Méthodologie améliorée pour l’administration de liquide dans le poumon de souris : intubation à l’aide d’un otoscope grand public

Résumé

Ce protocole montre comment le positionnement optimal d’une souris et l’insertion transorale d’un otoscope basé sur une caméra permettent de visualiser la glotte, une intubation rapide avec un traumatisme tissulaire minimal et une distribution constante de liquide dans les poumons.

Résumé

L’administration constante de liquides, y compris de thérapies potentielles, dans les poumons est essentielle pour la modélisation de la maladie pulmonaire et le développement thérapeutique préclinique. Cependant, les méthodes actuelles utilisées chez la souris - telles que l’aspiration oropharyngée par la méthode de traction de la langue - peuvent entraîner une administration variable. Nous décrivons ici l’utilisation d’un otoscope éclairé abordable, relié à un téléphone portable, pour visualiser la glotte et permettre une inoculation directe dans les voies respiratoires. Nous détaillons une technique de mise en scène optimisée avec des aides à l’éclairage et au positionnement adéquates. La manière dont l’intubation peut être réalisée de manière fiable à l’aide d’un cathéter flexible de 20 G avec ou sans lumière à fibre optique est également décrite. Cette technique réduit considérablement la variance de l’administration intrapulmonaire et augmente le volume de liquide délivré qui atteint les poumons. En raison de la variance réduite, des cohortes d’animaux de plus petite taille peuvent être utilisées lors de l’utilisation de cette méthode au lieu de l’instillation oropharyngée par la méthode de traction de la langue. Ce qui suit est une méthode pour une intubation efficace, rapide et cohérente des souris et une administration dans les poumons, y compris une confirmation robuste de la mise en place de la sonde endotrachéale. Grâce à cette méthodologie améliorée, une intubation cohérente et sûre et une administration efficace et reproductible dans les poumons sont à portée de main.

Introduction

À l’échelle mondiale, les maladies respiratoires sont la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans et constituent une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les adultes¹. En 2021, l’infection par le SRAS-CoV2 était la troisième cause de décès aux États-Unis². Les modèles murins sont souvent utilisés pour étudier les maladies pulmonaires, notamment l’asthme, la pneumonie, la maladie pulmonaire obstructive chronique et la fibrose pulmonaire. Presque tous ces modèles nécessitent l’administration d’agents liquides dans les poumons. Cela peut se faire par canulation directe de la trachée (généralement sous visualisation directe à l’aide d’une technique chirurgicale de coupe), administration intranasale ou aspiration oropharyngée par la méthode bien établie de tirage de la langue ^3,4,5. Cependant, ces techniques ont toutes des inconvénients. La formation de tissu cicatriciel après la technique d’incision chirurgicale la rend inappropriée pour les études nécessitant l’administration répétée d’agents dans les poumons, et les deux dernières techniques peuvent conduire à une distribution pulmonaire variable. De plus, lors de l’utilisation de la méthode d’extraction de la langue, un traumatisme tissulaire de la langue peut être prononcé, et l’efficacité de l’administration dépend du chercheur qui effectue la procédure, voir Figure 1.

Figure 1 : L’intubation guidée et l’instillation IT entraînent une meilleure administration dans les poumons et une moindre variabilité par rapport à l’extraction de la langue. (A) Trois chercheurs différents ont administré 50 μL d’encre de Chine diluée par traction de la langue, la méthode établie pour l’administration de l’oropharynx (OP). Deux chercheurs ont également administré de l’encre dans les poumons en utilisant l’intubation comme décrit. (B) Les poumons ont été retirés 1 à 4 h après l’accouchement et photographiés sous un grossissement de 2x. Les photographies ont été évaluées à l’aide d’ImageJ. (n = 6 (intubation) ou 9 (administration d’OP), résultats de 2 ou 3 répétitions indépendantes par 2 à 3 chercheurs différents, test T de Welch p<0,0001) (C) La variabilité de l’administration pulmonaire a également été calculée en pourcentage d’écart par rapport à la moyenne. L’administration de l’OP était beaucoup plus variable. (p = 0,0317, T-Test de Welsh, GraphPad Prism 10.2.3 toutes les statistiques et tous les graphiques) (Des souris mâles et femelles C57BL/6J ont été utilisées, elles étaient âgées de ~10 semaines.) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’anatomie murine rend l’intubation difficile et chronophage. La bouche est petite et le tissu buccal peut obstruer la vue d’un chercheur sur la rima glottidis⁶. De plus, les cordes vocales sont très petites et il peut être difficile de les voir car elles se trouvent près de la base de la langue. Enfin, il est difficile de confirmer le bon positionnement de la sonde endotrachéale car le faible volume courant ne parvient souvent pas à embuer un miroir⁷. Ces difficultés ont encouragé une série de techniques innovantes pour intuber les souris. Ces méthodes améliorées comprennent l’utilisation d’un laryngoscope néonatal et d’un fil pour faire avancer un cathéter dans la trachée ^8,9, l’utilisation d’une source lumineuse à fibre optique pour guider et rigidifier le cathéter^10,11 et l’utilisation d’un flux vidéo en direct⁶. Plus récemment, l’utilisation d’un otoscope clinique a contribué à l’intubation orotrachéale¹². D’autres ont utilisé la transillumination pour visualiser la glotte et intuber les souris ^7,13,14. Cependant, ces méthodes présentent de nombreux inconvénients. L’utilisation d’agents dépilatoires sur le cou de la souris et la proximité de l’animal avec une source de lumière chaude font de la transillumination une approche loin d’être idéale. L’utilisation de l’aiguille à l’intérieur du cathéter ou l’insertion d’instruments tranchants dans la bouche signifie que certaines méthodes pour rigidifier le cathéter exposent les animaux à des risques indus. Enfin, faire une incision sur la trachée pour confirmer la mise en place présente des inconvénients importants, notamment la nécessité de la stérilité et l’accumulation de tissu cicatriciel. À ce stade, l’instillation intratrachéale par intubation s’est avérée trop difficile pour être adoptée à grande échelle¹⁵ et les progrès du développement méthodologique sont restés cloisonnés et inutilisés par de nombreux laboratoires¹⁵. D’autres études se sont concentrées sur le choix de l’anesthésique pendant l’accouchement, constatant que la kétamine peut avoir des avantages par rapport à l’isoflurane⁵. Cependant, l’isoflurane, n’étant pas une substance contrôlée et s’estompant rapidement à la fin de la procédure, présentait des avantages attrayants, nous avons donc utilisé cette forme d’anesthésie tout en optimisant d’autres aspects de cette méthodologie^16,17.

La méthode que nous décrivons surmonte les défis de visualisation que d’autres ont tenté de résoudre, atténue les risques pour les animaux de laboratoire, diminue le temps nécessaire pour instiller de petits volumes par voie intratrachéale via une sonde endotrachéale, augmente le volume de liquide atteignant le poumon et offre une méthode améliorée pour la confirmation de la mise en place de la sonde endotrachéale. L’utilisation d’un support de suspension, de mains aimantées (pinces crocodiles sur des bras flexibles fixés à une base) et d’un éclairage plus lumineux permettent à un chercheur d’effectuer une administration intratrachéale efficace. La visualisation est facilitée par un otoscope « à la maison » avec connectivité WIFI. Cet appareil est plus abordable que les instruments d’intubation commerciaux. De plus, la connectivité WIFI permet un flux vidéo simultané sur un appareil portable (tel qu’un téléphone portable), ce qui le rend adapté à l’entraînement. L’intubation peut utiliser soit une source lumineuse à fibre optique enfilée à travers un cathéter flexible (PTFE) de 20 g x 1" (aiguille retirée), soit le cathéter sans la lumière. La profondeur est contrôlée par deux méthodes : l’ajout d’un coin de sécurité d’intubation (une protection conique sur le cathéter) et l’observation de la profondeur dans le flux vidéo. La mise en place de la sonde endotrachéale est confirmée à l’aide de la « méthode des bulles » pour visualiser le volume courant plus clairement que la méthode traditionnelle du brouillard miroir¹⁸. C’est moins stressant pour l’animal que de compter sur l’obstruction trachéale pour modifier l’urgence respiratoire¹⁰ afin de confirmer le placement. L’utilisation combinée d’une tubulure d’extension couplée au cathéter pour confirmer la réussite de l’intubation (ci-après dénommée la méthode des bulles), simplifiée par Watanabe et. al⁷, et un vidéo-otoscope grand public en une seule procédure fait de l’intubation une méthode pratique d’administration thérapeutique dans les poumons et une nette amélioration de la méthode de tirage de la langue (voir Figure 1). Si vous recherchez une méthode fiable, cohérente et abordable pour l’administration de liquide non chirurgical dans les poumons de souris, en particulier sans l’utilisation de substances contrôlées (comme la kétamine) ou d’équipements coûteux, la méthode suivante peut être idéale.

Protocole

Il est impératif que ces procédures soient examinées et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC), dont le nom figure sur le protocole, et que le personnel vétérinaire soit consulté avant de procéder. L’IACUC de notre établissement a approuvé le protocole avant de commencer l’expérience et a examiné le contenu de la vidéo avant de la soumettre. Le soutien et la formation ont été reçus par l’intermédiaire du département de médecine comparée de Tulane afin d’assurer le plus haut niveau de soins pour tous nos animaux de laboratoire.

1. Mettre en place

REMARQUE : reportez-vous à la Figure 2 pour la configuration.

Figure 2 : La station utilisée pour l’intubation guidée est préparée comme indiqué. De gauche à droite : pipettes pour l’administration, tube à bulles pour confirmer le placement approprié de la sonde endotrachéale, pinces, spatule, spéculum nasal pédiatrique (discuté mais non nécessaire pour cette procédure), mains secourables, lumière grossissante, support de souris avec cône nasal, sonde à fibre optique, chambre d’induction d’anesthésie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Nettoyez la cale de sécurité fournie avec le kit d’intubation avec un tampon de préparation à l’isopropanol. Glissez la cale de sécurité propre (verte sur la vidéo) sur la canule flexible de 20 G et jetez l’aiguille fournie en toute sécurité.
   REMARQUE : Le kit d’intubation des rongeurs (Table des matériaux) utilisé comprend des cales de sécurité pour l’intubation. Il s’agit de petits manchons coniques qui s’adaptent à un cathéter flexible de 20 G x 1 pouce. Ils empêchent le cathéter d’endommager la carène.
2. Rassemblez les autres outils nécessaires, y compris un téléphone portable, un otoscope commercial, un support de souris avec un cône nasal, des pinces courbées finement dentelées, le tube endotrachéal préparé (à partir de 1.1) et la lumière à fibre optique si vous l’utilisez. Nettoyez tous ces éléments avec des tampons de préparation à l’isopropanol avant utilisation.
3. Prenez environ 20 cm de tube flexible. Pliez-le en forme de U, ajoutez une connexion Luer Lock à une extrémité et fixez-le avec une attache torsadée. Ajoutez 200 à 300 μL d’eau filtrée stérile ou d’encre de Chine dans le tube. Ci-après, cet assemblage est appelé « tube à bulles ».
4. Faites une boucle de suture en attachant ~13 cm de suture en soie tressée de taille 0 en cercle. Placez cette boucle en haut du support et assurez-vous que les deux côtés de la suture sont fixés et que le support est propre. Placez le support de souris sur la base de la loupe en métal. Positionnez les mains serviables autour de l’endroit où se trouvera la bouche de la souris.
   REMARQUE : De nombreux fournisseurs fabriquent des supports interchangeables (voir le tableau des matériaux), et un peut être fabriqué en laboratoire à moindre coût ^4,7,14. Une suture en soie tressée de taille 0 a été utilisée pour suspendre l’animal. Cependant, l’utilisation d’autres matériaux dans le même but a été décrite ^4,13.
5. Placez une souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie. Utiliser un débit constant O₂ à 0,8 L/min et 2 % d’isoflurane. Anesthésie suffisamment l’animal (voir note) pour qu’il ne se réveille pas lors de la mise en place du cône nasal. Ne supprimez pas de manière significative la fréquence respiratoire de la souris. Des respirations régulières aident à apprécier les cordes vocales.
   REMARQUE : La fréquence respiratoire de la souris doit être normale. Ce critère est utilisé pour établir la profondeur appropriée de l’anesthésie. Celle-ci peut varier d’un animal à l’autre et peut dépasser 200 respirations/min. En tant que tel, il n’est pas pratique ou nécessaire de compter les respirations ou d’utiliser un pincement des orteils.
   ATTENTION : Cette procédure peut être interrompue si nécessaire. Cependant, les animaux ne doivent pas rester dans la chambre d’induction plus longtemps que nécessaire.
6. Connectez l’otoscope à un téléphone portable et assurez-vous que le flux vidéo est stable.
   ATTENTION : Pour minimiser l’exposition des chercheurs à l’isoflurane pendant cette procédure, utilisez un respirateur chimique si vous effectuez plusieurs intubations ou si vous vous entraînez à cette méthode. Vous pouvez également effectuer la procédure dans une hotte.

2. Mise en scène d’animaux

1. Dès que le premier animal est endormi, retirez-le de la chambre d’induction, décortiquez-le et placez ses dents supérieures sur la longueur de la suture. Appliquez une légère tension sur l’animal pour maintenir le positionnement de la suture tout en reposant la souris sur le support.
   REMARQUE : En moyenne, les animaux sont anesthésiés pendant un total de 2 minutes, y compris l’induction. Cela réduit considérablement le risque pour l’animal, élimine le besoin de lubrification ophtalmique et empêche l’accumulation de salive. Veillez à garder les animaux sous sédation le moins longtemps possible.
2. Ajustez légèrement l’angle du cou vers l’arrière (en plaçant le cou en extension mineure, 5°-15°). Poussez doucement le cône nasal sur les narines. N’enfoncez pas fermement le cône, car il pourrait interférer avec la suture, suspendant la souris.
3. Saisissez fermement la langue aussi près que possible de la lèvre inférieure, à l’aide de grandes pinces courbées finement dentelées. Tirez-le vers le bas et éloignez-le des dents supérieures vers un côté des dents inférieures.
   ATTENTION : Une traction prolongée, une tension excessive ou l’écrasement de la langue peuvent compromettre la santé de l’animal. Veuillez surveiller la langue pour détecter des signes de traumatisme (ecchymoses, saignements, gonflement ou dessiccation) et, si vous observez, interrompre la procédure et alerter le personnel vétérinaire.
4. Si vous utilisez des mains secourables, soutenez les pinces dans cette position. Selon l’expérience et l’acuité visuelle du chercheur, une loupe éclairée peut aider à positionner l’animal de manière appropriée.
5. Faites passer la lumière à fibre optique (le cas échéant) à travers le cathéter flexible avec la cale de sécurité d’intubation (verte dans la vidéo) en place.
   REMARQUE : Ne fixez pas trop fermement le câble à fibre optique à la source lumineuse. En poussant trop fort, il est difficile d’enlever la lumière tout en laissant le tube endotrachéal en place.

3. Appréciation visuelle des cordes vocales et intubation

1. Avec l’otoscope dans la main non dominante, appuyez légèrement sur la langue. Ensuite, inclinez la caméra et sa source lumineuse pour visualiser les cordes vocales près de la base de la langue.
   REMARQUE : De légères variations dans l’anatomie et la couleur des tissus peuvent rendre l’orientation difficile. Utilisez le mouvement associé à la respiration pour confirmer l’identification structurelle.
2. Avec la lumière à fibre optique allumée (le cas échéant), faites passer la canule le long du haut de l’otoscope, en établissant un léger contact avec la base de la langue ou la partie labisale de l’otoscope à titre de référence. Avancez-le dans la bouche de la souris entre la palette molle et la lèvre de l’otoscope.
   REMARQUE : Si la lumière à fibre optique n’est pas utilisée, le « tube à bulles » décrit à l’étape 4 peut être fixé au cathéter à ce stade. Un éclairage vif et ciblé dans la bouche de la souris est nécessaire pour cette modification de la procédure.
3. Ajustez l’angle d’approche de manière à ce que le cathéter soit très peu profond. Immédiatement après avoir inséré le cathéter (à moins de 1 mm au-delà des cordes vocales), soulevez l’extrémité du cathéter de manière à ce qu’il soit presque parallèle à la paillasse. Cela empêche l’épiglotte de forcer le cathéter dorsalement dans l’œsophage. Surtout pendant l’entraînement, en cas de difficulté, ou au début de son expérience, l’utilisation du flux vidéo est inestimable pour placer le tube endotrachéal entre les cordes vocales.
   REMARQUE : La production de salive n’obstrue pas la visualisation des cordes vocales pendant la fin de cette procédure. Cependant, l’utilisation d’un applicateur en coton à pointe de lance pour éliminer la salive obstruante est décrite, dans des publications antérieures, lors de l’intubation de rats¹⁹. Cette méthode peut s’avérer utile si la salive devient un problème.
   1. Si vous rencontrez une résistance, retirez immédiatement le cathéter et laissez les respirations revenir à la normale. Si des saignements sont observés, consulter le personnel vétérinaire.
      REMARQUE : Il ne devrait y avoir presque aucune résistance lors de l’avancement du cathéter.

4. Confirmation de la mise en place de la sonde endotrachéale

1. Confirmez visuellement que la sonde endotrachéale est au bon endroit à l’aide de l’otoscope. De plus, assurez-vous du bon placement de la trompe en considérant que la trachée offre moins de résistance lors de la mise en place que l’œsophage. Observez que dans la position appropriée, la sonde endotrachéale est à ~5 mm au-delà des cordes vocales. Recherchez la lumière de la source de fibre optique qui brille à travers la peau du cou pour valider à nouveau que le placement est correct.
   REMARQUE : La cale de sécurité d’intubation doit empêcher l’insertion trop loin de la sonde endotrachéale. La cale de sécurité empêche les traumatismes de la carène ; Cependant, il n’est pas nécessaire qu’il empêche l’avancement. Il doit être utilisé comme un dispositif de sécurité et la profondeur optimale est souvent moins profonde que celle autorisée par le coin.
2. Ensuite, tout en maintenant le tube endotrachéal en place, retirez la lumière à fibre optique. Assurez-vous que le cathéter est correctement placé en utilisant la « méthode des bulles » (détaillée ci-dessous) plutôt que la buée sur le miroir.
3. Récupérez le tube à bulles préparé à l’étape 1.3. Préparez-le avant la procédure et réutilisez-le pour tous les animaux.
   ATTENTION : Les 200-300 μL d’eau ou d’encre dans le tube à bulles ne doivent jamais être aspirés. Pour éviter cela, assurez-vous que le liquide est éloigné de la serrure Luer.
4. Une fois le tube endotrachéal en place, fixez le tube à bulles en place à l’aide du verrou Luer. Le volume courant doit être immédiatement apparent. Sinon, la sonde endotrachéale est mal placée. Retirez-le rapidement et laissez la fréquence respiratoire normale de la souris revenir.
   ATTENTION : Mal placer le cathéter dans l’œsophage comprimera la trachée, empêchant une respiration suffisante. L’égarement s’accompagne souvent d’une respiration laborieuse (y compris une contribution appréciable des muscles intercostaux) et/ou d’une diminution spectaculaire de la fréquence respiratoire. De plus, la canulation de l’œsophage peut entraîner un spasme musculaire rendant l’intubation ultérieure plus difficile ; Pour cette raison, nous conseillons l’utilisation de plusieurs animaux pendant l’entraînement.

5. Administration intratrachéale

ATTENTION : Tout comme la méthode de tirage de la langue pour l’accouchement oropharyngé, l’accouchement par intubation risque de noyer l’animal. Chez les souris adolescentes et adultes, 50 μL est un volume de liquide généralement sûr à délivrer et est suffisant pour se propager dans tous les poumons.

1. Si vous utilisez une seringue pour l’administration : Détachez le tuyau bulle et le Luer lock du cathéter, fixez une seringue Luer Slip chargée et appuyez sur le piston pour fournir le volume désiré (50 μL maximum).
2. Si vous utilisez une pipette pour l’administration : Pipeter le volume souhaité (50 μL maximum) directement dans le cathéter et laisser la souris inhaler la solution.
   REMARQUE : Si vous vous entraînez, envisagez d’utiliser un indicateur tel que dilué, encre de Chine filtrée ou bleu de méthylène.
3. Pour assurer une distribution diffuse dans les poumons, rincez le liquide délivré dans les poumons avec jusqu’à 500 μL d’air²⁰. Cela peut être fait soit à l’aide d’une seringue Luer lock préchargée de 0,5 ml, soit d’une pipette P1000 équipée d’un embout filtrant, qui ont tous deux fait leurs preuves. Si vous le souhaitez, plusieurs dépressions de la pipette peuvent être effectuées sans risquer une aspiration négative du liquide délivré.
   MISE EN GARDE : Si vous inoculez l’animal à l’aide de cette méthode, envisagez de diminuer la concentration d’inoculum en raison de l’efficacité accrue de l’administration par rapport à l’aspiration oropharyngée ou à l’administration intranasale.
   REMARQUE : L’utilisation d’une quantité supérieure au volume courant (~200 μL) peut être nécessaire lors du rinçage de l’inoculum à l’air. Cependant, l’utilisation de 500 μL ne risque pas de barotraumatisme car il ne représente qu’environ la moitié de la capacité vitale²¹. Les souris adultes ont une capacité de réserve inspiratoire d’environ ~800 μL, donc même si la souris a inspiré immédiatement avant le rinçage, le barotraumatisme ne se produit pas²¹. Demandez-vous si des volumes de rinçage à l’air plus faibles pourraient répondre à vos besoins pour la distribution de l’inoculum (100-200 μL a été suggéré).

6. Évaluation de la livraison

REMARQUE : Cela n’est fait que si l’on s’entraîne ou pratique la procédure.

1. Euthanasier l’animal sans cruauté selon le protocole approuvé par l’IACUC. L’asphyxie au CO₂ comme méthode principale d’euthanasie et la luxation cervicale comme méthode de confirmation de l’euthanasie ont été employées ici.
2. Ouvrez la paroi thoracique et retirez les poumons. Pour ce faire, ouvrez le péritoine, accédez au diaphragme par le côté caudal et perforez-le avec une petite paire de ciseaux où l’on peut voir le cœur. Cela provoquera la rétraction des poumons et donnera plus d’espace pour ouvrir la cavité thoracique en coupant les côtes.
   REMARQUE : Si une perfusion pour réduire le sang dans les poumons est nécessaire, effectuez la procédure à travers le ventricule droit du cœur à ce stade.
3. Rincer brièvement les poumons avec 1 mL de PBS stérile après l’avoir retiré. Posez-les à plat sur une surface blanche (comme une éponge chirurgicale) pour exposer le maximum de surface tout en maintenant le positionnement relatif des lobes.
4. Photographier les poumons ex vivo (nous avons utilisé un téléphone portable), ouvrir les images dans ImageJ, et quantifier les zones colorées et non colorées en traçant le contour de la façade du colorant. Quantifiez la zone colorée à l’aide d’un chercheur indépendant en aveugle pour éviter les biais.
   REMARQUE : Si vous utilisez la luminescence et l’IVIS, comme illustré à la figure 3, une imagerie en direct in vivo doit être effectuée au lieu de l’étape 6.

Résultats

Comme le montrent les figures 1 et 3, l’inoculation intrapulmonaire à l’aide de la méthode traditionnelle de traction de la langue (administration oropharyngée) a entraîné une distribution inégale de l’encre et une plus grande variabilité entre les chercheurs. En revanche, l’instillation d’IT après l’intubation a conduit à une administration plus cohérente dans les poumons droit et gauche et était moins variable (figures 1C et figure 3D). Dans les poumons des animaux ayant reçu de l’encre par aspiration oropharyngée à l’aide de la langue, l’encre est subtile et n’est présente qu’à proximité des grandes voies respiratoires des animaux (Figure 1A). En revanche, lorsque l’intubation guidée a été utilisée pour administrer l’encre, elle s’est propagée beaucoup plus loin dans les tissus, marquant une zone beaucoup plus grande des poumons. Lorsque la surface pulmonaire tachée par l’encre a été comparée entre les méthodes, la méthode d’intubation s’est avérée largement supérieure à l’extraction de la langue (Figure 1B). La variabilité de la quantité d’encre distribuée était également considérablement plus faible dans les conditions d’intubation (figure 1C). L’augmentation de la surface pulmonaire colorée et la moindre variabilité de la quantité de liquide atteignant les poumons suggèrent fortement que l’administration de l’IT est supérieure à l’extraction de la langue.

Comme on le voit dans la vidéo 1, les endoscopes traditionnels (tels que publiés précédemment) ont une distance focale trop longue pour apprécier les cordes vocales et guider le placement du tube endotrachéal ^6,19. En revanche, les images vidéo prises à l’aide d’un otoscope grand public (figure S1 et horodatages : 6:34 et 7:05 dans la vidéo) avaient une bien meilleure résolution, ce qui a permis d’améliorer la visualisation de la glotte.

Cette méthode d’intubation comprend de multiples vérifications de l’emplacement de la sonde dans la trachée. Le volume courant de la souris était facilement apparent lors de l’utilisation de la méthode des bulles (figure S2 et horodatage : 8:25) et agit comme une assurance finale que tout liquide délivré entrera dans les poumons.

Pour évaluer davantage la variance des deux méthodes d’administration, nous avons évalué l’expression du transgène dans le tissu pulmonaire après que des souris aient été inoculées avec 1 x 10¹¹ vg d’AAV6.2-Luciférase en utilisant les deux méthodes différentes (instillation oropharyngée par la méthode de traction de la langue ou administration intratrachéale après intubation guidée). Sept jours après l’administration du vecteur, des mesures de luminescence ont été prises à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (IVIS) (Figure 3A). Ensuite, nous avons calculé la radiance moyenne dans les deux poumons. 10 min avant l’imagerie (30 s d’exposition), on leur a injecté (par voie sous-cutanée) 200 μL de luciférine (15 mg/mL). Comme le montre la figure 3B, les animaux ayant reçu le vecteur par instillation oropharyngée avaient un signal luminescent largement distribué dans la région thoracique et nasale. En revanche, les animaux ayant reçu le vecteur par administration intratrachéale à l’aide de l’intubation guidée ont montré une luminescence concentrée dans les poumons. La radiance moyenne chez les animaux intubés était considérablement plus élevée que celle de l’administration oropharyngée, ce qui indique une amélioration de l’efficacité de l’administration du vecteur dans les poumons et une diminution de la variabilité de l’administration, calculée à l’aide de la différence par rapport à la moyenne (figures 3C et 3D).

Les résultats positifs de la méthode d’intubation étaient une instillation reproductible allant jusqu’à 50 μL dans les poumons de souris (réalisée sur les figures 1 et 3), avec une distribution diffuse dans tout le poumon (comme en évidence sur la figure 1) et non dans d’autres zones (comme les voies respiratoires supérieures/le nez comme on le voit sur la figure 3).

Tout dommage causé à l’animal, un stress excessif, une réduction du volume de liquide atteignant les poumons, une mauvaise distribution de l’inoculum dans les poumons ou des besoins prolongés en matière de formation auraient constitué un résultat négatif, mais ne se sont pas produits.

Vidéo 1 : Une vue endoscopique traditionnelle de l’oropharynx et des cordes vocales de la souris est floue et difficile à utiliser efficacement. La distance focale de 3 cm de cet endoscope signifie que les cordes vocales et l’orientation sont difficiles à apprécier. Langue en bas à gauche. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure 3 : L’intubation permet une plus grande distribution dans les poumons avec moins de variabilité par rapport à l’aspiration en O.P. (A) Des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 10 semaines ont reçu une dose de 1x10¹¹ vg d’AAV6.2-Luciférase (Penn Vector Core), puis évaluées par imagerie bioluminescente in vivo (IVIS) 7 jours plus tard. 10 min avant l’imagerie (30 s d’exposition), on leur a injecté (par voie sous-cutanée) 200 μL de luciférine (GoldBio, 15 mg/mL). (Créé avec biorender.com) (B) Images IVIS représentatives de souris recevant l’AAV6.2-luciférase par aspiration OP (traction de la langue, à gauche) ou administration IT (intubation, droite). Les régions d’intérêt sont de la même taille et la luminance moyenne à l’intérieur de la région est indiquée dans l’image. (C) Quantification du signal de la luciférase chez les souris par aspiration OP (n = 7) par rapport à l’intubation (n = 5). p<0,0001 par le test t de Welsh non apparié avec la transformation après logarithme des données brutes de luciférase. (D) Écart par rapport à la moyenne en pourcentage de la luminance moyenne moyenne. (p=0,0381, test T de Welsh) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure S1 : Des exemples d’images de l’otoscope grand public utilisé dans le protocole décrit pour l’intubation guidée (à gauche) et d’un endoscope de coût et de disponibilité similaires (à droite) sont présentés. Notez les différences nettes de mise au point entre les images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2 : Un exemple d’image montrant le tube à bulles en cours d’utilisation. Le volume courant déplace rapidement la gouttelette dans le tube à bulles de plusieurs centimètres. La gouttelette se déplace très peu si le tube se trouve dans l’œsophage. La fréquence respiratoire et le volume courant ont pu être estimés par cette méthode. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3 : Un ensemble d’éclairage de base qui élimine la nécessité d’acheter un kit d’éclairage à fibre optique coûteux. Une aiguille de 20 G a été insérée dans un câble à fibre optique conique de 50 ml de 0,75 mm acheté à bas prix (et en vrac) et coupé à la longueur (~1 m) avec une lame de rasoir et scotché en place. Il n’était pas nécessaire de fixer le cathéter en place en raison de l’ajustement serré du câble à fibre optique. La fixation du couvercle conique sur la lampe de poche d’un téléphone portable permet une transduction de lumière suffisante pour effectuer l’intubation dans une pièce sombre. Cet assemblage permet de réduire encore les coûts supportés par un laboratoire intégrant cette technique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’intubation et l’instillation intratrachéale sont les meilleures méthodes d’administration de liquide dans les poumons, mais les nombreux défis présentés par l’anatomie murine ont empêché une adoption généralisée dans les laboratoires de recherche pulmonaire¹⁵. Bien qu’elle assure l’administration efficace d’un inoculum dans le poumon, un inconvénient potentiel de l’administration d’IT par cette technique et d’autres techniques d’intubation est le contournement des voies respiratoires supérieures. L’administration intranasale est une méthode éprouvée qui ne contourne pas les voies respiratoires supérieures. Bien que l’administration intranasale soit souvent utilisée dans les laboratoires de virologie pulmonaire et puisse être plus efficace dans certains cas²², elle ne reflète pas la voie d’exposition naturelle²³ pour certains agents aspirés, entraîne des quantités plus variables d’inoculum dans les poumons²⁴ et est moins efficace lors de l’utilisation de l’isoflurane comme anesthésique⁵. À ce titre, des travaux approfondis ont été réalisés sur les appareils d’aérosolisation et leur comparaison avec d’autres techniques d’administration pulmonaire²⁵, mais ces méthodes présentent des dangers associés aux aérosols et ont tendance à être coûteuses. Toutes ces difficultés ont conduit à l’instillation oropharyngée par traction de la langue²⁶, étant la méthode préférée pour l’administration de liquide pulmonaire dans de nombreux laboratoires. Comme nous l’avons montré, cette méthode est beaucoup plus variable que l’instillation intratrachéale après intubation. De plus, l’administration par la méthode de traction de la langue ne peut pas être évaluée pendant l’administration, et un traumatisme excessif peut être causé à la langue de souris en raison de la tension nécessaire pour empêcher l’ingestion. La langue est également maintenue dans la technique d’intubation guidée et d’instillation IT. Cependant, comme le flux vidéo montre une glotte, un chercheur utilisant notre méthode n’a pas besoin de forcer le positionnement du larynx en exerçant une tension importante sur la langue. Cette diminution de la traction provoque moins de traumatismes tissulaires. Cependant, malgré les avantages considérables présentés par l’intubation et l’instillation informatique, des défis ont entravé son utilisation dans certains laboratoires. Par exemple : la compression de la trachée due à une canulation erronée de l’œsophage peut obstruer la respiration et augmenter la mortalité ; l’insertion trop profonde du tube endotrachéal peut entraîner des lésions de la carène ou des bronches principales ; Enfin, l’intubation murine par les méthodes traditionnelles prend beaucoup de temps, ce qui la rend peu pratique pour la plupart des chercheurs cherchant à obtenir une administration intrapulmonaire fiable. Notre méthode aborde les difficultés associées à l’intubation chez la souris, en surmontant même les barrières anatomiques à l’intubation des souris.

Plusieurs méthodes ont été proposées pour surmonter les défis anatomiques de l’intubation murine en mettant en œuvre des aides visuelles. Par exemple, l’utilisation d’un endoscope traditionnel a été proposée⁶. Cependant, la longue profondeur focale de l’instrument est mal adaptée à une utilisation pour l’intubation murine (Figure S1). Cela est également évident dans la vidéo 1, où les cordes vocales peuvent être vues mais sont floues. Les otoscopes cliniques ont également été utilisés pour la laryngoscopie^{directe 12}. Cependant, le coût des otoscopes cliniques et l’absence de flux vidéo les rendent inaccessibles pour la plupart des laboratoires et mal adaptés à la formation. L’utilisation d’un otoscope grand public largement disponible a considérablement amélioré la praticité de l’intubation guidée. La distance focale plus courte, le corps plus petit et la lèvre abaisseuse allongée permettent un flux vidéo plus clair, une meilleure maniabilité et un meilleur positionnement, et la lèvre de l’otoscope peut être utilisée pour appliquer une pression à la base de la langue, ce qui améliore l’accès à la rima glottidis. Au-delà de ces aides visuelles, la transillumination a également été utilisée pour visualiser avec succès la glotte et intuber les souris ^7,13,14. Cependant, les approches basées sur la transillumination peuvent nécessiter des agents dépilatoires sur la zone recouvrant le cou de la souris, à proximité d’une source de lumière chaude, l’utilisation de l’aiguille dans le cathéter, l’insertion d’instruments tranchants dans la bouche de la souris et/ou une petite incision à faire sur la trachée pour confirmer le placement. La méthode décrite ici évite ces risques et s’appuie sur les meilleurs aspects de ces méthodes publiées. En plus de surmonter les obstacles anatomiques à l’intubation, des considérations de coût ont été prises en compte dans notre méthode.

Ensemble, l’utilisation de mains secourables, d’un support de souris, de l’otoscope et d’une lumière à fibre optique rendent l’intubation plus facile à apprendre et beaucoup plus rapide à réaliser, à un coût réduit pour les laboratoires. Le coût du support d’intubation disponible dans le commerce peut être évité en utilisant un support²⁷ fait à la main. Le coût de l’assemblage de la lumière à fibre optique peut être défrayé en achetant le câble à fibre optique séparément (à un coût beaucoup plus bas, ~ 9 $ contre 218 $ - Kent Scientific- au moment de la rédaction). Pour compléter la source lumineuse à fibre optique, un couvercle conique de 50 ml avec un trou d’épingle et du ruban adhésif peut être utilisé pour recueillir la lumière d’une lampe de poche de téléphone portable (voir la figure S3 et le tableau des matériaux). Das et. al décrire un dispositif similaire¹¹. Pour certains laboratoires, le coût réduit de cette solution peut rendre notre méthode beaucoup plus accessible. Au-delà des coûts, la difficulté de confirmer le placement de la sonde endotrachéale a rendu l’intubation des souris intimidante.

Dans le passé, pour confirmer que la sonde endotrachéale est correctement positionnée, les chercheurs se sont appuyés sur la buée miroir en tenant un miroir dentaire au-dessus de la sonde endotrachéale¹⁸. Cependant, le faible volume courant et les variations de température ambiante empêchent souvent la formation de buée dans les miroirs et entraînent des erreurs de jugement. Dans le cas de l’intubation murine, cela présente un risque sérieux de blessure. D’autres ont eu recours à l’induction d’une détresse respiratoire en obstruant le tube endotrachéal¹⁰. Cela cause un stress important à l’animal et fournit moins d’informations que la « méthode des bulles ». De plus, l’introduction de traitements pulmonaires et d’air dans l’estomac en raison d’une confirmation inadéquate de la mise en place de la sonde endotrachéale peut causer de la détresse en plus d’entraver l’efficacité de l’agent administré. L’utilisation de la « méthode des bulles » fournit une confirmation visuelle plus rapide et plus fiable de la mise en place de la sonde endotrachéale et constitue une légère amélioration par rapport à une méthode similaire décrite précédemment²⁸. La « méthode des bulles » permet également à un chercheur d’estimer approximativement la fréquence respiratoire et le volume courant de l’animal.

Le positionnement des animaux et la visualisation des cordes vocales sont essentiels à cette technique. Nous avons constaté que les spéculums nasaux pédiatriques étaient trop grands et encombrants pour maintenir la bouche ouverte et les joues à l’écart pendant l’intubation, mais ils étaient très utiles pendant la formation car ils permettaient à un chercheur de démontrer le placement de l’otoscope. Il est difficile de guider un stagiaire pour qu’il reconnaisse l’anatomie pertinente, et une meilleure visibilité dans la bouche de la souris était essentielle, ce qui a été considérablement facilité par l’utilisation de l’otoscope commercial. La mise en scène à l’aide d’une loupe éclairée et d’un coup de main font partie intégrante de l’aide aux opérateurs inexpérimentés lors de l’intubation, bien qu’elles ne soient peut-être pas aussi critiques pour les opérateurs expérimentés.

Bien qu’une formation à cette méthode puisse être nécessaire, un dépannage peut être nécessaire. Si le tube endotrachéal pénètre dans l’œsophage à plusieurs reprises, la glotte peut avoir eu des spasmes, le palais mou peut être enflammé et le placement correct peut être plus difficile. Dans ce cas, laissez l’animal récupérer pendant plusieurs minutes avant de tenter à nouveau l’intubation. Le nombre de nouvelles tentatives doit être spécifié dans le protocole IACUC et toujours respecté. Si vous avez du mal à voir les cordes vocales, la fréquence respiratoire peut être supprimée en raison d’une anesthésie trop importante, ou le positionnement de la souris peut être inapproprié (le plus souvent, la tête trop inclinée vers l’arrière). Dans ce cas, repositionnez l’animal et laissez-le se remettre de l’anesthésie avant de réessayer. Le tube à bulles doit clairement montrer le volume courant de l’animal. Si la bulle ne bouge que légèrement, des halètements dus à la pression exercée sur la trachée par une sonde endotrachéale mal placée peuvent être à l’origine de ce mouvement. Dans ce cas, reportez-vous à l’horodatage : 8:25 et à la figure S3 pour voir à quel point le volume courant est facilement apparent lorsque l’on utilise le « tube à bulles » sur un tube endotrachéal correctement placé. Si votre sonde endotrachéale est mal placée, retirez-la immédiatement et laissez l’animal se rétablir avant de retenter la procédure.

Bien que l’intubation et l’instillation intratrachéale soient de loin supérieures aux autres méthodes, elles ont été trop difficiles sur le plan technique pour être largement adoptées. Les méthodes décrites ici rendent l’instillation intratrachéale et l’intubation murine accessibles et pratiques. Bien que les applications futures de cette technique dépendent fortement de ce qui est délivré aux poumons et du contexte dans lequel ils sont administrés, une méthode simple et fiable ouvre la voie à de nombreuses avancées en biologie pulmonaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibre optique LightiKit d’éclairage à fibre optique, souris	Kent Scientific  ;	ETI-12ETI-MSE-02	Un composant de l’ensemble de fibre optique, compatible avec d’autres lumières et le câble de fibre optique de remplacement ci-dessous
Ensemble de fibre optique alternatif	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	une alternative, non discutée (mais nous ne voyons aucune raison pour laquelle cela ne fonctionnerait pas)
Ensemble de fibre optique alternatif	Appareil Harvard	72-9075	une alternative, non discutée (mais nous ne voyons aucune raison pour laquelle cela ne fonctionnerait pas)
Assemblage alternatif de fibre optique	Fabriqué à la main par le laboratoire	N/A	Instructions trouvées ici à l’aide d’un bouchon en caoutchouc : DOI 10.3791/50318
Assemblage alternatif de la fibre optique	Fabriqué à la main par le laboratoire	N/A (matériaux énumérés ci-dessous)	Fabriqué à partir d’un couvercle conique de 50 ml, de ruban adhésif et d’un support d’intubation de fibre optique de 0,75 mm
, souris	Kent Scientific  ;	ETI-MSE-01	Support réglable pour l’intubation, de nombreuses versions faites maison disponibles, des supports d’embouts et des plates-formes en bois utilisés, certaines alternatives énumérées de nombreuses alternatives appropriées disponibles.
Supports d’intubation alternatifs	Braintree Scientifuc	RIS 100	une alternative, non discutée (mais nous ne voyons aucune raison pour laquelle cela ne fonctionnerait pas)
Supports d’intubation alternatifs	Natsume Seisakusho	KN-1014	une alternative, non discutée (mais nous ne voyons aucune raison pour laquelle cela ne fonctionnerait pas)
Supports d’intubation alternatifs	Vetland	000A3467	une alternative, non discutée (mais nous ne voyons aucune raison pour laquelle cela ne fonctionnerait pas)
Supports d’intubation alternatifs	Fabriqués à la main par le laboratoire	N/A	Fabriqué à partir d’un relieur à 3 anneaux ici : DOI 10.3791/60844 (plusieurs méthodes alternatives publiées)
Suture en soie tressée non résorbable, taille 0	Outils de science fine  ;	18020-00	toute longueur supérieure à 1 pouce endommagera la carène
Cathéter Safelet IV 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Ou similaire
RS-5358 Micro Pince à dissection	Fisher	RS-5358	Ou similaire, comprend des mains d’aide  ;
Loupe avec lumière et support, main d’aide magnétique flexible EOOKU, 5X& 10X 12V 108pcs LED perles lampe loupe, 3 modes réglables pivotants col de cygne bras & Plaque de base robuste	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Col-de-cygne-flexible-ajustable /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5 ?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQ fygaSMgW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& mots-clés=loupe+verre+avec +lumière+EOOKU+3+in+1& qid=1709661 709& sprefix=loupe+verre+avec+ lumière+eooku+3+in+1%2Caps %2C98& sr=8-5	Ou similaire, toute pince finement dentelée pliée fera l’affaire  ;
Élimination du cérumen - Outil de dissolvant de cérumen avec 8 Pcs Ensemble d’oreilles - Nettoyeur d’oreilles avec caméra - Kit d’élimination du cérumen avec lumière - Caméra d’oreille avec 6 cuillères d’oreille - Nettoyeur d’oreilles pour iOS & Android (noir)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Suppresseur-Éliminateur-Android %EF % BC %88Black %EF %BC %89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304 ?_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& _rd_wg=ja4H2& _rd_r=52D9 372C-B34B-4F6A-93F6-974754D96 3D9& _rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1	ou similaire, plusieurs marques disponibles  ;
AZIMOM PMMA Plastic End Glow Câble à Fibre Optique 0.75mm (0.02in) 100m (328ft)/Roll pour Star Sky Ceiling All Kind Led Light Engine Driver Source	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Cuttable-Ceiling-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9 ?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPU F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& keywords=fibre %2Boptic %2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th=1	Ou similaire, la fibre est utilisée pour construire un dispositif dans la ligne 7
tube conique de 50 ml	Cell Treat	229421	tout couvercle conique en plastique opaque de 50 ml devrait fonctionner. N’entre pas en contact ou à proximité immédiate de l’animal, donc pas besoin de stérilité.
Isoflurane	VetOne	Consult Veternary Staff
Innoculum  ;	N/A	Spécifique à votre Expérience
Pointes de pipette (filtre)	N/A	Filtres stériles p100 et p1000 pointes utilisées	Marque/Fournisseur non pertinent  ;
Chambre d’induction	N/A	Tel que disponible dans votre établissement	Marque/Fournisseur non pertinent  ;
Isopropanol Prep Pads	N/A	Pour le nettoyage des instruments	Marque/Fournisseur non pertinent  ;
Tubes	N/A	Un tube flexible de petit diamètre fera l’affaire  ;	Pour la construction de « tube à bulles » (le nôtre a un diamètre de ~3 mm et a été prélevé sur une ligne IV)
Luer lock	N/A	pour s’adapter à votre tubulure au-dessus	Pour la construction de « tube à bulles"
3M demi-masque respiratoire	3M	17-986-9B	pour limiter l’exposition aux gaz
Twist Tie	N/A	N/A	pour maintenir la forme en U du tube à bulles