Le présent protocole décrit une méthode par étapes pour l’analyse de la mécanique respiratoire d’un modèle murin ex vivo à l’aide de la technique d’oscillation forcée (FOT).
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Article de méthode
Évaluation de la fonction pulmonaire dans un modèle murin ex vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
La mécanique respiratoire est un domaine d’étude clé dans la définition et le traitement des pathologies pulmonaires en évaluant la capacité pulmonaire fonctionnelle. La mécanique pulmonaire peut être évaluée à travers diverses manœuvres pulmonaires qui impliquent différentes formes d’ondes oscillatoires. Lorsqu’elles sont appliquées aux poumons, ces manœuvres mesurent plusieurs variables, telles que la pression, le volume et le débit, en fonction de la réponse aux formes d’onde. Ces signaux sont ensuite calculés et analysés pour déterminer des paramètres tels que l’hystérisité, la résistance, la compliance, l’amortissement des tissus et l’élasticité des tissus, fournissant une évaluation détaillée de la fonction pulmonaire globale. L’analyse de la mécanique respiratoire est particulièrement importante dans l’évaluation des poumons de donneurs pour la transplantation pulmonaire. Le protocole actuel est le premier du genre, offrant une méthode complète et reproductible par étapes pour évaluer la mécanique respiratoire à l’aide d’un modèle murin ex vivo . Il comprend des détails sur le modèle animal sélectionné, la récupération, le stockage et la préservation des poumons, ainsi que l’expérimentation à l’aide d’un système basé sur la technique de l’oscillation forcée. De plus, il décrit l’analyse des données, la signification clinique et les applications de la technique d’oscillation forcée dans l’étude d’un modèle ex vivo .
Introduction
La transplantation pulmonaire représente le seul traitement durable pour les maladies pulmonaires en phase terminale. Environ 4 600 personnes reçoivent une greffe de poumon chaque année dans le monde, mais près de 600 patients meurent sur la liste d’attente en raison de la pénurie de poumons de donneurscompatibles1,2. Dans le but d’augmenter le nombre de poumons disponibles, les systèmes d’attribution des donneurs sont continuellement ajustés, ce qui a conduit les chirurgiens à parcourir de plus grandes distances pour obtenir des organes de donneurs3. L’augmentation des distances augmente invariablement le temps ischémique froid, ce qui nécessite des méthodes supplémentaires de conservation des organes.
La norme actuelle pour la conservation d’un organe de donneur lors d’une transplantation pulmonaire est la conservation statique à froid à 4 °C, ce qui limite le temps de conservation à 6 à 8 h - une petite fenêtre de viabilité pour la transplantation4. Cependant, avec l’allongement des distances de déplacement et l’augmentation des temps ischémiques qui en résulte, l’évaluation de la fonction pulmonaire avant la transplantation est d’une importance cruciale4. Avec l’évolution des politiques en matière de transplantation pulmonaire, de nouvelles recherches ont été menées pour répondre à ce besoin. Récemment, des études ont suggéré que la conservation statique à froid à 10 °C est une température de stockage plus optimale pour la préservation pulmonaire, ce qui entraîne une amélioration de la fonction pulmonaire, de la résistance aux lésions et des taux comparables de dysfonctionnement primaire du greffon lorsqu’il est implanté 4,5,6,7,8. De plus, la recherche centrée sur la perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) a montré une amélioration significative de l’utilisation des poumons des donneurs et des transplantations sans préjudice pour les receveurs9. Bien que l’utilisation de l’EVLP pour élargir le bassin de donneurs pour la transplantation pulmonaire et prolonger la durée de conservation soit bien documentée, cette technologie est coûteuse, prend beaucoup de temps et nécessite une formation spécialisée pour en effectuer10. En tant que tel, il est nécessaire de disposer de méthodes supplémentaires pour étudier la fonction pulmonaire ex vivo qui soient complètes, peu coûteuses et reproductibles.
Les mesures traditionnelles de la mécanique pulmonaire, par exemple la compliance, la résistance, l’élasticité et les courbes pression-volume, peuvent être déterminées de manière fiable à l’aide de la pléthysmographie corporelle ou à l’aide de techniques de ventilation à l’aide d’un modèle à compartiment unique. Une mécanique plus détaillée peut être obtenue en utilisant le modèle d’oscillation forcée pour s’adapter au modèle de phase constante, qui peut répartir la mécanique des voies respiratoires en compartiments centraux et périphériques (résistance newtonienne, amortissement/élasticité tissulaire, hystérésivité)11. Bien que l’application de ces techniques soit reproductible et complète, l’exigence d’effectuer de telles mesures dans un modèle in vivo a été limitée, probablement parce que le poumon exsangulé perd sa structure au niveau de l’anneau d’entrée alvéolaire12. Cette étude a utilisé un ventilateur pour petits rongeurs basé sur la technique d’oscillation forcée disponible dans le commerce dans le but de développer un modèle ex vivo pour mieux caractériser la mécanique pulmonaire pour les applications de transplantation pulmonaire.
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Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité de la recherche animale conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris sauvages C57Bl/6, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 18 et 28 g, ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement sont fournis dans la table des matériaux.
1. Préparation
- Utilisez un microscope opératoire avec un grossissement jusqu’à 20x pour toutes les interventions chirurgicales.
- Nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux avant de commencer l’intervention. Autoclavez les instruments ou utilisez une solution de stérilisation appropriée pour maintenir des conditions d’asepsie.
2. Extraction des poumons du donneur
- Effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles.
REMARQUE : Cette étape est réalisée dans un espace chirurgical dédié et dans des conditions stériles. - Placez la souris dans une chambre d’induction anesthésique et induisez une anesthésie avec 5 % d’isoflurane dans l’oxygène et maintenez l’anesthésie avec 3,5 % d’isoflurane dans l’oxygène tout au long de la procédure (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
- Enregistrez le poids de la souris avant la première incision.
- Fixez la souris sur la table d’opération et assurez-vous que l’anesthésie est à la bonne profondeur en appliquant une pression sur un orteil. Si la souris se retire en douleur, augmentez l’anesthésie au besoin.
- Retirez les poumons du donneur en suivant la procédure standard13.
REMARQUE : Les poumons et le cœur ont été extraits en bloc pour perfuser les poumons ex vivo, et une partie de la trachée a été retirée pour une intubation ultérieure.
3. Stockage et préservation des poumons
- Une fois les poumons retirés du donneur, intubez la trachée avec un angio-cathéter intraveineux de 18 G en avançant soigneusement le cathéter, en veillant à ce qu’il ne perfore pas la trachée.
- Fixez la trachée sur la canule à l’aide d’une suture en soie 3-0, en assurant une fermeture étanche. Avancez l’angio-cathéter intraveineux de 18 G jusqu’à ce qu’il se trouve dans la voie d’éjection ventriculaire droite (RVOT), juste après la valve pulmonaire.
- Notez le moment où les poumons ont été retirés du corps.
- Conservez les poumons dans un tube conique de 50 mL contenant la solution de conservation disponible dans le commerce à 4 °C ou 10 °C pendant la nuit.
4. Configuration et étalonnage
- Commencez par mettre le système et/ou le logiciel sous tension.
- Lancez le programme, cliquez sur le bouton Créer une nouvelle étude et suivez les instructions à l’écran pour définir le protocole et attribuer les sujets.
- Cliquez sur Session d’expérimentation et connectez-vous à l’aide du prénom et du dernier sigle de l’utilisateur.
- Commencez à étiqueter les sujets selon une convention de nommage cohérente.
- Entrez le sexe, la date de naissance et le poids de chaque sujet.
- Sélectionnez et attribuez des sujets au site de mesure et confirmez les poids.
- Poursuivez la configuration et l’étalonnage du logiciel en suivant les instructions à l’écran.
REMARQUE : Lors de l’étalonnage de la tubulure, le même type de canule que celui utilisé pour l’intubation des poumons du donneur a été fixé à la tubulure en Y du système pour assurer l’uniformité. - Répétez l’étalonnage si les valeurs d’étalonnage se situent en dehors des plages acceptées.
- Annulez les invites pour commencer la ventilation jusqu’à ce que vous soyez prêt. Des sessions expérimentales avec ventilation et enregistrement des données peuvent être lancées ultérieurement.
5. Ventilation pulmonaire et acquisition de données
- Retirer les poumons du tube conique de 50 mL. Rincer la voie d’éjection ventriculaire droite (RVOT) à l’aide de l’angio-cathéter intraveineux de 18 G préalablement placé avec une solution de conservation supplémentaire à une dose de 60 mL/kg pour rincer les capillaires pulmonaires.
REMARQUE : Il faut prendre grand soin d’éviter la déshydratation des poumons du donneur, car il s’agit d’un facteur de confusion connu dans l’étude de la mécanique pulmonaire. - Fixez les poumons du donneur à l’appareil de ventilation et commencez l’expérience.
- Cliquez sur Démarrer la ventilation, et lorsque vous êtes prêt, appuyez sur Démarrer l’enregistrement pour commencer la session expérimentale.
REMARQUE : Le ventilateur utilisé pour cette étude a été réglé pour avoir une fréquence respiratoire de 150 respirations/min, un volume courant de 10 mL/kg et une PEP de 3. - Exécutez chaque tâche en double-cliquant sur la tâche d’évaluation de la mécanique pulmonaire dans la liste des tâches sur le côté droit de la page.
- Exécutez la tâche Inflation profonde située dans la liste des tâches pour vous assurer que les régions atélectiques sont recrutées et que les volumes pulmonaires ont été normalisés. Pour plus de détails, consultez la section Résultats.
- Poursuivez l’ordre des tâches.
REMARQUE : La fonction pulmonaire peut être évaluée par plusieurs tâches évaluant les propriétés mécaniques. Le gonflage profond normalise le volume pulmonaire, tandis que le Prime-8 stabilise la mécanique pulmonaire. PV-P et PV-V mesurent la conformité statique et dynamique, la résistance des voies respiratoires et la conductance. L’instantané 150 fournit une évaluation rapide de la résistance, de l’observance et de l’élasticité, tandis que QuickPrime évalue la résistance des voies respiratoires et des tissus ainsi que la viscoélasticité pulmonaire. Ces tâches permettent collectivement d’assurer une analyse complète de la fonction pulmonaire. Dans cet article, les données relatives aux tâches effectuées dans Deep Inflation, Snapshot 150 et QuickPrime (à l’aide d’équipements disponibles dans le commerce) sont fournies à titre de résultats représentatifs. Les volumes pulmonaires ont été normalisés entre les perturbations à l’aide de la tâche d’inflation profonde afin de minimiser les variables confusionnelles lors de l’interprétation des données. - Exécutez la séquence de tâches choisie en trois exemplaires.
- Cliquez sur Arrêter l’enregistrement , puis sur Arrêter la ventilation.
- Exportez les données individuellement ou passez au sujet suivant et répétez les étapes 5.1 à 5.9.
REMARQUE : Pour les données dérivées des perturbations Snapshot 150 et QuickPrime, un COD de >0,95 est requis pour une analyse fiable.
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Résultats
Une représentation graphique de la conception expérimentale est fournie pour le modèle de souris (figure 1). Les poumons ont été gonflés à l’aide d’un système de ventilation pour petits rongeurs basé sur la technique d’oscillation forcée disponible dans le commerce afin d’évaluer la mécanique respiratoire du tissu du donneur dans diverses conditions (figure 2). En comparant les résultats entre les groupes de poumons de donneurs conservés, on a constaté que les g...
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Discussion
Importance et applications potentielles
La mécanique respiratoire est couramment utilisée dans diverses applications pour étudier la pathologie pulmonaire et les lésions pulmonaires. L’étude de la mécanique respiratoire a été décrite à de nombreuses reprises pour la progression de maladies telles que le SDRA et dans les cas de ventilation assistée, mais a été beaucoup moins décrite dans la littérature en ce qui concerne la transplantation d’org...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucune relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée à tort comme un conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Sophie Paczensy pour l’utilisation du système de ventilation, et Colin Welsh pour son aide. La figure 1 a été créée à l’aide de biorender.com. Cette recherche a été soutenue par une subvention du South Carolina Clinical and Translational Institute (NIH/National Center for Advancing Translational Sciences) sous le numéro de bourse UL1-TR001450.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Angio-cathéter 18 G | B. Braun | 4251687-02 | Moyeu droit |
| Angio-cathéter 24 G | B. Braun | 4251601-02 | Seringue à embout droit |
| 3 mL | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| Suture en soie 3-0 | Medex | ETH-A304H | |
| 50 mL Tubes coniques | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70 % EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Chambre d’induction d’anesthésie | Appareil Harvard | 75-2030 | Chambre d’induction étanche à l’air pour rats |
| Appareil d’anesthésie | Appareil Harvard | 75-0238 | Système d’anesthésie mobile avec balayage passif |
| Masque d’anesthésie Appareil | Harvard | 59-8255 | Masque d’anesthésie pour rats |
| émoussée | Monde Precision Instruments | 501217 | Pince à pansement, 12,5 cm, droite, dentelée |
| C57Bl/6 souris | Charles River | Code de souche 027 ; | Type sauvage, 6-8 semaines, 18-28g |
| Balance numérique | Fisher Scientific | S72422 | |
| Système FlexiVent | Scireq | NC2926059 | ventilateur pour petits rongeurs basé sur la technique de l’oscillation forcée ; |
| Seringue à insuline, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Microscope opératoire ou loupes chirurgicales | AmScope | SM-3BZ-80S | Stéréomicroscope 3,5x - 90x |
| Solution Perfadex | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Cotons-tiges stériles | Puritan | 25-806 1WC | |
| Éponges de gaze stériles | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Ciseaux chirurgicaux | World Precision Instruments | 1962C | Ciseaux Metzenbaum |
Références
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Réimpressions et autorisations
