’aide d’une courbe d’étalonnage standard (la méthode d’établissement de la courbe standard est décrite en détail dans la note à l’étape 3.3.2), et les paramètres cinétiques ont été déterminés en ajustant les taux de formation du produit au modèle de Michaelis-Menten au moyen d’une analyse de régression non linéaire27,32. Le test d’inhibition mesurant l’effet du glucose sur le clivage de la liaison C-glycosidique puérarine a fourni des preuves corroborantes que les saccharides peuvent servir de substrats pour la DgpA. Par la suite, le test DCPIP surveille les réactions d’oxydation des sucres en mesurant la réduction du 2,6-dichlorophénolindophénol de couleur bleue (DCPIP) en leuco-DCPIP incolore car il accepte les électrons des sucres oxydés33, reflétant ainsi l’activité catalytique de DgpA.

  1. Surveillance de l’activité DgpA/B/C par HPLC
    1. Effectuer la réaction de clivage ou d’isomérisation du C-glycoside catalysée par DgpA/B/C dans 500 μL de tampon F (tableau 1) contenant 20 μM de DgpA et de complexe DgpB/C (à l’étape 1.2.7) et 0,1 mM de l’une ou l’autre des substances suivantes : puérarine ou génistéine-8-C-glucoside pour les réactions de clivage, ou daidzine ou génistine pour les réactions d’isomérisation27. Effectuer les réactions à 37 °C pendant 8 h et les terminer en ajoutant 1,5 mL de méthanol au mélange réactionnel.
    2. Centrifuger la solution réactionnelle à 16 000 × g pendant 15 minutes pour éliminer le précipité protéique formé par la dénaturation enzymatique induite par le méthanol. Filtrer le surnageant à l’aide d’une membrane filtrante de 0,22 μm.
    3. Effectuez une analyse HPLC avec élution de gradient, à un débit de 1 mL/min avec un volume d’injection de 10 μL et une longueur d’onde de détection de 265 nm.
      REMARQUE : Les phases mobiles étaient l’acétonitrile (phase mobile A) et l’acide acétique aqueux à 0,1 % (phase mobile B), avec élution en gradient. Le gradient de l’élution en phase mobile est le suivant : 5 %-20 % A à 0-5 min, 20 %-45 % A à 5-15 min, 45 %-52 % A à 15-18 min, 52 %-55 % A à 18-19 min, 55 %-5 % A à 19-21 min et 5 % A à 21-23 min. Le système enzymatique DgpA/B/C présente des efficacités catalytiques nettement différentes envers des substrats tels que la daidzine et la génistine, ce qui entraîne des variations substantielles dans leurs taux de formation de produits respectifs. Pour évaluer quantitativement la cinétique de conversion du substrat et la dynamique d’accumulation du produit, une analyse complète de l’évolution temporelle a été effectuée à l’aide de la HPLC à des intervalles de 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 et 48 h.
  2. Surveillance de l’activité de la DgpA à l’aide d’un dosage du 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP)
    REMARQUE : Le test DCPIP surveille l’oxydation du sucre en mesurant la réduction du DCPIP bleu en leuco-DCPIP incolore car il accepte les électrons des sucres oxydés33. Ici, le test de rapporteur DCIPIP a été utilisé pour enregistrer l’activité d’oxydation de la DgpA vers différents composés glycosylés, monosaccharides, disaccharides ou polysaccharides. Le DgpA de type sauvage et ses mutants défectueux de liaison au sucre, notamment D182A, Δ(308-316) et Δ(311-316), ont été utilisés27.
    1. Incuber 0,8 mM de DCPIP, protéine 50 μM, y compris la DgpA de type sauvage et ses trois mutants défectueux de liaison au sucre (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) ou DgpA Δ(311-316)), avec des substrats de 10 mM, y compris la puéraline, la vitexine, la génistine, l’amidon soluble, le maltotroise, le lactose, le saccharose, le glucose ou le maltose dans 1 tampon PBS (pH 7,4).
    2. Après 20 h de réaction, enregistrer la variation de l’absorbance du DCPIP à 600 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques33.
  3. Détermination du taux d’inhibition du glucose sur la réaction de clivage de la liaison glycosidique C-de la puérarine
    REMARQUE : DgpA appartient à la famille des enzymes de l’oxydoréductase du sucre, capable d’oxyder la fraction sucre des glycosides C. La figure 3E montre que le glucose est lié au centre catalytique de la DgpA, et le protocole pour déterminer la structure de la DgpA est détaillé à l’étape 2.2.3. Pour examiner la liaison compétitive de la DgpA entre le glucose et le glycoside C puérarine, les expériences suivantes ont été menées.
    1. Effectuer la réaction dans 1 tampon PBS × (pH 7,4). Ajouter différentes concentrations de glucose (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM et 100 mM) au système de réaction de clivage du glycoside C (puérane) comme décrit à l’étape 3.1. Effectuez la réaction à 37 °C pendant 12 h.
    2. Effectuer une analyse quantitative du produit (daidzein) à l’aide de la courbe d’étalonnage HPLC pour le composé de référence (daidzein standard). Calculez le taux d’inhibition en déterminant d’abord la différence de rendement du produit entre les réactions contenant des concentrations de glucose variables et les réactions de clivage du glycoside C non inhibées (sans glucose), puis en divisant cette différence par le rendement du produit de la réaction non inhibée.
      REMARQUE : Pour générer une courbe d’étalonnage pour l’analyse quantitative HPLC, préparez une dilution en série d’un étalon de référence (p. ex., puérarine ou daidzéine) sur une plage de concentration (p. ex., 0,1-1 mM, par incréments de 0,1 mM). Analysez chaque concentration par HPLC, enregistrez les zones de pic et comparez-les aux concentrations standard correspondantes. Effectuez une analyse de régression linéaire (y = mx + b, où y = surface du pic, x = concentration) pour établir la courbe standard. L’équation de régression peut ensuite être utilisée pour interpoler des concentrations d’échantillons inconnues à partir de leurs zones de pic mesurées.
  4. Détermination des paramètres cinétiques
    REMARQUE : Les paramètres cinétiques sont largement reconnus comme des étalons-or critiques pour l’évaluation quantitative de l’efficacité catalytique enzymatique. Pour évaluer quantitativement les réactions catalysées par DgpA/B/C, les paramètres cinétiques des réactions de clivage puérarine du glycoside C catalysées par DgpA/B/C ont été déterminés.
    1. Préparez des gradients de concentration de C-glycoside (puérane) du substrat (allant de 0,01 à 4 mM par incréments de 2) pour la réaction de clivage du C-glycoside catalysée par DgpA/B/C.
    2. Effectuer la réaction à 37 °C pendant 8 h selon la méthode décrite à l’étape 3.1. Effectuer une analyse quantitative du produit (daidzéine) à l’aide de la courbe d’étalonnage HPLC de la daidzéine standard. Calculez ensuite la vitesse de réaction (taux de formation du produit) en divisant la quantité quantifiée par le temps de réaction.
    3. Déterminez les paramètres cinétiques Km et kcat en ajustant la vitesse de réaction calculée et la concentration du substrat au modèle de Michaelis-Menten à l’aide d’un logiciel statistique (Table des matériaux).

4. Préparation et détection du produit intermédiaire de réaction

REMARQUE : Au-delà de l’activité de clivage du glycoside C, le DgpA/B/C catalyse également l’isomérisation des O-glycosides en C-glycosides. Par conséquent, lorsque les O-glycosides sont utilisés comme substrats pour le DgpA/B/C, les produits intermédiaires seront produits sous forme de C-glycosides isomérisés. Pour caractériser le produit intermédiaire (puérane), le composé intermédiaire a été purifié puis analysé à l’aide d’outils de chimie analytique, notamment la spectroscopie LC-MS/MS et RMN.

  1. Préparation d’un produit intermédiaire réactionnel dans une réaction d’isomérisation du C-glycoside catalysée par DgpA/B/C 27
    1. Préparez la réaction d’isomérisation des glycosides O à C catalysée par DgpA/B/C en utilisant 0,2 mM d’O-glycoside (daidzine) comme substrats et un complexe DgpA et DgpB/C de 20 μM dans un volume de réaction de 90 mL, en suivant le protocole décrit à l’étape 3.1 ci-dessus.
    2. Purifier le produit intermédiaire C-glycoside (puérane) à l’aide d’une HPLC préparative au niveau de la stratégie d’élution en gradient (NOTE).
      REMARQUE : Les phases mobiles étaient l’acétonitrile (phase mobile A) et l’acide acétique aqueux à 0,1 % (phase mobile B), avec élution en gradient. Le gradient de l’élution en phase mobile est le suivant : 5 %-20 % A à 0-5 min, 20 %-45 % A à 5-15 min, 45 %-52 % A à 15-18 min, 52 %-55 % A à 18-19 min, 55 %-5 % A à 19-21 min et 5 % A à 21-23 min.
    3. Calculer la concentration du produit intermédiaire purifié à l’aide de la courbe HPLC d’étalonnage standard à l’étape 3.3.2, obtenir environ 6 mg de puérarin dans le système réactionnel de 90 mL à l’étape 4.1.1, puis sécher les produits intermédiaires purifiés à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide pour une utilisation ultérieure.
  2. Caractérisation d’un produit intermédiaire réactionnel par LC-MS/MS
    1. Récupérez les produits intermédiaires séchés à partir de l’étape 4.1.3. Peser 100 μg des intermédiaires dérivés de la daidzine, puis les dissoudre dans 2 mL de méthanol pour atteindre une concentration finale de 50 μg/mL. Centrifuger à 13 500 x g pendant 10 min et prélever le surnageant pour l’analyse LC-MS/MS.
    2. Utilisez le même programme d’élution de gradient HPLC à l’étape 4.1.2 pour l’analyse LC-MS/MS avec un volume d’injection de 5 μL.
  3. Caractérisation d’un produit intermédiaire réactionnel par RMN
    1. Dissoudre 4 mg des produits intermédiaires purifiés de la réaction de daidzine dans 340 μL de diméthylsulfoxyde-d 6 pour une spectroscopie RMN 1H et 13C. Réglez les paramètres de l’instrument comme suit : température à 298 K, cale 3 fois, largeur d’impulsion 18 μs, retard de relaxation 1,5 s, 48 balayages, avec les autres paramètres sur les réglages par défaut27.
    2. Collecter les spectres RMN 1H et 13C à l’aide d’un instrument RMN 600 MHz.

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Résultats

En suivant les procédures décrites dans Graphique 1, nous avons d’abord exprimé les gènes DgpA, DgpB et DgpC dans E. coli Cellules BL21(DE3). Puisque DgpB et DgpC forment un complexe enzymatique stable (complexe DgpB/C)10,26,27,34, des cellules exprimant ces deux protéines ont été combinées pour la co-purification. Après ly...

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Discussion

À l’heure actuelle, les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des enzymes métaboliques des glycosides C sur le terrain restent incertaines, et les méthodes de recherche appropriées font défaut 10,24,26. En tirant parti des avantages significatifs de la chimie et de la biotechnologiecombinées 40,41,42,43,44,45

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Cette étude est financée par le programme de fonds de démarrage de l’Université de médecine chinoise de Pékin (BUCM) (90011451310011) à W.M., le programme de fonds d’urgence contre le COVID-19 à BUCM (1000061223476) à W.M., l’équipe d’innovation et le programme de culture des talents de l’administration nationale de la médecine traditionnelle chinoise (ZYYCXTD-C-202006) à W.M. et le projet de recherche indépendant pour les étudiants diplômés de BUCM(ZJKT2023012) à H.P. Nous remercions tous les membres du laboratoire de Wenfu Ma pour la discussion utile.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,6-dichloroindophénol (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-Mercaptoethanol(&beta ;-ME)Sigma-Aldrich08168
  ; 5 × ; Colorant de charge protéiqueSangon BiotechC508320
Acide acétiqueShanghai MACKLIN A111247
AcétonitrileThermo Fisher Scientific&trade ;? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz Spectromètre RMNBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifugeuse 5424REppendorf022620601
Chirascan&trade ; plus Spectromètre CDPhotophysique appliquéeChirascan&trade ;   ;
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) cellules compétentesThermo Fisher Scientific&trade ;? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersion? Prism 9Calculer les paramètres cinétiques Km et kcat
Colonnes SEC préparatives HiLoad Superdex 200 pgCytiva28989335
HisTrap HP His tag Colonnes de purification de protéinesCytiva17524802
HiTrap Q FF Colonne de chromatographie par échange d’anionsCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  ; version 723
Colonne HPLC TC-C18(2), 170Å ;, 5 & micro ; m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside ? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT, chromatographie liquide haute performanceShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
Chlorure de manganèseShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MéthanolThermo Fisher Scientific&trade ;? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 StéréomicroscopeOLYMPUS  ;SZX7
fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)Sigma-AldrichP7626  ;
PhenixL’équipe de développement de Phenix1.21.2Phenix est une suite logicielle complète pour la détermination de la structure des cristaux de protéines, intégrant les méthodes SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) et MR (Molecular Replacement) avec le logiciel Phaser.
Chromatographe liquide préparatif à haute performanceWaters2545/2998
Kit de criblage de cristaux de protéinesHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Incubateur à secoussesShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ; ZQZY-AF8
SnakeSkin&trade ; Membrane de dialyse, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific&trade ;? Invitrogen88245
Amidon solubleSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 CentrifugeuseSuperspeed Thermo Fisher Scientific&trade ;
SpectraMax i3x Lecteur multimode de microplaquesDISPOSITIFS MOLÉCULAIRESSpectraMax i3x  ;
Spectrophotomètre micro-volume SpectraMax QuickDrop SpécificationsDISPOSITIFSMOLÉCULAIRES QuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD PrepColumn Waters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific&trade ;? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Protéase de type ubiquitine 1Thermo Fisher Scientific&trade ;? Invitrogen12588018
Congélateur ultra basse températureThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Concentrateur centrifuge sous videBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Références

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M tabolisme des C glycosidesenzymes du microbiote intestinalcristallographie des prot inesanalyse par LC MSspectroscopie RMNcin tique enzymatiquepurification par chromatographiem tabolisme des flavono des

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