Modèle 2.5D pour la caractérisation mécanique ex vivo de l’angiogenèse germinative dans les tissus vivants

Résumé

L’angiogenèse germinative, fondamentale pour le développement et la maladie, implique des processus moléculaires et mécaniques complexes. Nous présentons un modèle 2,5D ex vivo polyvalent qui analyse la germination cellulaire des artères carotides porcines, révélant l’angiogenèse dépendante de la rigidité et la mécanique cellulaire distincte leader-follower. Ce modèle aide à faire progresser les stratégies d’ingénierie tissulaire et les approches de thérapie contre le cancer.

Résumé

L’angiogenèse germinative est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un système vasculaire préexistant et est d’une grande importance pour les processus physiologiques tels que la croissance et la réparation des tissus et les processus pathologiques, y compris le cancer et les métastases. Le processus en plusieurs étapes de l’angiogenèse germinative est un processus moléculaire et mécanique. Il consiste en l’induction de la germination cellulaire par le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, la sélection des cellules leaders/suiveuses par la signalisation Notch, la migration dirigée des cellules endothéliales, ainsi que la fusion et la stabilisation des vaisseaux. Une variété de modèles d’angiogenèse par germination ont été développés au fil des ans pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la germination cellulaire. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension des facteurs moléculaires de l’angiogenèse germinative, le rôle des indices mécaniques et le moteur mécanique de l’angiogenèse germinative restent sous-explorés en raison des limites des modèles existants. Dans cette étude, nous avons conçu un modèle ex vivo 2,5D qui nous permet de caractériser mécaniquement la germination cellulaire d’une artère carotide porcine à l’aide de la microscopie à force de traction. Le modèle identifie des modèles de force distincts au sein de la germination, où les cellules leaders exercent des forces de traction et les cellules suiveuses exercent des forces de poussée sur la matrice. La polyvalence du modèle permet de manipuler des indices chimiques et mécaniques, tels que la rigidité de la matrice, ce qui renforce sa pertinence dans divers microenvironnements. Ici, nous démontrons que le début de l’angiogenèse germinative dépend de la rigidité. Le modèle 2.5D présenté pour quantifier les forces de traction cellulaire dans l’angiogenèse germinative offre une méthode simplifiée mais physiologiquement pertinente, améliorant notre compréhension des réponses cellulaires aux signaux mécaniques, ce qui pourrait faire progresser l’ingénierie tissulaire et les stratégies thérapeutiques contre l’angiogenèse tumorale.

Introduction

L’angiogenèse est le processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. Ce processus est essentiel au cours du développement embryonnaire, de la cicatrisation des plaies et de la progression du cancer, qui sont tous associés à des changements biomécaniques dans le microenvironnement 1,2,3,4. Au début de l’angiogenèse, les tissus hypoxiques ou lésés libèrent le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) qui activera les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins voisins pour former des pousses endothéliales - où deux phénotypes distincts de leader et de suiveur sont adoptés par la voie de signalisation moléculaire Notch⁵. Lors de la formation de pousses endothéliales, un phénomène connu sous le nom d’angiogenèse germinative, les cellules leaders dégradent la matrice extracellulaire environnante pour migrer collectivement vers le stimulus VEGF sans perdre les adhésions cellule-cellule avec les cellules suiveuses ^6,7.

Au cours des dernières décennies, il y a eu un nombre croissant de tests d’angiogenèse par germination décrits qui étudient la migration cellulaire collective à l’aide de diverses méthodologies, chacune offrant des avantages et des limites distincts. Ces tests évaluent le mouvement coordonné de groupes de cellules, telles que les cellules endothéliales, à travers des matrices 3D, ce qui permet d’étudier les comportements cellulaires tels que la germination, l’invasion et la migration collective dans un environnement contrôlé ^8,9,10. Les essais d’angiogenèse in vivo fournissent une évaluation complète au sein d’un organisme vivant, en capturant des interactions complexes, mais ils prennent du temps, sont coûteux, sujets à une grande variabilité et difficiles à quantifier^11,12. Les essais d’angiogenèse par germination in vitro permettent un contrôle précis des conditions expérimentales avec une reproductibilité élevée et une quantification précise, mais peuvent ne pas reproduire entièrement les complexités in vivo 11,12,13. En revanche, les essais d’angiogenèse ex vivo, dont l’essai de l’anneau aortique est le modèle le plus largement réalisé, utilisent des tissus extérieurs à l’organisme, préservant ainsi la pertinence physiologique tout en évitant les complications in vivo 14,15,16. Bien qu’ils soient techniquement difficiles et qu’ils aient parfois du mal à assurer la viabilité des tissus, les modèles ex vivo offrent un équilibre précieux entre complexité et contrôle, ce qui en fait une approche prometteuse pour l’étude de l’angiogenèse germinative. Bien que ces modèles aient été largement utilisés pour étudier les moteurs moléculaires de l’angiogenèse germinative, l’effet des signaux mécaniques et le comportement mécanique des cellules restent mal compris.

La migration multicellulaire au cours de la germination de l’angiogenèse dépend fortement de la mécanique cellulaire, car les forces contractiles basées sur l’actomyosine régulent l’invasion des cellules endothéliales dans la matrice extracellulaire environnante 17,18,19,20. Plus précisément, on a observé que les moteurs non musculaires de la myosine II, les principales machines contractiles à base d’actine dans la cellule²¹, contrôlent les forces contractiles cellulaires pendant l’angiogenèse germinative^22,23. La cellule leader est probablement l’élément générateur de force prédominant de la germination, car les déformations de la matrice extracellulaire 3D environnante sont significativement plus élevées autour de la cellule leader, en particulier les protubérances cellulaires riches en actine^{à proximité 23,24}, par rapport à ses adeptes 22,23,25. Malgré ces preuves croissantes de l’importance de la contractilité cellulaire dans l’angiogenèse germinale en 3D, il n’existe pas de méthode de caractérisation mécanique spatio-temporelle de la mécanique cellulaire de l’angiogenèse germinative.

L’objectif global de cette étude est de développer une méthode permettant la caractérisation mécanique de la migration cellulaire pendant la germination. En réalisant une caractérisation spatio-temporelle des forces mécaniques dans un contexte biologiquement pertinent, nous visons à fournir de nouvelles informations sur la façon dont la mécanique cellulaire influence la formation des germes angiogéniques. À cette fin, nous avons développé un système de modèle 2,5D en créant un hydrogel de polyacrylamide (PAA) 2D, en ensemant une feuille artérielle carotide dessus et en le recouvrant d’une fine couche de gel de collagène de type I pour établir un environnement 3D localisé pour les cellules. Les germes multicellulaires ont migré hors de la feuille artérielle à l’interface entre le gel PAA et le collagène. L’avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes est que l’hydrogel 2D PAA permet des analyses par microscopie à force de traction (TFM) - une technique polyvalente bien connue où les cellules adhèrent à un substrat 2D élastique et vont déformer le substrat sous l’effet des forces de traction cellulaire²⁶. Ces déformations peuvent être capturées et les forces de traction cellulaires peuvent être calculées en fonction des propriétés mécaniques du substrat²⁶. En adaptant la TFM pour une utilisation dans des tissus vivants ex vivo, nous visons à combler le fossé entre le contrôle in vitro et la pertinence in vivo , en fournissant une compréhension plus complète des forces mécaniques au cours de l’angiogenèse.

Protocole

Les artères carotides porcines ont été utilisées dans ce protocole. Des artères carotides porcines ont été prélevées sur des porcs hybrides Dutchrace Landrace - âgés de 5 à 7 mois et pesant (vivants) de 80 à 120 kg - obtenus d’un abattoir local. Les protocoles étaient conformes au règlement CE 1069/2009 concernant le matériel animal d’abattage pour le diagnostic et la recherche, supervisé par le gouvernement néerlandais (ministère néerlandais de l’Agriculture, de la Nature et de la Qualité des aliments) et ont été approuvés par les autorités légales associées du bien-être animal (Food and Consumer Product Safety Authority). L’approbation éthique n’était pas requise puisque les tissus ont été récoltés à partir de sous-produits d’animaux déjà éliminés. Le temps entre la mort et le transport des tissus est de 10 à 25 min, selon l’abattoir.

REMARQUE : Le tableau des matériaux résume les détails sur les matériaux, l’équipement et les réactifs utilisés dans ce protocole. Les protocoles pour les échantillons 2D et 3D sont décrits dans le Dossier supplémentaire 1.

1. Préparation de substrats 2D en polyacrylamide (PAA)

1. Dans la hotte, préparer une solution de liaison-silane en mélangeant de l’éthanol absolu 12:1:1 (pour la synthèse), de l’acide acétique et du liaison-silane à 4286 μL, 357 μL et 357 μL, respectivement. Incuber une solution de 120 μL/puits de liaison-silane sur une plaque à fond de verre à 12 puits pendant 1 h à température ambiante.
   ATTENTION : L’éthanol absolu est un liquide et une vapeur hautement inflammables (H225) et provoque une grave irritation des yeux (H319). L’acide acétique est un liquide et une vapeur inflammables (H226) et provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires (H314). Portez un équipement de protection individuelle et travaillez dans une hotte.
2. Dans la hotte, lavez 3 fois la plaque à fond de verre à 12 puits avec de l’éthanol absolu (industriel) à l’aide d’un flacon pulvérisateur. Jetez l’éthanol.
3. Séchez la plaque à fond de verre à 12 puits avec de l’azote gazeux. Si une glace blanche apparaît sur le dessus du fond de verre, le lavage n’était pas suffisant. Relaver la plaque à fond de verre à 12 puits.
4. Préparez le mélange de gel PAA selon les rapports du tableau 1.
   1. Ajoutez du PBS dans un tube de microcentrifugation et mettez en suspension 40 % d’acrylamide, 2 % de bis-acrylamide et des marqueurs fluorescents dans le mélange de gel. Vortex la solution juste avant la préparation du gel.
   2. Aussi vite que possible, ajoutez 10 % d’APS et de TEMED à la solution et vortex après l’ajout de chaque élément. Pipeter une gouttelette de 11,5 μL de mélange de gel sur le fond en verre de chaque puits et placer délicatement une lamelle de 13 mm sur la gouttelette.
   3. Tapotez doucement et faites tourner la plaque pour répartir uniformément le mélange de gel sous la lamelle. Si des bulles d’air apparaissent, retirez-les en soulevant doucement la lamelle. Laissez les gels polymériser pendant 1 h à température ambiante. Vérifiez la polymérisation à l’aide du mélange de gel restant dans le tube. Les gels PAA polymérisés dans la plaque à 12 puits afficheront un halo interne.
      ATTENTION : L’acrylamide est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation (H302 + H332), provoque une irritation cutanée (H315), peut provoquer une réaction allergique cutanée (H317), provoque une irritation oculaire grave (H319), peut provoquer des anomalies génétiques (H340), peut provoquer un cancer (H350), suspecté de nuire à la fertilité (H361f) et cause des dommages aux organes par une exposition prolongée ou répétée en cas d’ingestion (H372). Le SAPL peut intensifier le feu (oxydant, H272), nocif en cas d’ingestion (H302), provoquer une irritation cutanée (H315), provoquer une réaction allergique cutanée (H317), provoquer une irritation oculaire grave (H319), provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires en cas d’inhalation (H334) et provoquer une irritation respiratoire (H335). TEMED est un liquide et une vapeur hautement inflammables (H225), nocif en cas d’ingestion (H302), provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires (H314) et est toxique en cas d’inhalation (H331). Portez un équipement de protection individuelle.
5. Après la polymérisation, ajoutez du PBS dans le puits. À l’aide d’une pince à épiler et/ou d’une aiguille pliée, soulevez et retirez doucement la lamelle. Lavez les gels une fois dans PBS.
6. Pour faciliter l’enrobage de collagène des gels PAA, les gels doivent être fonctionnalisés à l’aide de l’agent de réticulation Sulfo-SANPAH. Ajouter 75 μL de 1 mg/mL de Sulfo-SANPAH dissous dans de l’eau ultrapure au gel PAA et incuber pendant 5 min sous une lumière UV de 365 nm.
   REMARQUE : Gardez Sulfo-SANPAH à l’abri de la lumière et ajoutez de l’eau ultrapure juste avant l’incubation UV. Une décoloration est visible du rouge clair (avant l’incubation à la lumière UV) au rouge foncé (après l’incubation à la lumière UV).
   ATTENTION : Le sulfo-SANPAH provoque une grave irritation oculaire (H319).
7. Dans l’enceinte de biosécurité, effectuez un lavage rapide et stérile du Sulfo-SANPAH sur les gels. Par conséquent, laver les gels PAA fonctionnalisés 2x dans du PBS stérile pendant 10 min.
   REMARQUE : À partir de ce point du protocole, toutes les étapes seront effectuées dans des conditions stériles.
8. Dans l’enceinte de biosécurité, préparez une solution de collagène de type IV à 0,1 mg/mL dans du PBS sur glace. Pipeter 50 μL de gouttelettes de collagène de type IV à 0,1 mg/mL sur le gel PAA fonctionnalisé et incuber pendant la nuit à 4 °C.
9. Lavez les gels 2 fois dans du PBS stérile. Retirez le PBS et laissez sécher les gels pendant 5 min.
10. Pipetez une gouttelette de 50 μL de milieu de croissance des cellules endothéliales (ECG) sur les gels et incubez pendant au moins 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
    REMARQUE : L’incubation des gels dans le milieu ECG améliore les attaches cellulaires et tissulaires aux gels.

2. Préparation de la solution de Krebs modifiée pour le transport

REMARQUE : Préparez la solution de Krebs modifiée fraîche. Dans ce protocole, la solution modifiée de Krebs est préparée 1 jour avant le prélèvement des tissus.

1. Stériliser une bouteille de transport par autoclavage. Remplissez une bouteille en verre avec 90 % (315 ml) du volume total de transport requis (350 ml) d’eau ultrapure. Assurez-vous que la température de l’eau est de 15-20 °C.
2. Tout en remuant doucement l’eau à l’aide d’un aimant agitateur, ajoutez 9,6 g/L (3,36 g) de tampon Krebs-Henseleit et remuez jusqu’à dissolution. À l’aide d’une pipette Pasteur, rincer la nacelle avec un petit volume de solution afin d’inclure toutes les traces de poudre dans la solution. Ne chauffez pas la solution.
3. Tout en remuant, ajoutez 0,373 g/L (130,55 mg) de chlorure de calcium (CaCl₂) à la solution et remuez jusqu’à dissolution. Rincez le bateau de pesée avec un petit volume de solution.
   ATTENTION : H319 provoque une irritation oculaire grave.
4. Tout en remuant, ajoutez 2,1 g/L (0,63 g) de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) à la solution et remuez jusqu’à ce qu’elle soit dissoute. Rincez le bateau de pesée avec un petit volume de solution.
5. Tout en remuant, ajoutez 1 x ^10-1 mM (13,15 mg) de papavérine à la solution et remuez jusqu’à dissolution. Rincez le bateau de pesée avec un petit volume de solution.
   REMARQUE : La papavérine est un relaxant musculaire lisse utilisé pour prévenir une vasoconstriction excessive causée par la coupe et la manipulation du récipient pendant la récolte.
   ATTENTION : Le H301 est toxique en cas d’ingestion.
6. Dans la hotte, ajouter 0,05 mM (1,2 μL) de 2-mercaptoéthanol à la solution et agiter.
   REMARQUE : Le 2-mercaptoéthanol est utilisé pour maintenir un faible niveau de radicaux oxygénés.
   ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique en cas d’ingestion ou d’inhalation (H301 + H331), mortel par contact cutané (H310), provoque une irritation cutanée (H315), peut provoquer une réaction allergique cutanée (H317), provoque de graves lésions oculaires (H318), suspecte d’endommager l’enfant à naître (H361d), peut causer des lésions aux organes en cas d’ingestion prolongée ou répétée en cas d’ingestion (H373), et très toxique pour la vie aquatique avec des effets à long terme (H410). Portez un équipement de protection individuelle et travaillez dans une hotte.
7. Pendant l’agitation, ajustez le pH à 7,2 en ajoutant 1 N (1 M) de HCl ou 1 N (1 M) de NaOH. L’objectif final de pH est de 7,4, mais le pH peut augmenter de 0,1 à 0,3 unité de pH pendant la filtration.
   ATTENTION : HCl contient du gaz sous pression ; il peut exploser s’il est chauffé (H280), provoquer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires (H314) et est toxique s’il est inhalé (H331). Portez un équipement de protection individuelle.
8. Continuez à travailler dans une enceinte de biosécurité. Ajoutez 10 % d’eau ultrapure pour amener la solution au volume final.
9. Stériliser immédiatement la solution par filtration à l’aide d’une membrane d’une porosité de 0,22 μm. Distribuez la solution stérile directement dans un flacon stérile. Ajouter 7 ml de pénicilline/streptomyocine à 2 % (P/S) à la solution.
   REMARQUE : Pendant le transport, 2 % de P/S sont ajoutés au milieu pour éliminer toutes les bactéries. Au cours de la culture tissulaire, 1 % de P/S est ajouté au milieu.
10. Conserver la solution modifiée de Krebs à 4 °C jusqu’au prélèvement des tissus.

3. Prélèvement de tissus

1. Selon l’abattoir, étourdir les porcs par choc électrique ou CO₂. Par la suite, pendez les porcs par une patte arrière, exsangés et déclarés morts.
2. Avant d’entrer dans le processus d’abattage propre, ébouillantez les porcs pour les épiler, brûlez pour enlever les derniers poils et stérilisez l’extérieur de la carcasse.
3. Éviscérez les porcs en faisant une incision médiane le long de l’abdomen et en retirant soigneusement les organes internes. Selon l’abattoir, l’artère carotide était encore attachée à la carcasse du porc, ou l’artère carotide était déjà retirée de la carcasse avec le pincement des organes thoraciques.
4. À l’aide d’un couteau bien aiguisé, prélevez l’artère carotide avec les tissus environnants restants de la carcasse ou de la gorge sans toucher l’artère ni appliquer de contrainte mécanique.
5. Placez le tissu contenant l’artère carotide dans le flacon de transport contenant la solution stérile modifiée de Krebs en ouvrant brièvement le flacon. Retournez le flacon une fois pour vous assurer que tout le tissu est recouvert de la solution de Krebs. Transportez les tissus sur glace jusqu’au laboratoire. Le transport dure environ 30-45 min.

4. Dissection tissulaire

1. Stérilisez l’équipement de dissection pince à épiler chirurgicale (manipulation brutale), pince à épiler à pointe ronde enduite d’époxy (manipulation fine), scalpel, pince et lamelles de protection par autoclavage.
2. Préparez l’enceinte de biosécurité avant le prélèvement ou le transport des tissus. Couvrez la zone de dissection avec une feuille de drap chirurgical. Montez l’équipement de dissection (dans des tubes stériles de 50 ml), les lames chirurgicales et les lamelles stériles. Remplissez deux grandes boîtes de Pétri avec du PBS stérile pour préparer un plateau de dissection. Incuber la culture tissulaire dans une petite boîte de Pétri avec un milieu ECG à 37 °C.
3. Après le transport des tissus, à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité, transférez l’artère carotide du flacon de transport (rempli de solution de Krebs modifiée) dans une grande boîte de Pétri remplie de PBS stérile à l’aide de la pince à épiler chirurgicale.
4. Retirez l’excès de tissu entourant l’artère carotide à l’aide de la pince à épiler chirurgicale et du scalpel pour créer une vue claire de l’artère carotide.
5. Retirez 2-3 cm des deux extrémités de l’artère carotide pour éliminer les zones proches des bifurcations artérielles en coupant avec un scalpel. Retirez le fascia artériel entourant l’artère carotide à l’aide de la pince à épiler fine à bout rond.
   REMARQUE : Le renouvellement de la lame du scalpel permet de couper le fascia avec plus de précision.
6. Transférez l’artère carotide dans une nouvelle grande boîte de Pétri remplie de PBS stérile. Retirez autant que possible la fine couche restante de fascia artériel.
   REMARQUE : Plus l’artère carotide est longue dans le PBS, plus les morceaux de fascia ont tendance à se détacher. L’ablation du fascia est importante car elle obstruera la vision pendant la microscopie.
7. Coupez l’artère carotide propre en anneaux d’environ 2 mm de largeur. Transférez les anneaux de l’artère carotide dans la petite boîte de Pétri préchauffée remplie de milieu ECG et maintenez-la à 37 °C.

5. Ensemencement des tissus

REMARQUE : La fixation des tissus a été testée en ajoutant aucune lamelle couvre-toile, une lamelle stérile non traitée ou une lamelle stérile traitée par pluronique (1 % p/v pluronique dans le PBS, lamelles incubées pendant la nuit et lavées dans de l’eau ultrapure stérile avant utilisation) de différentes tailles sur la feuille artérielle après l’ensemencement sur l’hydrogel PAA.

1. Retirez les gouttelettes moyennes de l’ECG des gels. Transférez un anneau de l’artère carotide dans une boîte de Pétri moyenne propre remplie de PBS stérile.
2. À l’aide de la pince à épiler à bout rond et du scalpel, coupez l’anneau en deux. Disséquez la moitié d’un anneau en feuilles d’environ 2 mm de largeur pour créer des feuilles artérielles de dimensions 2 x 2 mm. Faites attention à l’orientation de la face endothéliale de la feuille artérielle. La courbure et une partie restante du fascia de la feuille artérielle peuvent aider à déterminer cette orientation.
   REMARQUE : La taille des anneaux de l’artère carotide peut varier. Les grands anneaux donnent environ 6 à 8 feuilles, tandis que les petits anneaux donnent 3 à 4 feuilles. Les grands anneaux ont une meilleure fixation en raison de la moindre courbure de la feuille artérielle.
3. À l’aide de la pince à épiler à pointe ronde, saisissez la feuille artérielle à l’arrière de la feuille (à l’extérieur de la paroi du vaisseau) et placez la feuille sur le bord du gel PAA avec la doublure intérieure endothéliale face au substrat PAA pour éviter d’endommager le substrat PAA lors de la mise en place de la feuille.
4. À l’aide de la pince à épiler ou de la pince, déplacez très doucement la feuille artérielle vers le centre de l’hydrogel PAA sans toucher le gel. Placez la feuille artérielle sur le bord du gel (le tissu peut coller à la pince à épiler ou à la pince).
   REMARQUE : De petits restes de fascia artériel à l’extérieur de la paroi du vaisseau créent une poignée facile pour saisir la feuille artérielle tandis que la paroi interne endothéliale de la paroi du vaisseau est très lisse.
5. Ajouter 50 μL de moyen ECG sur la feuille artérielle placée sur le substrat PAA. Ty pour maintenir la gouttelette d’ECG moyenne sur le gel.
6. À l’aide de la pince à épiler à bout rond, placez une lamelle sèche de 13 mm sur le dessus de la feuille artérielle sur le substrat PAA en moyenne. Utilisez le bord intérieur du fond en verre pour abaisser doucement la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche la gouttelette moyenne et que le fluide se propage en dessous.
   REMARQUE : Les lamelles de 13 mm sont avantageuses car elles correspondent étroitement à la taille de la paroi intérieure de la plaque de puits à fond de verre. Si vous abaissez la lamelle trop rapidement, le tissu se déplacera vers le bord de la lamelle.
7. Laissez le tissu fixer à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 5 h avant d’ajouter 1 mL de milieu ECG dans chaque puits. Placez la feuille artérielle sur le substrat PAA à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.

6. Création du modèle 2.5D

1. Autoclave une pince à épiler à bout rond pour le retrait des lamelles. Préparez 1 M de NaOH dans de l’eau ultrapure, stérilisez par filtration à travers un filtre à pores de 0,22 μm et conservez-le à 4 °C.
   REMARQUE : 1 M de NaOH peut être réutilisé dans de futures expériences.
2. À l’aide d’une aiguille pointue stérile avec une pointe courbée, soulevez très doucement la lamelle de 13 mm de la feuille artérielle et retirez la lamelle. Utilisez bien l’anneau intérieur du fond en verre comme support pour soulever et retirer la lamelle. Tout mouvement latéral augmente le risque de détachement de la feuille artérielle du substrat PAA.
3. Dans un tube de microcentrifugation stérile, préparez le mélange de collagène de type I conformément au tableau 2 sur de la glace. Lors de l’ajout de collagène de type I et de NaOH à la solution, remettez très bien en suspension et retournez le tube une fois pour vous assurer que le mélange est mélangé de manière homogène.
   REMARQUE : Lors de l’ajout de collagène de type I au mélange, le mélange de couleur rose clair devient incolore. Lors de l’ajout de NaOH, le mélange incolore devient rose clair.
4. Retirez le fluide du puits à l’aide d’un système d’aspiration sous vide. Retirez le milieu entourant le tissu autant que possible sans toucher le tissu.
   REMARQUE : Trop de milieu autour de la feuille artérielle empêchera le gel de collagène de type I de l’entourer.
5. Ajoutez une gouttelette de 10 μL de mélange de gel de collagène de type I sur chaque feuillet artériel et laissez le gel de collagène de type I polymériser pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
6. Ajoutez très doucement 1 ml de milieu ECG préchauffé dans chaque puits et placez les échantillons à 37 °C et 5 % de CO₂.

7. Imagerie de cellules vivantes

REMARQUE : L’imagerie de cellules vivantes a été réalisée à l’aide d’un microscope d’épifluorescence Leica DMi8 ou Nikon Ti2 Eclipse équipé d’un contrôle thermique, du CO₂ et de l’humidité et contrôlé à l’aide d’un logiciel Leica ou NIS. Le contrôle adaptatif de la mise au point (Leica) et le système de mise au point parfaite (Nikon) ont été utilisés pour maintenir la mise au point dans le temps.

1. Après 24 h de culture dans le système 2,5D, vérifier l’angiogenèse germinative. Certaines feuilles artérielles commencent déjà à former des germes cellulaires après 24 heures de culture, tandis que d’autres feuilles ont besoin d’un peu plus de temps pour initier la germination endothéliale.
2. Si l’angiogenèse germinale a été initiée, rafraîchissez le milieu ECG et placez la plaque à 12 puits dans le support de platine à l’intérieur de la boîte d’incubation préchauffée à 37 °C du microscope.
3. Choisissez l’objectif qui vous intéresse. Différents objectifs ont été utilisés dans cette étude, utilisez un objectif 10x pour créer une vue d’ensemble globale de la formation des germes cellulaires et un objectif 20x pour effectuer la TFM.
4. Définissez le(s) canal(s) d’intérêt. À des fins TFM, visualisez les germes cellulaires à l’aide du contraste de phase et visualisez les marqueurs fluorescents (rouge foncé) dans le substrat PAA à l’aide d’un canal fluorescent à une longueur d’onde de 660 nm.
5. Sélectionnez (plusieurs) région(s) d’intérêt et trouvez le plan de mise au point. Activez le système de mise au point (contrôle adaptatif de la mise au point sur le Leica DMi8 ou système de mise au point parfaite sur le Nikon Ti2 Eclipse) pour assurer une mise au point stable sur l’imagerie timelapse.
6. Définissez le timelapse qui vous intéresse en sélectionnant un intervalle de temps et une durée de timelapse. Différents intervalles de temps (5 à 20 min) et durées de timelapse (4 à 24 h) ont été utilisés à des fins différentes dans cette étude.
7. À des fins TFM, après l’imagerie timelapse, retirez les cellules expexpiantes en ajoutant plusieurs gouttelettes de SDS à 5 % dans de l’eau ultrapure et attendez quelques minutes. Pour chaque position sélectionnée, prenez un empilement z (une hauteur z de 2 μm a été définie avec une taille de pas de 0,2 μm) des marqueurs fluorescents dans le substrat PAA pour obtenir un état détendu des marqueurs fluorescents comme image de référence.
   REMARQUE : L’imagerie Z-stack est effectuée car les cellules peuvent tirer ou pousser les marqueurs fluorescents dans la direction z.

8. Analyse de la force de traction par microscopie

1. Alignez et recadrez les images timelapse par rapport à la meilleure image de référence pour une analyse précise.
2. Pour mesurer les déplacements de marqueurs fluorescents dans l’hydrogel PAA, effectuez une vélocimétrie par image de particules (PIV) entre n’importe quelle image timelapse et l’image de référence à l’aide de codes MatLab personnalisés. Dans l’analyse PIV, divisez les images en fenêtres d’interrogation de 32 par 32 pixels avec un chevauchement de 0,5.
3. Calculez les forces de traction à partir des déplacements des marqueurs fluorescents par microscopie de traction basée sur la transformée de Fourier d’un gel infini avec une épaisseur de gel finie à l’aide de l’équation de Boussinesq²⁷.

Résultats

Au moyen du protocole décrit, nous pouvons induire une angiogenèse germinative ex vivo à partir d’une artère carotide porcine au-dessus d’un hydrogel PAA 2D recouvert d’une fine couche de gel de collagène de type I, créant ainsi un modèle d’angiogenèse germinative ex vivo 2,5D. Ce modèle nous permet d’effectuer une TFM conventionnelle et de mesurer les forces de traction cellulaire de l’angiogenèse germinative sur l’interface du gel PAA dans l’espace et le temps.

Pour établir le modèle 2,5D, nous avons d’abord préparé un hydrogel de polyacrylamide (PAA) 2D incrusté de marqueurs fluorescents, suivi d’un revêtement de nuit avec du collagène de type IV (j-1 à j0). Le jour 0 (j0), une feuille artérielle carotide a été placée sur l’hydrogel enduit de collagène IV et laissée se fixer pendant la nuit (j0 à j1). Par la suite, une fine couche de gel de collagène de type I a été appliquée sur la feuille artérielle, après quoi l’imagerie a été initiée le jour 1 (j1) pour surveiller la germination cellulaire et suivre les marqueurs fluorescents pour l’analyse mécanique (j1 à j2). Pour vérifier l’angiogenèse germinative dans le modèle 2,5D, nous avons réalisé l’angiogenèse germinative ex vivo conventionnelle dans un gel de collagène 3D de type I en parallèle. Pour cela, une fine couche de gel de collagène de type I a été préparée, suivie de l’ensemencement de la feuille artérielle carotidienne, puis recouverte d’une couche supplémentaire de collagène (d0). La germination angiogénique a été surveillée au fil du temps. De plus, nous nous sommes efforcés d’induire l’angiogenèse germinative en 2D afin de réduire davantage la complexité du modèle. La procédure expérimentale a reflété celle du modèle 2,5D, la principale différence étant l’exclusion de la couche supérieure de gel de collagène de type I. La figure 1 donne un aperçu des trois modèles, y compris leurs procédures expérimentales. Les artères carotides ont été prélevées sur des porcs de l’abattoir local et transportées dans une solution fraîche stérile de Krebs. À l’intérieur de l’enceinte de biosécurité, l’excès de tissu entourant l’artère carotide a été enlevé pour éviter toute déficience visuelle de l’angiogenèse germinale pendant l’imagerie en direct (figure 2A-E). Une fois que l’artère était exempte d’excès de tissu, l’artère a été coupée en anneaux artériels de 2 mm de largeur, et les anneaux ont été coupés en feuillets artériels d’une dimension de 2 x 2 mm (Figure 2F).

Pour assurer la germination de l’angiogenèse au-dessus de l’interface de l’hydrogel PAA dans les modèles 2,5D et 2D, nous avons ensemencé les feuillets artériels avec le côté de la cellule endothéliale interne face à l’hydrogel PAA enrobé de collagène de type IV et les avons laissés se fixer. Afin d’optimiser la fixation de la feuille artérielle à l’hydrogel PAA, nous avons testé l’effet de l’ajout d’une lamelle en verre de 12 mm à revêtement antisalissure sur le dessus de la feuille artérielle. Après 24 heures, la lamelle a été retirée et l’efficacité de la fixation a été mesurée au moyen du pourcentage de feuilles artérielles fixées à l’hydrogel PAA. Nous avons observé que l’ajout d’une lamelle en verre - indépendante du revêtement antisalissure - augmentait l’efficacité de fixation des feuillets artériels au-dessus de l’hydrogel PAA par rapport à l’absence de lamelle (Figure 3A-D). Ensuite, nous avons testé l’effet du diamètre (12 ou 13 mm) de la lamelle en verre sur l’efficacité de fixation de la feuille artérielle, tandis que le puits intérieur de la plaque était de 14 mm. Nous avons observé qu’une lamelle de 13 mm augmente l’efficacité de fixation des feuillets artériels au-dessus de l’hydrogel PAA par rapport à une lamelle de 12 mm (Figure 3E-G), car les forces de cisaillement lors de l’enlèvement de la lamelle sont minimisées. Nous avons continué à utiliser une lamelle non traitée de 13 mm pour la fixation de la feuille artérielle à l’hydrogel PAA dans les modèles 2,5D et 2D.

Une fois que la feuille artérielle a été fixée à l’hydrogel PAA, nous avons ajouté une fine couche de gel de collagène de type I sur le dessus de la feuille artérielle pour créer un environnement 2,5D. Nous avons cultivé les échantillons pendant 5 jours et les avons examinés pour détecter l’angiogenèse germinative. Nous avons observé la formation de germinations cellulaires dans le modèle 3D (Figure 4A), ce qui correspond à l’angiogenèse ex vivo précédemment rapportée dans la littérature 28,29,30. Dans le modèle 2,5D, nous avons observé une organisation similaire des germes cellulaires par rapport au modèle 3D (Figure 4B). Des germes cellulaires se sont formés à plusieurs hauteurs (Vidéo 1), y compris à l’interface PAA. De plus, l’angiogenèse germinale est caractérisée par une forte prolifération de cellules leaders et suiveuses, un phénomène que nous avons observé lors de la germination dans le modèle 2,5D (Vidéo 2). Lors de la culture d’une feuille artérielle en 2D, des cellules d’origines différentes (Figure supplémentaire 1) migrent sous forme de monocouches hors du tissu, manquant ainsi de l’organisation des germes cellulaires (Figure 4C). Comme nous n’avons pas observé d’angiogenèse germinative dans le modèle 2D, nous avons exclu ce modèle des analyses ultérieures. Dans l’ensemble, la feuille artérielle a besoin d’un environnement 3D local pour induire l’angiogenèse germinative, montrant le potentiel du modèle 2,5D ex vivo de l’angiogenèse germinative.

De plus, le système de modèle 2.5D est un système polyvalent qui permet aux utilisateurs d’examiner l’effet des signaux mécaniques du microenvironnement cellulaire, par exemple, la rigidité de la matrice. La rigidité matricielle d’un hydrogel de collagène 3D de type I - l’hydrogel couramment utilisé pour l’angiogenèse ex vivo - dépend de la concentration de la protéine ECM, où une augmentation de la concentration en protéines est corrélée à une augmentation de la rigidité matricielle³². La plage typique de concentration de collagène de type I pour que cet hydrogel 3D induise l’angiogenèse germinative est de 1 à 4 mg/mL, ce qui correspond à une rigidité matricielle de 1 Pa à 1 kPa 32,33,34. Des concentrations plus faibles peuvent être trop molles pour fournir un soutien structurel, tandis que des concentrations plus élevées peuvent inhiber le mouvement cellulaire. La rigidité physiologique du tissu endothélial est de 1 kPa³⁵, ce qui peut être imité avec un hydrogel de collagène 3D de type I. Cependant, la formation et la progression de la tumeur sont associées à un raidissement tissulaire⁴, soulignant ainsi la nécessité d’un modèle capable d’atteindre une rigidité matricielle plus élevée pour étudier l’angiogenèse tumorale. La rigidité du substrat des hydrogels PAA - la rigidité détectée par les cellules endothéliales de la feuille artérielle - peut facilement être réglée dans la plage de 1 à quelques dizaines de kPa. Ici, nous avons examiné l’effet de la rigidité du substrat PAA sur le début de l’angiogenèse de germination au moyen du pourcentage d’échantillons qui ont initié la formation de germes cellulaires le jour suivant l’ajout de la couche de collagène de type I. Nous avons observé qu’un plus grand nombre de feuillets artériels présentaient des signes précoces de germination cellulaire lorsqu’ils étaient cultivés sur un hydrogel PAA physiologique mou (1 kPa) par rapport à un hydrogel PAA rigide pathologique (12 kPa) (Figure 5), montrant le potentiel de ce modèle pour étudier l’effet de la rigidité matricielle sur l’angiogenèse germinative. En plus de la rigidité du substrat réglable, ces substrats permettent la modulation systématique d’autres indices mécaniques (par exemple, la composition de la matrice et la densité) ainsi que des signaux chimiques (par exemple, l’inhibition des régulateurs moléculaires par conditionnement du milieu de culture), démontrant ainsi la polyvalence de ce modèle d’angiogenèse ex vivo en 2,5D.

Pour quantifier la mécanique cellulaire dans l’angiogenèse de germination, nous avons effectué une microscopie à force de traction (TFM) conventionnelle sur des germes cellulaires qui se sont formés sur l’interface PAA 2D. Un jour après l’ajout de la couche de collagène de type I, nous avons effectué une imagerie cellulaire vivante des cellules (Figure 6A) et des marqueurs fluorescents intégrés dans l’hydrogel PAA. Les déplacements des marqueurs fluorescents ont été mesurés à l’aide de la vélocimétrie par image de particules (figure 6B), et les tractions cellulaires ont été calculées à l’aide des propriétés mécaniques de l’hydrogel PAA (figure 6C). Avec ce modèle 2,5D ex vivo , nous avons d’abord observé des forces de traction au niveau des protubérances de la cellule leader d’une pousse cellulaire, suivies de forces de poussée le long de la pousse cellulaire - à la fois à l’arrière de la cellule leader et dans les cellules suiveuses (Figure 6C).

Figure 1 : Modèles et procédures expérimentaux. (à gauche) Modèles expérimentaux testés. Le modèle 2.5D représente une feuille artérielle placée sur un hydrogel plat de polyacrylamide (PAA) enrobé de collagène de type IV et recouvert d’une fine couche d’hydrogel de collagène de type I. Le modèle 3D représente une feuille artérielle prise en sandwich entre deux couches de gel de collagène de type I, un système connu pour induire l’angiogenèse^{germinale 36}. Le modèle 2D représente une feuille artérielle placée sur un hydrogel PAA plat recouvert de collagène de type IV. (à droite) Procédures expérimentales pour les modèles correspondants. Pour les modèles 2D et 2,5D, un hydrogel PAA a été préparé la veille de l’ensemencement (j-1), et un enrobage de collagène de type IV a été effectué pendant la nuit. L’artère carotide a été prélevée sur des porcs, disséquée en feuillets artériels, ensemencée sur l’hydrogel au jour 0 (j0) et laissée à fixer pendant la nuit (j1). Pour les échantillons 2,5D, une fine couche de gel de collagène de type I a été placée sur le dessus de la feuille artérielle. Une analyse mécanique a été effectuée après le début de la germination au jour 2 (j2). Pour les échantillons 2D, le support a été rafraîchi le jour 1 (j1). Pour le modèle 3D, une couche de gel de collagène de type I a été préparée juste avant l’ensemencement le jour 0 (j0). La feuille artérielle a été ensemencée sur la couche de collagène de type I et recouverte d’une deuxième couche de collagène de type I. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Étapes de dissection de l’artère carotide (d0). (A) Des artères carotides d’environ 10 cm de longueur ont été prélevées sur des porcs de l’abattoir local. (B) Un excès de tissu et environ 2 cm du bord (pour éviter d’être trop près des points de ramification, (B') ont été jetés. (C-E) L’artère carotide a été dépouillée (C), trempée dans du PBS (D) et tous les tissus restants ont été écorchés pour assurer une bonne visibilité pendant l’imagerie (E). (F) L’artère carotide propre est découpée en anneaux artériels d’une largeur approximative de 2 mm. Chaque anneau est découpé en 4 feuilles artérielles d’une dimension d’environ 2 x 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : L’efficacité de fixation de la feuille artérielle augmente à l’aide d’une lamelle en verre de 13 mm (d1). (A-D) Effet d’une lamelle en verre sur la fixation de la feuille artérielle à l’hydrogel de polyacrylamide (PAA). Une comparaison a été faite entre une lamelle sans verre (A), une lamelle en verre non traité (B) et une lamelle en verre à revêtement antisalissure utilisant Pluronic F127 (C). L’efficacité de la fixation a été mesurée par le nombre de feuilles artérielles qui se sont fixées à l’hydrogel PAA après le retrait de la lamelle par rapport au nombre total d’échantillons : aucune lamelle (4 sur 36), lamelle non traitée (10 sur 36) et lamelle recouverte d’un revêtement antisalissure (9 sur 36 ; D). (E-G) Effet de la taille d’une lamelle en verre non traité sur la fixation de la feuille artérielle à l’hydrogel PAA. Une comparaison a été faite entre une lamelle en verre non traitée de 12 mm (E) et une lamelle en verre non traitée de 13 mm (F) à l’intérieur d’un puits de 14 mm. L’efficacité de la fixation a été mesurée par le nombre de feuillets artériels fixés à l’hydrogel PAA après le retrait de la lamelle de protection par rapport au nombre total d’échantillons : lamelle de 12 mm (10 sur 36) et lamelle de 13 mm (52 sur 72 ; G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : La dimensionnalité du modèle définit l’organisation lors de la croissance cellulaire (d2+). Les cellules migrent hors du tissu dans une organisation de germination dans le modèle 3D (à gauche), similaire au modèle 2,5D (au milieu). Les cellules migrent hors du tissu dans une organisation monocouche dans la configuration 2D (à droite). La barre d’échelle représente 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Le début de la germination endothéliale dans le modèle 2,5D dépend de la rigidité du substrat de l’hydrogel de polyacrylamide (d2). (A-B) Feuillet artériel recouvert d’une fine couche de gel de collagène de type I sur un hydrogel de polyacrylamide (PAA) souple (A ; 1 kPa) ou rigide (B ; 12 kPa) au jour 2 du protocole (1 jour après l’ajout de la couche de gel de collagène de type I). (C) Le début de la germination a été mesuré par le nombre de feuillets artériels qui montrent déjà des signes de croissance cellulaire par rapport au nombre total d’échantillons : mous (7 sur 24) et raide (3 sur 24). La barre d’échelle représente 1 mm (A, B) ou 500 μm (A', B'). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Caractérisation de la force de traction au cours de l’angiogenèse précoce de germination. L’imagerie des cellules dans le temps (0-4 h) est affichée dans la rangée supérieure. Les déplacements des marqueurs fluorescents (0-2 μm) et les tractions cellulaires (0-50 Pa) correspondants sur un substrat d’hydrogel PAA de 1 kPa sont affichés dans la rangée du milieu et du bas, respectivement. Les zooms des tractions cellulaires à 0 h, 2 h et 4 h sont affichés en orange. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Méthode de modèle d’angiogenèse de germination ex vivo 2,5D qui permet la caractérisation mécanique des germes cellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	1 kPa	12 kPa
PBS	435 μL	373,7 μL
40 % acrylamide	50 μL	93,8 μL
2 % bis-acrylamide	7,5 μL	25 μL
Marqueur fluorescent (rouge foncé)	5 μL	5 μL
10 % APS	2,5 μL	2,5 μL
TEMED	0,25 μL	0,25 μL

Tableau 1 : Rapports de mélange de gel PAA.

	formule	Volume par plaque de 12 puits (130 μL)
ECG moyen	VECG=Vfinal-V col1-V NaOH	82,16 μL
Collagène de type I	Vcol1=(Vfinal*Cfinal)/C stock	46 μL
NaOH	VNaOH=0,04*Vcol1	1,84 μL

Tableau 2 : Les volumes de mélange de gel de collagène de type I utilisent les abréviations de volume (V) et de concentration (C).

Vidéo 1 : Imagerie en accéléré de la formation de germes cellulaires dans le modèle 2.5D. Les cellules ont été imagées à l’aide de l’imagerie à contraste de phase sur une période de 22 heures avec un intervalle de temps de 17,5 minutes. Des germes cellulaires se sont formées à plusieurs hauteurs dans la couche de gel de collagène de type I, comme observé par les différents plans focaux. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Taux de prolifération élevé de cellules dans les germes cellulaires dans le modèle 2,5D. Les cellules ont été imagées à l’aide de l’imagerie à contraste de phase sur une période de 22 h avec un intervalle de temps de 17,5 minutes. Les cellules leaders et suiveuses prolifèrent pendant l’imagerie timelapse. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure supplémentaire 1 : Phénotype cellulaire dans un modèle 2D (d2+) par coloration par immunofluorescence. (A) Coloration par immunofluorescence (FI) du noyau cellulaire (DAPI), du marqueur des cellules endothéliales (CD31) et du marqueur des fibroblastes (actine musculaire alpha-lisse ; α-SMA). (B) Coloration IF du noyau cellulaire (DAPI), marqueur des cellules endothéliales (CD31) et marqueur des cellules musculaires lisses (calponine). La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Protocole de coloration par immunofluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’angiogenèse germinative - la formation de nouveaux vaisseaux sanguins - est un processus complexe régulé par des mécanismes moléculaires et mécaniques. Alors que de nombreux modèles 3D ont été développés au cours des dernières décennies pour étudier les moteurs moléculaires (par exemple, la signalisation VEGF et Notch) de l’angiogenèse germinative, on sait peu de choses sur la mécanique cellulaire en raison des limites du modèle. La microscopie à force de traction (TFM) est une technique bien connue pour la quantification des forces cellulaires dans l’espace et le temps, où les déformations du substrat 2D sont converties en tractions cellulaires. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons un modèle 2,5D ex vivo, c’est-à-dire que nous fournissons localement aux cellules un environnement 3D tout en préservant la simplicité d’un modèle 2D qui permet de quantifier les forces de traction lors de l’angiogenèse germinative (Figure 1). Pour ce faire, nous avons préparé et ensemencé un feuillet artériel porcin (côté endothélial vers le bas ; Graphique 2) sur un hydrogel de polyacrylamide (PAA) enrobé de collagène de type IV contenant des marqueurs fluorescents. Après la fixation de la feuille artérielle à l’aide d’une lamelle en verre de 13 mm (Figure 3), nous ajoutons une fine couche d’hydrogel de collagène de type I qui permet la formation de germes cellulaires (Figure 4). En utilisant ce modèle, nous montrons que lors de la germination cellulaire 22,23,24,25, les cellules leaders exercent des forces de traction (comme cela a été observé dans la littérature 19,20,21,22), mais aussi que les cellules suiveuses exercent des forces de poussée (Figure 6). La résolution du champ de traction obtenue grâce à notre protocole permet des analyses quantitatives de la cinématique et de la dynamique cellulaires à la fois dans le temps et dans l’espace qui sont typiques des travaux recourant à la microscopie de force de traction sur des substrats conformes 37,38,39.

De plus, nous démontrons la polyvalence de ce modèle ex vivo 2,5D de l’angiogenèse germinative en modifiant les indices mécaniques du microenvironnement (Figure 5). Alors que l’angiogenèse germinale se produit normalement à une rigidité physiologique de 1 kPa³⁵ - qui peut être imitée par un hydrogel de collagène 3D de type I, l’angiogenèse tumorale se produit dans un microenvironnement rigidifié⁴⁰ - ce qui dépasse la plage de rigidité des hydrogels de collagène 3D de type I conventionnels. La rigidité du substrat PAA peut être facilement ajustée en modifiant le rapport des réticulants pour générer une rigidité du substrat plus élevée. À l’aide de ce modèle, nous révélons que le début de l’angiogenèse germinative dépend de la rigidité. Ces substrats offrent non seulement une rigidité réglable, mais permettent également la modulation systématique de divers autres indices mécaniques, par exemple la composition de la matrice et la densité. De plus, ce modèle nous permet d’étudier la mécanique cellulaire tout en manipulant les régulateurs moléculaires en utilisant le conditionnement du milieu (par exemple, l’effet de l’inhibition sur la signalisation Notch sur la mécanique cellulaire) pour comprendre les mécanismes mécanobiologiques de l’angiogenèse germinative. Cela démontre l’utilité de ce modèle ex vivo 2,5D de l’angiogenèse germinative dans un échantillon de différents microenvironnements.

Le modèle que nous présentons utilise le TFM 2D conventionnel, qui offre une analyse plus simple, une résolution spatiale plus élevée et une mise en œuvre plus facile par rapport au TFM 3D (viscoélastique), ce qui le rend plus accessible et plus rentable^26,41. Cependant, la TFM 3D (viscoélastique) fournit un environnement plus pertinent sur le plan physiologique en capturant les forces de traction dans les trois dimensions et en tenant compte des propriétés mécaniques complexes de la matrice extracellulaire, offrant ainsi des informations plus approfondies sur le comportement cellulaire dans un contexte plus réaliste. 42,43,44,45. Cet effet de dimensionnalité pointe également vers une limitation de ce modèle 2.5D. Nous utilisons la TFM 2D en supposant que les cellules migrent sur un substrat 2D. Bien que ce soit le cas dans ce modèle 2,5D, les cellules se trouvent dans un environnement 3D local et adhèrent donc à la couche de gel de collagène de type I et exercent des forces dans cette couche de gel. L’hypothèse que nous avons adoptée dans cette analyse est que la couche de gel de collagène de type I n’est pas couplée mécaniquement (pas de transmission de force entre ces deux hydrogels) à l’interface PAA en raison de la différence d’ordre de grandeur de rigidité de la matrice, minimisant ainsi l’effet des forces cellulaires sur la couche de collagène de type I. Cela fait de la caractérisation de la force à l’aide du modèle 2,5D ex vivo une représentation simplifiée des forces générées par les cellules. De plus, ce protocole exige de la précision et est étendu avec plusieurs étapes où des échantillons peuvent être perdus, par exemple (i) des difficultés de visibilité cellulaire dues à un excès de tissu entourant la feuille artérielle (Figure 2), (ii) un échantillon sur trois ne se fixe pas au substrat PAA (Figure 3), (iii) tous les échantillons n’initieront pas la formation de germes cellulaires (Figure 5), (iv) les germes cellulaires ne se forment pas au niveau du substrat PAA, et (v) les marqueurs fluorescents flous lors de l’utilisation d’une feuille artérielle épaisse sur un hydrogel PAA à faible rigidité. Par conséquent, nous avons optimisé cette méthode pour une plaque à 12 puits afin de garantir de nombreuses régions d’intérêt pour effectuer une analyse mécanique de l’angiogenèse germinative.

En conclusion, l’approche présentée pour la caractérisation simplifiée des forces de traction cellulaire de l’angiogenèse germinative d’une feuille artérielle porcine vivante à l’aide d’un modèle 2,5D (Figure 7) peut aider à créer des informations plus précises et en temps réel sur les interactions mécaniques au cours de l’angiogenèse dans un contexte de tissu natif, facilitant ainsi l’étude des processus cellulaires dynamiques avec une complexité réduite et une reproductibilité améliorée par rapport aux systèmes entièrement 3D. Cela pourrait améliorer notre compréhension de la façon dont les cellules réagissent aux signaux mécaniques dans un environnement plus pertinent sur le plan physiologique, tout en conservant la simplicité analytique des méthodes 2D. Ces connaissances pourraient faire progresser le domaine de l’ingénierie tissulaire dans le but de créer des vaisseaux sanguins, mais aussi de trouver des médicaments thérapeutiques pour la prévention de l’angiogenèse tumorale dans le but de limiter la croissance tumorale et de réduire les métastases.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2 % bis-acrylamide		Bio-Rad	1610143
2-mercaptoéthanol		Merck Life Science	60-24-2
3-(Trimethoxysilyl)propyl méthacrylate	Bind-Silane	Sigma-Aldrich	440159-100ML
40 % acrylamide		Bio-Rad	1610140
Aboslute éthanol (pour analyse)		VWR International	1.00983.1000
Éthanol absolu (industriel)		VWR International	83813.41
Acide acétique, glacial 100 %		Merck	1000562500
Persulfate d’ammonium	APS	Bio-Rad	7727-54-0
anticorps (primaire) - calponine		ABCAM	AB46794
anticorps (primaire) - CD31		Serotec	MCA1746
anticorps (primaire) - &alpha ;-action musculaire lisse	&alpha ;SMA	Dako	M0851
anticorps (secondaire) - chèvre-anti-souris-IgG1 Alexa 488		Sondes moléculaires	A21121
anticorps (secondaire) - chèvre-anti-souris-IgG2a Alexa 555		Sondes moléculaires	A21137
anticorps (secondaire) - chèvre-anti-lapin-IgG Alexa 555		Sondes moléculaires	A21428
Autoclave		Astell
Chlorure de calcium dihydraté	CaCl2	Calbiochem	208291-250GM
Collagène de type I, queue		Corning	354236
Collagène de type IV, placenta		Merck Life Science	C5533-5MG
Milieu de croissance des cellules endothéliales Milieu	ECG	Promocell	C-22111
Pince à épiler à bout rond revêtue d’expoxy	à épiler fine	Rubis Pinzette	E78144-2A
Marqueur fluorescent, rouge		Invitrogen	F8807
Lamelles en verre, & Oslash ; 13 mm, #1		Epredia	CB00130RA120MNZ0
Lamelles en verre, & Oslash ; 13 mm, #1.5		Epredia	CB00120RAC20MNZ0
Chlorhydrate d’acide, 25 %	HCl	Merck	1.100316.1000
Tampon Krebs-Henseleit	Microscope Sigma-Aldrich	K3753
Microscope, Nikon Ti2 Eclipse		Nikon
, NIS-Elements AR software		Nikon
N,N,N',N'-tétraméthyléthane-1,2-diamine	TEMED	Merck Life Science	110-18-9
Bouteille		Thermo Scientific	2187-0016
Aiguille, 21Gx1"		Henke Sass Wolf	HK4710008025
Sérum normal de chèvre		Gibco	10098792
Chlorhydrate		Sigma	61-25-6
Pénicilline/Streptomyocine (10 000 U/mL)	P/S	Gibco	15140163
Boîte de Pétri, grande (145x20mm)		Greiner Bio-one	639160
Boîte de Pétri, petite (60x15mm)		Greiner Bio-one	628160
Saline tamponnée au phosphate	PBS	Sigma	P4417
Pluronic F-127		Merck Life Science	P2443-250G
Aiguille de ponction, pointe		pointue inconnue
Scalpel, n° 4		Swann-Morton
Hydrogénocarbonate de sodium	NaHCO3	VWR International	144-55-8
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate	Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Lame chirurgicale, n° 20		Swann-Morton
Drap		Foliodrape	2775001
Pince à épiler		chirurgicale Lettix	400024
Triton X-100		Merck	9036-19-5
Lampe UV		Analytik Jena	95-0042-13  ;
plaque de puits, 96 puits, fond		Greiner Bio-one	655180
plaque de puits, fond de verre 12 puits		MatTek	P12G-0-14-F