Article de méthode

Inoculation intradermique de Mycobacterium avium dans l’oreille de souris

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DOI :

10.3791/67675

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3 juillet 2025

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1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer une inoculation intradermique à faible dose de Mycobacterium avium dans une oreille de souris afin de refléter des conditions similaires à l’exposition.

Résumé

Contrairement aux expositions naturelles aux mycobactéries non tuberculeuses (MNT) ou aux infections dont la pathologie est fondée sur un organisme à réplication lente, l’infection par aérosol dans un modèle murin peut provoquer une prolifération élevée de la croissance bactérienne dans les poumons. Les aérosols chroniques et les infections systémiques peuvent être traités avec des médicaments antimycobactériens, ce qui pourrait également refléter une exposition antérieure, mais ces procédures sont longues et moins représentatives des expositions naturelles. L’objectif de ce protocole est de développer un modèle murin moins invasif de conditions d’exposition à MNT qui sont plus translationnelles. Ici, nous décrivons une méthode pour défier par voie intradermique des souris précliniques à travers le tissu de l’oreille en utilisant Mycobacterium avium (M. avium) pour imiter une exposition et permettre des réponses immunitaires à la bactérie sans maladie évidente. Dans cet article, nous décrivons la méthode d’injection intradermique de l’oreille et confirmons la présence d’une infection mycobactérienne soutenue et contenue, ce qui offre d’autres opportunités d’interroger les réponses immunitaires dans ce modèle in vivo .

Introduction

Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont une liste croissante d’espèces qui comprend un sous-ensemble de bactéries pathogènes souvent difficiles à traiter 1,2. Les MNT peuvent être trouvées dans des sources environnementales telles que le sol, l’eau et les aérosols d’eau 3,4,5. Malgré les tendances signalées suggérant une augmentation des infections à MNT, en tant que groupe, elles sont régulièrement signalées dans moins de 20 États des États-Unis6,7. Les personnes présentant des comorbidités spécifiques, y compris les personnes atteintes de mucoviscidose ou les personnes prenant des médicaments immunosuppresseurs, courent un risque accru d’infection productive par des espèces pathogènes de MNT2. Cependant, les individus en bonne santé sont présumés avoir été exposés de manière répétée et continue à des MNT par le biais de sources environnementales sans entraîner d’infections robustes ou chroniques. Il existe des preuves que l’exposition aux MNT peut « préconditionner » la réponse immunitaire globale aux antigènes mycobactériens dans les vaccinations8, les résultats après l’exposition à d’autres mycobactéries et les tests diagnostiques9, mais à ce jour, la modélisation préclinique de ce type d’exposition a été difficile.

Les infections pulmonaires chroniques10 et les traitements qui sont utilisés pour des études d’efficacité des vaccins spécifiques aux agents pathogènes ne représentent pas des expositions environnementales relativement inoffensives et les réponses immunitaires vraisemblablement différentes qui en résultent. Les infections chroniques, par exemple, peuvent induire des tissus gravement endommagés et une maladie disséminée10. Il y a eu récemment un élan pour combler cette lacune dans la recherche, y compris un modèle murin fournissant une exposition aux MNT par l’eau potable, du laboratoire Henao-Tamayo11, où la réponse immunitaire à cette exposition a été longuement interrogée. La tuberculose latente (TB) est un autre état pathologique de l’infection mycobactérienne qui a été difficile à modéliser chez les animaux précliniques. Le laboratoire Kaufmann a été le premier à mettre au point des infections intradermiques de l’oreille à M. tuberculosis chez des souris C57BL/612 et NOS2-/-13 afin d’imiter l’infection tuberculeuse latente, la réactivation et de caractériser les mécanismes des granulomes hypoxiques. Nemeth et coll. ont tiré parti du modèle d’oreille intradermique contenue pour imiter l’exposition antérieure à M. tuberculosis, en caractérisant des réponses immunitaires distinctes, afin de déterminer comment cela influait sur les résultats ultérieurs de la provocation14. Le modèle d’oreille intradermique a été signalé avec succès à l’aide de 104 unités formant colonies (UFC) des souches H37Rv et Erdman de M. tuberculosis , mais à ce jour, il n’a pas été testé à l’aide d’isolats.

L’objectif global de cette méthode est d’établir un modèle de provocation de l’oreille à MNT reproductible qui limite la maladie causée par d’autres voies de provocation, qui peuvent être étudiées plus en détail en ce qui concerne la réponse immunitaire à l’exposition. L’exposition de souris C57BL/6 sensibles à de fortes doses de M. avium dans l’eau potable entraîne davantage de conditions pseudo-infectieuses que les expositions11. Par conséquent, la raison d’être de la mise au point de cette technique comprend le succès antérieur de l’utilisation de M. tuberculosis comme organisme de provocation pour le derme de l’oreille avec une dose de provocation relativement plus élevée12,13,14. Ici, nous avons cherché à évaluer si le modèle peut être adapté avec succès pour un isolat de M. avium à la moitié de la concentration bactérienne précédemment rapportée 12,13,14 (10,2 UFC). Nous nous attendons à ce que la mise au point de nouveaux modèles d’exposition aux MNT, et non d’infection, aide à résoudre les questions biologiques en suspens sur cette influence sur la santé et la dynamique future des infections et de la vaccination.

Protocole

Les femelles C57BL/6 ont été achetées d’un laboratoire de recherche à l’âge de 6 à 7 semaines. Les souris ont été hébergées dans l’animalerie de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) du Seattle Children’s Research Institute (SCRI) dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et ont été manipulées conformément aux protocoles expérimentaux approuvés par le SCRI Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations pertinentes en matière de bien-être animal. L’institut fonctionne sous le certificat USDA #91-R-0061 et l’assurance PHS #A4337-01. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des souches bactériennes pour l’inoculation

  1. Dans une enceinte de biosécurité propice au travail bactérien, retirer un flacon de stock de Mycobacterium avium (ATCC 25291) de l’entreposage à -80 °C et décongeler à température ambiante.
    REMARQUE : Les concentrations de M. avium sont déterminées à l’avance, conformément aux meilleures pratiques pour tous les matériaux de base, en engolant les dilutions en série sur des plaques de gélose 7H10 et en comptant les unités formant colonies (UFC).
  2. À l’aide d’une aiguille à pointe émoussée de 26 G, remettre l’échantillon en suspension en faisant passer le liquide de haut en bas dans la seringue de 1,0 mL 10 fois ou plus pour créer une suspension uniforme.
  3. Vérifier la concentration de M. avium en plaquant 100 μL de dilutions en série 1:10 de la suspension sur des plaques de gélose 7H10. Incuber les plaques pendant 3 semaines à 37 °C et compter les colonies pour s’assurer que les concentrations d’inoculum sont exactes.
  4. Ajustez la concentration de M. avium à la dose souhaitée en diluant l’échantillon avec du PBS stérile. Conserver à température ambiante jusqu’au moment de l’utiliser.
    REMARQUE : Dans cette expérience, 102 UFC par dose de 10 μL ont été utilisés.

2. Préparation et anesthésie des animaux

  1. Avant d’administrer l’anesthésie, préparez une surface chaude, telle qu’un coussin chauffant, sur laquelle les cages des souris inoculées peuvent être maintenues dans le but de réguler leur température corporelle pendant la récupération.
  2. Injectez de la kétamine (100 mg/mL) et de la xylazine (20 mg/mL) cocktail chez la souris par voie intrapéritonéale.
  3. Une fois anesthésiées, effectuez un pincement des orteils pour confirmer que les souris sont suffisamment anesthésiées pour les manipulations de la procédure.
  4. Appliquez le lubrifiant pour les yeux de manière bilatérale.

3. Plateforme d’inoculation et préparation des matériaux

  1. Utilisez une planche de mousse pour créer un rebord sur lequel la souris peut se stabiliser pendant qu’elle est manipulée.
    REMARQUE : Le ruban adhésif double face aidera à maintenir l’oreille sur la plate-forme dans une orientation plate. L’adhésif ne doit pas être trop fort pour préserver la santé des tissus de l’oreille.
  2. Disposez une loupe éclairée pour voir la plate-forme.
  3. Rassemblez une seringue Hamilton stérile et une préparation de M. avium fonctionnelle à proximité.

4. Inoculation du derme de l’oreille

  1. Placez la souris en position couchée sur le rebord de manière à ce que l’oreille puisse être positionnée sur du ruban adhésif double face.
  2. Utilisez une légère pression pour aplatir l’oreille sur le ruban et assurez-vous que l’oreille ne bougera pas.
    REMARQUE : Des lingettes imbibées d’alcool peuvent être utilisées sur les oreilles avant l’injection pour aider à limiter la contamination croisée et l’infection par des commensaux cutanés après l’infection. Cependant, de telles infections n’ont pas été observées dans des études pilotes sans l’utilisation de lingettes imbibées d’alcool.
  3. Prélever 10 μL de préparation de M. avium contenant 100 UFC dans la seringue stérile de Hamilton.
    REMARQUE : Agitez la suspension de M. avium avant d’aspirer un volume de 10 μL pour vous assurer qu’il est homogène.
  4. Tenez la plate-forme d’une main et la seringue Hamilton de l’autre, en vous assurant que le côté biseauté de l’aiguille est pointé vers le haut (Figure 1).
  5. Placez la seringue Hamilton sous le derme de l’oreille en exerçant une très légère pression. Assurez-vous que l’aiguille ne traverse pas complètement le tissu mince de l’oreille.
  6. Une fois l’aiguille en place, appuyez sur le piston de la seringue à un rythme progressif et lent.
  7. Observez la couleur de l’oreille lors de l’administration.
    REMARQUE : Une administration réussie apparaîtra comme une élévation opaque au site d’injection, comme une bulle.
  8. Une fois le dosage complètement administré, vérifiez l’oreille de la souris et le ruban adhésif pour tout signe de fuite.
    REMARQUE : En cas de fuite, une dose perdue estimée peut être administrée à l’oreille opposée. Au minimum, l’animal doit être marqué et enregistré comme ayant peut-être reçu une dose inférieure à la dose cible.
  9. Lorsque le dosage est réussi, assurez-vous que la souris est replacée dans sa cage domestique pour être exposée à la surface chaude tout en étant surveillée jusqu’à ce qu’elle se soit réveillée avec succès de l’anesthésie.

5. Évaluation de la charge bactérienne

  1. Euthanasier les animaux conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux.
    1. Ici, l’euthanasie est complétée avec un minimum de deux méthodes par sacrifice. Pour cette procédure, les deux méthodes choisies sont l’utilisation de l’asphyxie au CO2 et de la luxation cervicale.
    2. Tout d’abord, étendez un tube pour distribuer du gazCO2 dans la cage domestique des souris et administrez le gaz jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signes de mouvement des souris. Attention à utiliser une cage qui ne permettra pas au gaz de s’échapper.
    3. Ensuite, disloquez les vertèbres cervicales par manipulation manuelle.
  2. Disséquer les oreilles d’animaux exposés à M. avium quatre semaines après l’exposition (28 jours, correspondant aux études antérieures12). Disséquez les oreilles de 2 souris à l’aide d’outils stériles. Insérez les oreilles dans des tubes coniques contenant un tampon UFC (PBS + 0,05 % Tween80) et utilisez un homogénéisateur de tissus pour homogénéiser jusqu’à ce qu’une suspension uniforme se forme. Les oreilles non contestées sont également traitées et servent de témoins.
    REMARQUE : Tous les points de temps et organes d’intérêt post-exposition peuvent être utilisés. Pour cette expérience, les poumons, la rate, les ganglions lymphatiques drainants et les organes cérébraux ont également été collectés.
  3. Ajouter 100 μL d’homogénat à 700 μL de tampon CFU dans un bloc de puits profond en dilution 1/8 fois. Répétez l’opération sur l’ensemble du bloc de manière à générer un minimum de 5 dilutions en série. Ajouter 50 à 100 μL d’homogénat pur ou de dilutions en série (dilutions 0 à 5 utilisées ici) à des trois plaques de gélose 7H10, répartir uniformément à l’aide d’épandeurs en T et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 à 3 semaines.
  4. Comptez les unités formant colonies (UFC) et transformez-les en log10 à des fins d’analyse dans un tableur.

Résultats

Nous avons utilisé le protocole détaillé ci-dessus pour déterminer si un modèle de provocation MNT reproductible utilisant le derme de l’oreille comme voie d’infection ou d’exposition pouvait être établi. Les oreilles ont été prélevées sur deux animaux à 28 jours après la provocation, homogénéisées et plaquées comme décrit sur le milieu sélectif des mycobactéries 7H10. Nous avons observé que M. avium persistait jusqu’à 28 jours dans les oreilles qui étaient sollicitées par voie intradermique et une absence de M. avium dans l’oreille non contestée (Figure 2).

Bien que nous n’ayons pas observé de dissémination vers l’oreille non contestée dans les 28 jours suivant l’infection, d’autres utilisateurs de ce modèle de derme de l’oreille pour la modélisation de la tuberculose latente ont observé une dissémination vers d’autres sites d’organes distaux14. Nous avons émis l’hypothèse qu’une dose plus faible de provocation et l’utilisation d’isolat de M. avium pourraient réduire la dissémination à des moments ultérieurs qui pourraient mieux refléter l’exposition par rapport à l’infection chronique. Par conséquent, l’euthanasie a été pratiquée sur des cohortes de souris n=5 ayant été proutées par M. avium 28, 56, 90 et 132 jours après l’infection. Les organes suivants ont été homogénéisés selon le même protocole que celui décrit pour les tissus de l’oreille : poumon, rate, ganglion lymphatique drainant (DLN) et cerveau. Cette voie de provocation a entraîné une dissémination sporadique au fil du temps, où moins de la moitié des animaux présentaient des UFC dénombrables dans les organes analysés 56 ou 90 jours après l’infection (tableau 1). 132 jours après la provocation, toutes les souris avaient des bactéries M . avium détectables dans leur rate (n = 5/5 des animaux évalués), mais semblaient héberger des bactéries minimes (n = 1/5 dans le DLN) ou aucune bactérie (n = 0/5 dans les poumons ou le cerveau) dans d’autres organes à ce moment-là (tableau 1).

figure-results-1
Figure 1 : Orientation d’une aiguille avec le biseau vers le haut. Avant l’insertion de l’aiguille, le côté biseauté doit être orienté vers le haut pour administrer correctement l’inoculum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Colonisation du tissu de l’oreille par M. avium 28 jours après la provocation. Des souris femelles C57BL/6 ont été testées dans l’oreille avec 102 UFC de Mycobacterium avium. L’oreille déficiente (+) a été comparée à l’oreille non défiée (-) à 28 jours, n = 2 animaux individuels d’une seule expérience montrée, chaque animal portant une couleur et un symbole différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Heure (jour)OrgueLog 10 CFU
PoumonRateRADCerveau
283.08, ND, ND, ND, ND2.81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,78, 0,90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1.53, 3.43, ND, ND, ND2.78, ND, ND, ND, ND1.20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0,60, 3,35, 3,26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = ganglion lymphatique drainant, ND = non détecté

Tableau 1 : Dissémination de M. avium à partir de l’oreille au fil du temps après la provocation. Les poumons, la rate, les ganglions lymphatiques drainants (DLN) et le cerveau ont été prélevés sur n = 5 souris par point de provocation post-test. Les tissus homogénéisés ont été plaqués et évalués pour la croissance bactérienne. Les UFC pour les organes se présentaient sous forme de valeurs transformées en log10 où les bactéries ont été comptées et non détectées (ND) où aucune UFC n’a été observée à aucune plaque de concentration. Données sur l’évolution temporelle représentatives d’une expérience.

Discussion

Ici, nous avons démontré comment défier de manière reproductible des souris avec des mycobactéries dans un modèle d’oreille intradermique contenue. Il est essentiel, lors de l’exécution de cette procédure, de suivre les précautions de stérilité et d’éviter les blessures par piqûre d’aiguille. Avec cette méthode d’inoculation, il est essentiel d’avoir une station de configuration appropriée et un bon éclairage pour s’assurer que l’espace du derme est ciblé et non perforé complètement par l’oreille. Si cela se produit, selon l’étude, une deuxième tentative peut être faite dans l’autre oreille. Les oreilles non traitées d’une même souris peuvent également être utilisées comme contrôle par souris. Cette méthode devrait être accessible aux chercheurs ayant des besoins minimes en matériel ou en temps. Consacrer des souris et du temps à l’entraînement contribue au taux de réussite de l’inoculation du protocole. Les erreurs les plus courantes dans cette technique sont de ne pas pénétrer dans l’espace intradermique avec la seringue (et de perforer l’oreille) ou d’enfoncer la seringue trop rapidement, provoquant une distribution incohérente ou un glissement de l’aiguille de l’espace intradermique. Un bon éclairage et un bon grossissement peuvent aider au bon positionnement de l’aiguille pour l’inoculation.

Nous utilisons la méthodologie pour les conditions d’exposition des MNT. La grande majorité de M. avium est contenue dans l’oreille ou le DLN. Cependant, une limite de cette méthodologie est que la dissémination vers les organes systémiques, à savoir la rate, a été observée chez tous les animaux évalués 132 jours après la provocation. Il peut y avoir un seuil d’inoculation bactérienne qui pourrait réduire la quantité ou la fréquence de la dissémination, ce qui pourrait être réalisé avec une étude de titrage. Cette procédure est susceptible de modifier à la fois l’organisme, par exemple, d’autres espèces de MNT, et la dose délivrée, en fonction de la question de recherche.

Le comportement humain (manque de traitement approprié de l’eau potable, pollution, tabagisme), l’augmentation du nombre de personnes dont la santé se détériore en raison de l’âge de15 ans et d’autres comorbidités, l’absence de tests de diagnostic appropriés et le changement climatique16 peuvent jouer un rôle dans l’augmentation des taux d’infections à MNT, et cette tendance est susceptible d’augmenter dans un avenir proche. Nous proposons que des modèles tels que l’administration de la muqueuse par l’eau potable11 ou les infections de l’oreille contenues dans l’intradermique avec MNT chez la souris offrent la possibilité de déterminer l’influence que cette exposition croissante aura sur la vaccination ultérieure et l’efficacité du vaccin. Bien que nous ayons adapté cette méthodologie d’un modèle d’oreille confinée pour M. avium, nous proposons qu’elle puisse être utilisée avec succès pour d’autres espèces de MNT en tant que technique d’exposition.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs expriment leur gratitude au personnel engagé du vivarium pour les soins exceptionnels qu’ils ont prodigués aux animaux tout au long de cette étude. Les auteurs souhaitent également remercier le laboratoire Henao-Tamayo de l’Université d’État du Colorado d’avoir partagé la souche de M. avium utilisée dans cette étude. Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires Aderem et Urdahl du Seattle Children’s Research Institute pour leur formation à la méthodologie originale. Ce projet a été financé en tout ou en partie par des fonds fédéraux de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, des Instituts nationaux de la santé, du ministère de la Santé et des Services sociaux, dans le cadre du contrat n° 75N93021C00029 (à RNC), et des subventions R01AI125160 et R01AI183642 (à RNC et SLB).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.05 % Tween80SigmaP6224
Seringue 1mLFisher15-823-434
7H10 gélose triplaquesMoltox21-40S234
26G aiguille émousséeFisherNC0981254
Armoire de biosécuritéNuaireNU-543-400
CO2 incubateurFisher Scientific15-103-0513
Ruban adhésif double faceScotch3136
Hamilton 701N seringue d’un microlitreFisher14-824-16
Omni tips en tissus dursFisher15-340-102
Coussin chauffantKent ScientificHTP-1500
Aiguille à insulineFisherNC1551333
KétaminePatterson Veterinary07-890-8598
Loupe lumineuseBrightechB07MMZ27QK
PBSThermoFisher10010072
Homogénéisateur de tissusOmniTH115
Support d’homogénéisateur de tissusOmniS1000
XylazinePatterson Veterinary07-808-1947

Références

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