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Isolement de populations de cellules myéloïdes et épithéliales vivantes à partir du poumon de souris

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DOI :

10.3791/67648

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31 janvier 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille l’isolement de populations immunes et non immunes vivantes du poumon de souris à l’état d’équilibre et après une infection grippale. Il fournit également des stratégies de contrôle pour identifier les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes.

Résumé

Les poumons sont continuellement exposés à des agents pathogènes et à d’autres stimuli environnementaux nocifs, ce qui les rend vulnérables aux dommages, aux dysfonctionnements et au développement de maladies. Des études utilisant des modèles murins d’infection respiratoire, d’allergie, de fibrose et de cancer ont été essentielles pour révéler les mécanismes de progression de la maladie et identifier des cibles thérapeutiques. Cependant, la plupart des études axées sur le poumon de souris privilégient l’isolement des cellules immunitaires ou des cellules épithéliales, plutôt que des deux populations simultanément. Ici, nous décrivons une méthode de préparation d’une suspension unicellulaire complète de populations immunitaires et non immunitaires adaptée à la cytométrie en flux et au tri cellulaire activé par fluorescence. Ces populations comprennent des cellules épithéliales, des cellules endothéliales, des fibroblastes et une variété de sous-ensembles de cellules myéloïdes. Ce protocole implique un lavage broncho-alvéolaire et un gonflement ultérieur des poumons avec de la dispase. Les poumons sont ensuite digérés dans un mélange de libérase. Cette méthode de traitement libère une variété de types de cellules divers et permet d’obtenir une suspension unicellulaire qui ne nécessite pas de dissociation manuelle contre un filtre, ce qui favorise la survie cellulaire et produit un grand nombre de cellules vivantes pour les analyses en aval. Dans ce protocole, nous définissons également des schémas de contrôle pour les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes dans les poumons naïfs et infectés par la grippe. L’isolement simultané de cellules immunitaires et non immunitaires vivantes est essentiel pour interroger la diaphonie intercellulaire et acquérir une compréhension plus approfondie de la biologie pulmonaire dans la santé et la maladie.

Introduction

Le poumon est composé des voies respiratoires, des alvéoles et de l’interstitium. Les cellules immunitaires et non immunitaires résident dans ces compartiments pour contribuer à la fois à la fonction pulmonaire homéostatique (échange gazeux) et à la défense de l’hôte contre les agressions environnementales, telles que les infections virales. Les grandes et petites voies respiratoires, ou les bronches et les bronchioles, sont tapissées de cellules épithéliales. Les cellules épithéliales prédominantes dans ces régions sont les cellules massues et ciliées qui sont responsables de la sécrétion de molécules protectrices et de la facilitation de la clairance mucociliaire1. Les alvéoles sont les structures les plus distales du poumon, tapissées de deux types de cellules épithéliales, les cellules alvéolaires de type I (ATI) et les cellules alvéolaires de type II (ATII). Les ATI sont responsables des échanges gazeux, et les ATII sécrètent et recyclent les tensioactifs pour assurer une tension superficielle appropriée 2,3. Les ATII se renouvellent d’eux-mêmes et peuvent également se différencier en ATI, un rôle particulièrement pertinent après des lésions pulmonaires4. De plus, les ATII fournissent une niche de soutien pour le principal type de cellules immunitaires qui peuplent la niche alvéolaire, les macrophages alvéolaires (MA)5,6. Au-delà de l’épithélium, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les macrophages interstitiels (MI) (qui peuvent être associés à la fois aux nerfs et aux vaisseaux) composent l’interstitium 7,8,9,10. En réponse à une infection et à une lésion, de nombreuses cellules pulmonaires meurent et les cellules immunitaires, y compris les monocytes et les neutrophiles, s’infiltrent dans les tissus11,12. Les monocytes infiltrant les poumons se différencient en macrophages et peuvent contribuer au compartiment des macrophages à long terme13.

Les méthodes actuelles de préparation de suspensions unicellulaires à partir du poumon de souris sont généralement basées sur la collagénase et nécessitent une dissociation physique des tissus14. Cela peut entraîner un faible nombre de populations de cellules non immunitaires viables. Certains protocoles d’isolement des cellules épithéliales sont basés sur la dispase et produisent des proportions plus élevées de cellules épithéliales vivantes ; Cependant, ces protocoles n’étudient généralement pas les rendements et la viabilité des cellules immunitaires 15,16,17. La cytométrie en flux est une méthode couramment utilisée pour distinguer les populations cellulaires au sein d’un tissu digéré. Au départ, la cytométrie en flux pour les MA, les IM, les monocytes et les neutrophiles est clairement délimitée. Cependant, au cours de l’inflammation, le processus de déclenchement devient variable et difficile à interpréter en raison du continuum d’expression des marqueurs de surface des monocytes infiltrants se différenciant en macrophages. Par conséquent, le protocole présenté ici décrit également des stratégies de contrôle pour identifier les populations de cellules myéloïdes d’intérêt après une infection.

La dissociation robuste des cellules épithéliales pulmonaires et myéloïdes est essentielle pour discerner leurs fonctions homéostatiques et inflammatoires. Une méthode permettant d’isoler ces compartiments cellulaires en parallèle permettra d’analyser en aval les principaux types de cellules qui maintiennent la santé et stimulent la maladie. Une vue d’ensemble schématique du flux de travail de ce protocole se trouve à la figure 1.

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Protocole

Ce protocole est conforme aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee de la Harvard Medical School (numéros de subvention : R35GM150816 et P30DK043351). Des souris femelles C57BL/6J âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour les expériences. Ce protocole convient également aux souris mâles. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Préparation des matériaux

  1. Décongelez les enzymes nécessaires sur de la glace, y compris la dispase, la libérase et la DNAse.
  2. Préparez d’autres réactifs nécessaires. Remplissez une seringue de 10 ml avec 5 ml d’EDTA de 2 mM dans du DPBS et ajustez-la avec une aiguille de 27 G. Remplissez la seringue de 1 ml avec du DPBS et fixez le cathéter.

2. Prélèvement des poumons

  1. Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 400 à 500 mg/kg et de 25 à 100 mg/kg de mélange de kétamine et de xylazine (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Procédez à la dissection une fois que la souris ne répond plus au pincement du coussinet du pied (~5 min).
    REMARQUE : Un mélange de kétamine / xylazine est utilisé pour l’euthanasie au lieu du dioxyde de carbone pour prévenir l’hémorragie induite par la suffocation et l’infiltration des cellules immunitaires qui peuvent fausser les résultats.
  2. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 %. Disséquez la souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins et d’une pince #7. Faites une incision dans l’abdomen à l’aide de ciseaux et coupez latéralement à travers le péritoine.
    1. Faites une petite entaille dans le diaphragme pour libérer le vide. Coupez le diaphragme et la cage thoracique inférieure de la cavité corporelle pour exposer les poumons et le cœur.
  3. Perfuser les poumons avec 5 mL d’EDTA 2 mM dans du DPBS dans une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de 27 G. La perfusion est réalisée en pénétrant dans la base du cœur avec l’aiguille, dirigée de la droite vers le ventricule gauche, et en distribuant lentement le liquide de la seringue18.
    REMARQUE : La perfusion doit être effectuée lentement pour éviter la rupture du système vasculaire.
  4. Ouvrez la cage thoracique au niveau du sternum en coupant les côtés de la cage thoracique, puis coupez verticalement à travers le sternum pour exposer la trachée19. Coupez autant de muscle et de tissu conjonctif que possible à l’aide de ciseaux fins et d’une pince #7 sans percer la trachée ou les poumons.
  5. Enroulez la trachée dans une suture (taille 2-0) comme pour l’attacher mais sans serrer. Entaillez la trachée latéralement et insérez le cathéter. Fixez fermement la suture autour du cathéter en tirant fermement sur la suture. N’insérez pas le cathéter à plus de 1 cm dans le poumon.
  6. Gonflez les poumons avec 1 mL de DPBS. Retirez le DPBS en tirant lentement sur la seringue. Regonflez les poumons avec le même DPBS et tirez à nouveau sur la seringue pour prélever le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF).
  7. Débranchez la seringue du cathéter, en laissant le cathéter inséré. Versez BALF dans un tube de microcentrifugation.
  8. Remplissez la même seringue de 1 ml avec 1 ml de dispase et remettez-la en place dans le cathéter. Distribuer la seringue pour gonfler les poumons avec de la dispase. Tout en retirant le cathéter, resserrez la suture autour de la trachée pour éviter les fuites de dispase.
  9. Coupez la trachée latéralement. Retirez les poumons de la cavité corporelle en coupant le tissu conjonctif le long de l’arrière de la cage thoracique tout en utilisant des pinces pour tirer les poumons et la trachée vers le haut.
  10. Retirez le cœur des poumons. Placez les poumons dans 5 mL de DPBS sur de la glace.
  11. À cette étape, prenez le BALF séparé et essorez-le à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant peut être aliquote et stocké selon les besoins. Il doit y avoir une pastille cellulaire visible qui peut être remise en suspension dans 100 μL de RPMI.
    REMARQUE : On peut attendre jusqu’à 2 heures pour procéder à la digestion, ce qui permet de récolter plusieurs souris à la fois.

3. Digérer les poumons

  1. Préparez le mélange de digestion. Ajouter 83 μg/mL de libérase (solution mère de 50 μL) et 100 μg/mL d’ADN (solution mère de 15 μL) dans 3 mL d’IMRP par poumon.
  2. Disséquez les cinq lobes des poumons et jetez tout tissu conjonctif 19,20. Hachez le poumon avec des ciseaux pendant 1 min sur une lame de verre.
  3. Transférez le poumon haché dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide de ciseaux de dissection. Ajouter la pastille de cellule récupérée du BALF et remise en suspension dans le RPMI dans le tube de centrifugation. Ajouter 3 mL de mélange de digestion dans le tube contenant l’échantillon à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
  4. Pipetez le mélange de digestion pulmonaire de haut en bas 2 à 3 fois. Placer à 37 °C dans un agitateur orbital à 140 tr/min avec les tubes de digestion placés à un angle de 45 degrés pendant 40 min.

4. Préparation de la suspension monocellulaire

  1. Retirez les tubes à centrifuger de 50 ml de l’agitateur orbital et placez-les sur de la glace. Pipette le mélange de digestion pulmonaire de haut en bas 5 à 6 fois. Filtrer à travers une crépine à cellules de 70 μm dans un nouveau tube de 50 mL. Lavez toutes les cellules restantes à travers le filtre et neutralisez les enzymes avec 10 ml de FBS à 5 % dans RPMI.
  2. Essorage pendant 5 min 4 °C à 600 x g. Aspirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Remettre en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ACK et incuber pendant 3 minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges (GR). Ajouter 9 ml de PBS et pipeter de haut en bas.
  3. Essorer pendant 5 min à 4 °C à 600 x g. Aspirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Remettre en suspension dans 1 mL de tampon FACS (1 % FBS dans PBS) et filtrer à travers une maille de 64 μm dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette p1000.

5. Cytométrie en flux et analyses en aval

  1. Si vous effectuez une cytométrie en flux ou un tri cellulaire activé par fluorescence dans une plaque de 96 puits, colorez environ 1 à 2 millions de cellules par puits, soit une fraction de 8 % de la suspension pulmonaire.
  2. Faites tourner les cellules vers le bas. Tous les centrages dans une plaque à 96 puits doivent être effectués pendant 2,5 min (4 °C) à 600 x g. Retirez le surnageant et lavez les cellules une fois en les remettant en suspension dans 200 μL de DPBS. Tournez vers le bas et effleurez-vous.
  3. Si des cellules doivent être colorées pour l’analyse par cytométrie en flux, procédez à la procédure de coloration suivante.
    1. Remettre en suspension les cellules dans une coloration zombie vivante/morte (1:150) et un bloc Fc (1:250) dans 25 μL de DPBS pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
    2. Préparez le mélange de coloration des anticorps à une concentration de 2x dans le tampon FACS.
      REMARQUE : Un mélange de coloration doit inclure tous les marqueurs du panel myéloïde (tableau 1) ou du panel épithélial (tableau 2) à leurs concentrations indiquées.
    3. Ajouter 25 μL de mélange colorant à 25 μL de suspension pulmonaire dans une assiette et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Le volume total de coloration doit maintenant être de 50 μL et les anticorps primaires doivent être à leur concentration finale de 1x la concentration.
    4. Ajoutez 150 μL de tampon FACS, tournez pendant 2,5 min à 4 °C à 600 x g et retirez le surnageant. Laver deux fois dans 200 μL de tampon FACS.
    5. Si une coloration intracellulaire est nécessaire, fixez les cellules à l’aide d’un kit de fixation intracellulaire. Si une coloration intracellulaire n’est pas nécessaire, les cellules peuvent être fixées pendant 20 min dans un PFA à 4 % dans le DPBS.
    6. Lavez trois fois le fixateur avec 200 μL de tampon FACS. Les échantillons peuvent être conservés en suspension dans 200 μL de tampon FACS à 4 °C dans l’obscurité pendant 2 à 3 jours. Avant d’analyser les échantillons, des billes de comptage peuvent être ajoutées pour quantifier le nombre de cellules.
  4. Si les cellules doivent être triées, procédez à la procédure de coloration suivante.
    1. Remettre les cellules en suspension dans 1x mélange d’anticorps de coloration avec bloc Fc (1:250). Incuber pendant 30 min sur de la glace dans l’obscurité.
    2. Ajoutez 150 μL de tampon FACS, tournez pendant 2,5 min à 4 °C à 600 x g et retirez le surnageant. Laver trois fois avec 200 μL de tampon FACS et remettre en suspension dans 200 μL de tampon FACS avant de trier.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter un colorant de viabilité, tel que DAPI, aux cellules avant le tri.

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Résultats

Une digestion réussie se traduira par environ 20 à 25 millions de cellules avec une viabilité de 90 à 95 %. Si l’on ajoute environ 25 000 billes de comptage à une fraction de 8 % du poumon, les billes devraient compromettre 1 à 3 % des événements collectés. Après le gate sur les singulets, environ 90 % à 95 % des cellules doivent être négatives pour Zombie Aqua (indiquant la viabilité) (Figure 2A, Figure 3A).

Parmi les cellules CD45

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Discussion

Ce protocole décrit une digestion pulmonaire de souris qui isole environ 20 à 25 millions de cellules par souris avec une viabilité de 90 à 95 %. Il permet en outre de collecter des BALF pour une analyse plus approfondie. La suspension cellulaire résultante est compatible avec de multiples techniques de laboratoire, notamment la cytométrie en flux et le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les cellules pour le séquençage ou la culture cellulaire. Brièvement, après la perfus...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des National Institutes of Health (R35GM150816 et P30DK043351), de la Fondation Charles H. Hood et du Harvard Stem Cell Institute. Nous remercions Alexander Mann et tous les autres membres du laboratoire Franklin pour leur aide et leurs conseils dans la conception et l’amélioration des schémas de contrôle et d’analyse de la cytométrie en flux. Nous remercions également la plateforme de cytométrie en flux d’immunologie de la Harvard Medical School. L’analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l’aide de FlowJo. Les schémas des figures ont été créés à l’aide de BioRender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mL avec embout coulissantVWRBD309659
Tube de microcentrifugation de 1,7 mLDOT ScientificRN1700-GMT
Pipettes de 10 mL (jetables)Fisher Scientific12-567-603
Seringue de 10 mL avec embout BD Luer-Lok VWR75846-756
123 unités eBeads Tiges de comptageThermo Scientific01-1234-42
Pipette 12 canaux (30-300ul)USA Scientific  ;7112-3300
16 % paraformaldéhydeVWR100503-917
Aiguille 23 G avec biseau régulierVWR305194
27 G PipettesVWRBD305109
5 mL (jetables)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL tubes à centrifugerOlympus  ;28-108
Plaque inférieure ronde à 96 puitsCorning3797
Tampon de lyse ACKGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-souris CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Anticorps monoclonal de rat (PE (Phycoérythrine)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-souris CD64 (Fc&gamma ; RI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-souris CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Cathéters IV blindésVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-souris I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-souris/humain CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-souris Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-souris CD45BioLegend103147
souris C57BL/6J  ;Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Anticorps monoclonal (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Anticorps monoclonal (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Filtres cellulairesCorning352350
CentrifugeuseEppenodorf5910R
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstitué à 20 mg/mL dans le DPBS sous forme de solution mère stockée à -20 ° ; C
DispaseVWR76176-668Décongelé une fois et stocké sous forme d’aliquotes de 1 mL à -20 ° ; C
Pince à dissection (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Ciseaux de dissectionFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience kit de fixationLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
ÉthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Décongelé une fois et inactivé thermiquement avant un stockage à long terme sous forme d’aliquotes à -20 ° ; C
FITC anti-souris CD31Anticorps BioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MoyenFisher Scientific11-875-093
Lames de verreFisher Scientific12-552-3
réservoir graduéUSA Scientific  ;1930-2235
Seau à glaceCorning432128
de kétamine (100 mg/mL)Le mélange d’euthanasie dekétamine et de xyalazine peut être conservé à 30 mg/mL de chlorhydrate de kétamine et 4,5 mg/mL de xylazine dans un DPBS stérile jusqu’à un mois.
LiberaseMillipore Sigma5401119001reconstituée à 5 mg/mL dans le DPBS sous forme de solution mère stockée à -20 ° ; C
Couvercles pour plaques à 96 puitsFisher Scientific07-201-731
Incubateur orbital ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
pipette p1000Eppenodorf3123000063
p1000tips USA Scientific  ;1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 pointesUSA Scientific  ;1110-1700
PE anti-souris CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-souris CD104 AnticorpsBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-souris Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid  ;Drummond4-000-101
Anti-souris CD16/32 BioLegend101302Appelé « Fc block » dans le texte
Flacon pulvérisateurVWR23609-182
Suture (Taille 2-0)VWR100190-026
Sous-tapisVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalVoir les notes sur l’hydrocholoride de kétamine ci-dessus.
Zombie Aqua Kit de viabilité fixableBioLegend423102
Aiguilles injection d’hydrocholoride

Références

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Mots-clés

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