Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Summary

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Abstract

La compréhension de l’expression des gènes est essentielle pour déchiffrer les fonctions cellulaires. Cependant, les méthodes d’analyse de l’expression de nombreux gènes in situ au sein d’un tissu donné restent limitées. Le protocole EASI-FISH décrit ici a été adapté pour détecter l’expression de dizaines de gènes dans le système nerveux central (SNC) intact de la drosophile adulte à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce. Ce protocole comprend une nouvelle formulation de gel qui améliore la robustesse du gel, permettant plusieurs cycles d’hybridation et permettant l’intégration de plusieurs cerveaux par gel. Cette amélioration augmente le débit, facilite la comparaison optimale des conditions expérimentales et réduit les coûts de réactifs. De plus, en utilisant le système GAL4-UAS pour la co-détection de la protéine fluorescente verte (GFP), l’expression génique peut être visualisée dans des types spécifiques de cellules neuronales ou gliales. Notamment, la haute résolution obtenue par la microscopie à expansion, combinée à la sensibilité de la méthode, permet de détecter des transcrits d’ARN uniques. Cette approche intègre efficacement une qualité d’image élevée avec un débit élevé, ce qui en fait un outil puissant pour étudier l’expression des gènes dans le cerveau intact de la mouche.

Introduction

FISH a été utilisé pour la première fois chez la drosophile il y a plus de 40 ans pour cartographier les gènes sur les chromosomes polytènes^1,2. Aujourd’hui, la FISH à molécule unique est l’étalon-or pour localiser et quantifier spatialement les transcrits de l’ARNm dans les tissus intacts ³. Cependant, en raison de problèmes d’intégrité de l’échantillon et de perte d’ARN, les techniques de FISH à molécule unique chez la drosophile ont été limitées à quelques gènes pouvant être analysés dans le même échantillon^4,5,6,7. Alors que le développement récent du codage à barres (par exemple^8,9,10) augmente le nombre de transcrits pouvant être détectés jusqu’à plusieurs centaines, même dans les tissus épais^11,12), la mise en place de tels protocoles nécessite un investissement considérable en ressources, ce qui pourrait constituer un obstacle à la mise en œuvre. En effet, de nombreuses techniques inventives de transcriptomique spatiale ne se sont jamais répandues au-delà de leurs institutions d’origine¹³. Par conséquent, une méthode simple et relativement peu coûteuse pour détecter l’expression de dizaines de gènes dans le même cerveau intact faciliterait divers objectifs de recherche : validation du séquençage de l’ARN et des données de l’atlas cellulaire, cartographie des types de cellules moléculaires dans le SNC, quantification des différences de développement, de sexe ou d’espèce dans l’expression des gènes, ou mesure des changements dans l’expression des gènes induits par la grande variété de perturbations génétiques ou environnementales disponibles chez la drosophile.

La microscopie à expansion est une technique qui permet aux chercheurs d’observer les tissus à plus haute résolution en les dilatant dans un hydrogel gonflant¹⁴. EASI-FISH combine la microscopie à expansion et l’ARN FISH¹⁵, qui utilise la réaction en chaîne d’hybridation (HCR), une technique non enzymatique pour détecter la liaison de l’oligosonde ¹⁶. EASI-FISH a d’abord été développé comme une approche alternative à la FISH en tissu mince pour cartographier les modèles d’expression de dizaines de gènes dans des tranches de tissu épais (300 μm) de l’hypothalamus latéral de souris¹⁷. Cette méthode est idéale pour une application sur des cerveaux de mouches adultes, étant donné que ce tissu a une épaisseur inférieure à 300 μm, et qu’un prototype de protocole EASI-FISH a récemment été décrit ¹⁸. Ici, des cerveaux de drosophile disséqués et fixés sont intégrés dans un hydrogel gonflant, où l’ARNm et les protéines sont ancrés de manière covalente au polymère de gel avec les agents alkylants Melphalan-X et Acryloyl-X (Ac-X), respectivement. Après la digestion des protéines, qui permet l’expansion isotrope du cerveau, des oligosondes d’ADN spécifiques au gène sont hybridées à l’ARNm dans le tissu pour localiser les transcrits d’intérêt. Des épingles à cheveux d’ADN marquées par fluorescence sont ensuite ajoutées dans une deuxième étape d’hybridation. Plusieurs molécules d’épingle à cheveux polymérisent dans la réaction HCR pour former des polymères d’ADN métastables. Cela conduit à une amplification du signal pour les transcrits individuels, qui peuvent être détectés comme des points lumineux par feuillet de lumière ou par microscopie confocale.

L’ancrage covalent de l’ARNm et des protéines dans la matrice du gel et la digestion protéolytique des protéines après la formation du gel créent un environnement où les transcrits de l’ARNm sont relativement stables et potentiellement plus accessibles à la liaison à la sonde. La stabilité de l’ARNm et du gel permet plusieurs cycles de ré-sondage et d’imagerie, avec le stripping des sondes d’ADN et du produit HCR par incubation avec l’enzyme DNase1 entre les tours^15,17. De plus, l’expansion de l’échantillon réduit l’autofluorescence et la diffusion de la lumière par désencombrement moléculaire et augmente efficacement la résolution de l’image¹⁴. Par conséquent, les transcrits individuels de l’ARNm peuvent être plus facilement résolus.

GFP soutient suffisamment la procédure pour rester détectable par fluorescence ou liaison d’anticorps post-expansion. Par conséquent, ce rapporteur peut être utilisé pour marquer et segmenter les types de cellules d’intérêt. En conjonction avec les nombreuses lignées de pilotes split-GAL4 spécifiques aux neurones disponibles (par exemple, ^19,20), cela ouvre la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’identité moléculaire d’un type neuronal ou d’identifier des sous-types moléculaires qui ne peuvent pas être facilement distingués par leur anatomie.

Décrit ici est une version mise à jour du prototype du protocole EASI-FISH¹⁸ qui présente une excellente rétention de l’ARNm, l’élimination des difficultés techniques et une plus grande robustesse du gel. Les modifications comprennent l’augmentation de la concentration de PFA, l’abaissement de la température de fixation et la facilitation de la préparation des échantillons en montant les cerveaux avant l’incubation avec Melphalan-X et Ac-X. Ce protocole intègre également une nouvelle recette de gel pour augmenter la robustesse du gel, ce qui réduit efficacement les dommages causés au gel lors de nombreuses séries de FISH et d’imagerie. Ces modifications rendent le protocole plus simple à mettre en œuvre, réduisant à la fois le temps de traitement et l’utilisation de réactifs, et renforçant la confiance dans des résultats cohérents. Il est important de noter que la capacité de multiplexage est augmentée de sorte que des dizaines de gènes peuvent être étudiés dans le même cerveau sur une période de plusieurs mois. Ceci est illustré par les modèles d’expression de plusieurs gènes neuronaux dans le cerveau de la drosophile adulte à travers une gamme de niveaux d’expression.

Protocol

Ce protocole a été réalisé sur des femelles adultes (âgées de 5-6 jours) de Drosophila melanogaster, mais n’importe quel sexe ou espèce de drosophile est applicable. Pour les recettes d’ancrage en gel, voir le tableau supplémentaire 1 ; pour la recette de gel, tableau supplémentaire 2 ; et pour les autres réactifs EASI-FISH, le tableau supplémentaire 3. Pour un guide quotidien sur les matériaux et les réactifs, voir le tableau supplémentaire 4. Pour le support de gel pour microscope à feuillet de lumière, voir le fichier supplémentaire 1. La figure 1A-C montre une représentation schématique de l’encastrement des cerveaux dans les gels avant l’expansion et l’hybridation de la sonde (étapes 2.1 à 3.8). La figure 1D est une photographie des cerveaux intégrés, La figure 1E montre un support de gel pour la microscopie à feuillet de lumière, et Figure 1F représente la chronologie d’une expérience typique. Les détails commerciaux des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Dissection et fixation du cerveau de la mouche

1. Disséquer des cerveaux de mouches ou le SNC dans un milieu S2 froid (pour plus de détails sur la dissection, voir reference²¹)
2. Pour réparer les cerveaux, ajoutez jusqu’à 20 cerveaux ou 10 SNC à 2 ml de PFA/PBS froid à 4 % et incubez toute la nuit sur un nutator à 4 °C
   ATTENTION : Le PFA est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritant pour la peau et les yeux et peut être cancérigène.
3. Rincer l’échantillon (1x) avec 2 mL de PBT froid (0,5 %, voir le tableau supplémentaire 4), puis laver l’échantillon avec 2 mL de PBT froid (4x) pendant 15 min sur un nutator à 4 °C.
4. Rincer l’échantillon (1x) avec 2 mL d’EtOH froid à 70 %. Conservez la cervelle dans 2 mL d’EtOH à 70 % à 4 °C jusqu’à 6 mois.

2. Montage des cerveaux et ajout d’ARN et de liaisons protéiques (Jour 1)

REMARQUE : Portez des gants en tout temps et essuyez systématiquement l’équipement et l’espace de travail avec RNase Away. Des gants sont nécessaires (1) pour éloigner les RNases des échantillons et (2) pour se protéger de plusieurs réactifs qui présentent un risque pour la santé.

1. Préparez les chambres de gel en essuyant une lame non chargée avec un réactif de décontamination RNase. Retirez le film opaque protégeant l’adhésif du joint en silicone, collez le joint (avec jusqu’à 4 chambres) sur la lame et enduisez chaque surface de chambre de 1 μL de poly-lysine à l’aide d’une pointe de pipette P20. Sécher à l’air libre et répéter le processus.
   REMARQUE : L’étape 2.1 peut être effectuée la veille.
2. Transférez les cerveaux dans un tube PCR de 0,2 mL (jusqu’à 4 cerveaux par tube) et réhydratez-les pendant (2x) 5 min dans 150 μL de PBT (0,1 %) et (2x) pendant 5 min dans PBS.
3. Pour monter les cerveaux, ajoutez 40 μL de PBS par chambre, puis enfoncez doucement les cerveaux en rangée au centre de la chambre avec une pince à épiler fine, en laissant un peu d’espace entre les cerveaux (voir Figure 1D). Il est possible de monter jusqu’à 6 cerveaux ou 2 CNS par chambre.
4. Retirez le PBS et ajoutez immédiatement 50 μL de tampon MOPS de 20 mM. Incuber pendant 30 min à température ambiante (RT).
5. Pendant que les cerveaux s’équilibrent dans le tampon MOPS, décongelez les solutions mères de Melphalan-X et d’Ac-X et préparez 75 μL de solution de Melphalan-X/Ac-X par chambre (diluez le stock de Melphalan-X 1:1 avec le tampon MOPS et ajoutez Ac-X à 1:100). Vortex et tournez brièvement pour recueillir la solution ; chronométrer la préparation de manière à ce que la solution soit prête à la fin du temps d’incubation de 30 minutes, et non plus tôt.
   MISE EN GARDE : Melphalan-X est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritant pour la peau et les yeux et peut être cancérigène.
6. Retirez toute la mémoire tampon MOPS et ajoutez 50 μL de solution Melphalan-X/Ac-X.
7. Couvrez la chambre en plaçant une lamelle sur le dessus, mais n’utilisez pas l’adhésif du joint pour sceller. Placez la chambre dans une boîte humidifiée et incubez à l’abri de la lumière pendant la nuit à RT.

3. Gélification et digestion de la protéinase K (Jour 2)

1. Retirez soigneusement la lamelle et le Melphalan-X/Ac-X, et lavez les cerveaux montés (2x) pendant 2 min avec 100 μL de PBT (0,1 %) et (1x) pendant 2 min avec 100 μL de PBS.
2. Décongelez la solution TREx-1000, 4HT, TEMED et APS et restez sur la glace.
   REMARQUE : TREx-1000 peut précipiter à -20 °C ; bien vortex pour se dissoudre complètement après décongélation.
   ATTENTION : Ces réactifs sont nocifs ou toxiques lorsqu’ils sont avalés ou inhalés, ainsi que des irritants cutanés et oculaires.
3. Préparez la solution de gel en mélangeant TREx-1000 avec 4HT, TEMED et APS dans un rapport de 94:2:2:2. Vortex et restez sur la glace. Pour chaque chambre, préparer 150 μL de solution gélatineuse.
4. Retirez le PBS de la chambre à l’aide d’une pointe de pipette et évacuez soigneusement tout PBS restant avec une lingette non pelucheuse. Pour chaque chambre, ajoutez immédiatement 40 μL de solution de gel sur le dessus du cerveau. Incuber à 4 °C pendant 10 min.
5. Retirer la solution gélifiée et ajouter 40 μL de solution gélifiée fraîche, en laissant incuber à 4 °C pendant 10 minutes supplémentaires < > REMARQUE : Recueillir la solution de déchets de gel dans un tube de microcentrifugation et polymériser avant de la jeter.
6. Retirez la solution de gel et décollez le film protecteur transparent de l'adhésif de surface du joint. Ajoutez 45 μL de solution de gel frais, placez doucement une lamelle sur la chambre et évitez de piéger les bulles d’air. Appuyez sur la lamelle pour sceller la chambre et incubez à 4 °C pendant 10 min (pour un total de 30 min d’équilibrage à 4 °C).
7. Polymériser le gel à 37 °C pendant 1,5 h.
8. Une fois que les gels ont pris, laissez-les refroidir sur la paillasse pendant quelques minutes. Retirez délicatement la lamelle et retirez le joint en silicone avec une nouvelle lame de rasoir. Ensuite, coupez le gel en un rectangle et coupez le coin supérieur droit pour suivre l’orientation de l’échantillon.
9. Retirez les gels de la lame à l’aide d’un pinceau fin imbibé d’une petite quantité de tampon ProK et transférez-les individuellement dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml.
10. Incuber chaque gel avec 500 μL de tampon ProK et 5 μL d’enzyme ProK (1:100) à 37 °C pendant la nuit.

4. Digestion de l’ADN et hybridation de la sonde (Jour 3)

1. Laver les gels (3x) pendant 10 min avec 1 mL de PBS à RT.
   REMARQUE : Utilisez des pipettes de transfert à pointe fine pour éviter d’endommager le gel lors du remplacement des solutions.
2. Incuber les gels pendant 30 min dans 1 mL de tampon DNase1 à 37 °C.
3. Ajoutez 50 μL d’enzyme DNase1 à 450 μL de tampon DNase. Mélangez doucement, mais ne vortex pas. Incuber chaque gel dans 500 μL de DNase1 pendant 2 h 37 °C. Laver (4x) 15 min avec 1 mL de PBS à RT.
   REMARQUE : Les gels peuvent être stockés dans 5x SSC à 4 °C avant ou après la digestion/lavage de la DNase pendant plusieurs semaines.
4. Hybridation par dégel (hyb) et tampon de lavage par sonde. Incuber les gels dans 500 μL de tampon hyb sans sonde pendant 30 min à 37 °C.
   ATTENTION : Le tampon de lavage hyb et sonde contient du formamide, qui est suspecté de provoquer le cancer.
5. Diluer les sondes 1:100 dans un tampon hyb (10 nM), en préparant 300 μL par gel. Incuber les gels avec le tampon hyb et les sondes pendant la nuit à 37 °C. Maintenez le tampon de lavage de la sonde et le PBS à 37 °C.

5. Lavages de la sonde (Jour 4)

1. Laver les gels (3x) pendant 30 min avec 750 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C.
2. Lavez les gels (3x) pendant 30 min, puis (3x) pendant 1 h avec 1 mL de PBS à 37 °C.
3. Lavez les gels dans 2 ml de PBS à RT pendant la nuit ou à 4 °C pendant le week-end.

6. Réaction en chaîne d’hybridation (HCR) avec des épingles à cheveux fluorescentes (Jour 5)

NOTE : Pour le principe HCR, voir reference²².

1. Incuber les gels dans 500 μL de tampon d’amplification (amp) pendant 30 min à RT.
2. Chauffez les épingles à cheveux fluorescentes à 95 °C pendant 90 secondes dans une machine PCR et refroidissez rapidement à 25 °C pendant 30 minutes.
3. Pour chaque sonde, diluer les paires d’épingles à cheveux correspondantes (h1 et h2) à 1:50 dans un tampon ampères, en préparant 300 μL par gel et vortex.
4. Incuber les gels avec le mélange en épingle à cheveux pendant 3 h à RT dans l’obscurité.
5. Lavez les gels (2x) pendant 15 min avec 750 μL de 5x SSCT et (2x) pendant 30 min avec 1 mL de SSCT 0,5x à RT.
6. Si le cerveau exprime la GFP, colorer avec 500 μL d’anticorps anti-GFP-AF488 (1:500) dans du PBT (0,1 %) contenant 5 mg/mL de BSA ultra-pur et incuber pendant la nuit (ou le week-end) à 4 °C.

7. Montage des gels et imagerie (Jour 6)

1. Après l’incubation de l’anticorps, rincez une fois les gels et lavez-les (1x) pendant 30 min avec 1 mL de PBT (0,1 %), puis (3x) pendant 30 min avec 1 mL de PBS.
   REMARQUE : Le lavage en PBS entraînera une expansion 2x ; pour une expansion 3x, laver avec 0,05x SSC.
2. Pendant le lavage, enduire deux fois la surface de fixation en gel du support de gel pour microscope à feuille de lumière avec 1 μL de polylysine, en laissant sécher à 37 °C entre les couches. De même, pour l’imagerie confocale, enduire la zone de fixation en gel d’une parabole à fond de verre avec des applications répétées de polylysine.
3. Techez les gels pendant 30 min à RT dans 1 mL de 5 μg/mL DE DAPI/PBS ou DAPI/0,05x SSC, ou alternativement, colorez toute la nuit à 4 °C.
4. Pour monter le gel sur le support de gel (microscope à feuille de lumière) ou sur la parabole à fond de verre (microscope confocal), placez le gel sur une lamelle et séchez soigneusement les bords avec une lingette non pelucheuse. Assurez-vous que le gel est orienté de manière à ce que le tissu soit le plus proche de l’objectif. À l’aide d’un pinceau, placez délicatement le gel sur la surface en polylysine en un seul mouvement. Pour l’imagerie, baignez le gel dans du PBS (ou 0,05x SSC si vous passez à 3x).
   REMARQUE : Après l’imagerie, les gels peuvent être délicatement retirés de la surface en polylysine avec un pinceau humide et transférés dans un tube de microcentrifugation de 2 ml.
5. Pour un nouveau sondage immédiat, passez au jour 7. Pour un stockage à plus long terme (1 semaine à 6 mois), stocker les gels dans 1 mL de 5x SSC à 4 °C. Au moment de l’utilisation, laver les gels (3x) pendant 10 min avec 1 mL de PBS avant de continuer.
   REMARQUE : L’étendue de l’expansion est généralement cohérente dans les tampons décrits (~2x en PBS et ~3x en SSC 0,05x). Pour vérifier le facteur d’expansion, mesurez la taille d’un cerveau avant et après l’expansion sur des images prises au stéréomicroscope à fluorescence. Pour visualiser le cerveau après expansion, colorez-le brièvement avec du DAPI. Le facteur d’expansion approximatif est la taille après expansion divisée par la taille avant l’expansion.

8. Sondes de décapage et épingles à cheveux pour multiplexage (Jour 7)

1. Incuber les gels pendant 30 min dans 1 mL de tampon DNase1 à 37°C.
2. Ajoutez 50 μL de DNase1 à 450 μL de tampon DNase. Mélangez doucement, mais ne vortex pas. Incuber les gels dans 500 μL de DNase1 pendant 2 h à 37 °C.
3. Laver (4x) pendant 15 min avec 1 mL de PBS à RT. Les gels sont maintenant prêts pour le prochain cycle d’hybridation (Jour 3, étape 6).

Results

La performance de ce protocole EASI-FISH modifié est démontrée par la détection de l’expression de plusieurs gènes différents associés aux neurotransmetteurs et aux neuropeptides dans le cerveau de la drosophile adulte sur plusieurs tours. En règle générale, les cerveaux gélifiés et élargis ont été hybridés avec deux ou trois sondes par tour, suivis de HCR avec des paires d’épingles à cheveux conjuguées avec Alexa Fluor (AF) 488 (sauf si GFP a été exprimé), AF546 et AF647 ou Janelia Fluor (JF) 669. L’imagerie a ...

Discussion

Le protocole EASI-FISH décrit pour le système nerveux intact de la drosophile permet de détecter des dizaines de transcrits dans le même cerveau ou SNC. Il est robuste, simple et sensible, et il peut être combiné à la détection GFP pour identifier des sous-ensembles de neurones ou de cellules gliales. Comme cette méthode est facile à mettre en œuvre, elle devrait faciliter la recherche des laboratoires de drosophile qui s’intéressent à la cartographie et à la quantification de l’expression des gènes dan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes PCR de 0,2 mL	USA Scientific  ;	1402-4700
Tubes à microcentrifuger à bouchon à vis de 0,5 mL, Amber	USA Scientific  ;	1405-9707
0,5 M EDTA, PH 8, RNase sans	Invitrogen	AM9260G
10M NaOH	Sigma	72068
10x PBS  ;	Fisher	BP 3994
20x SSC	ThermoFisher	AM 9763
40 % acrylamide  ;	Bio-Rad	1610140
4-Hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma	176141
5 M NaCl sans RNase  ;	Thermofisher	AM97060G
5 ml Pipette de transfert - Pointe fine	Global Scientific  ;	134070-S20
Plaque inférieure en verre à 6 puits  ;	Cellvis	P06-1.5H-N
Acétonitrile, anhydre  ;	ThermoFisher	042311-K7
Acide acrylique	TCI	A0141
Acryloyl-X  ;	ThermoFisher	A20770
Persulfate d’ammonium (APS)	Sigma	A3678
Tampon d’amplification  ;	Molecular Instruments	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
DMSO anhydre	Invitrogen	D12345
AstA_B2	Molecular Instruments	PRR477
ChAT_B1	Molecular Instruments	PRG115
Crz_B5	Molecular Instruments	PRR480
DAPI	Sigma	D9542
FIJI	Open source	https://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2	Molecular Instruments	PRR487
GAD1_B5	Molecular Instruments	RTE581
GFP Anticorps polyclonaux, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21311
Tampon d’hybridation	Molecular Instruments
Imaris Stitcher	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris viewer	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE  ;	Tocris	6420
Melphalan	Caymen Chemicals	16665
MOPs Buffer	Fisher	BP308-100
N,N Méthylène-Bis-acrylamide  ;	Bio-Rad	1610142
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Sigma	T22500
Eau sans nucléases  ;	Ambion	AM9932
Oligo Sondes  ;	Instruments moléculaires	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Paraformaldéhyde (PFA)	EMS	15710
PBS	Fisher  ;
Photoflo-200² ;	EMS	74257
Bromhydrate de poly-L-lysine (polylysine)	Sigma	P1524
Tampon de lavage de sonde	Instruments moléculaires	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Protéinase K  ;	NEB	P8107S
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28306
RNase Away  ;	ThermoFisher	7003, réactif
sans RNase1	Qiagen	79254
S2 Medium	ThermoFisher	21720024
Joints en silicone  ;	Invitrogen	P24743
Tdc2_B5	Molecular Instruments	RTE880
Tk_B5	Molecular Instruments	PRR484
UltaPure 10 % SDS	Thermofisher	15553027
Ultrapure BSA	ThermoFisher	AM2616
Épingles à cheveux non conjuguées et Alexa Fluor	Instruments	moléculaires
VAChT_B1	Molecular Instruments	RTA904
vGLUT_B2	Molecular Instruments	RTB212
Zeis Z7 Gel Holder  ;	Janelia  ;	Fichiers CAO disponibles sur demande
Microscope confocal inversé Zeiss LSM 980 Microscope à	Zeiss	https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 Microscope à feuille de lumière	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html