Ce protocole décrit la culture, la récolte et la concentration des protéines sécrétées par Mycobacterium tuberculosis. Les protéines de filtrat de culture (CFP) sont quantifiées, séparées en 20 fractions par focalisation isoélectrique, puis résolues en 30 fractions à l’aide d’un SDS-PAGE préparatif et d’un système d’électroélution.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Séparation et fractionnement des protéines de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les protéines sécrétées par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de la tuberculose, la modulation immunitaire et la progression de la maladie. Comprendre leur composition et leur fonction est essentiel pour identifier de nouveaux biomarqueurs qui peuvent aider au diagnostic de la tuberculose, au développement de vaccins et aux interventions thérapeutiques. Cette étude se concentre sur l’isolement, le fractionnement et la caractérisation systématiques des protéines de filtrat de culture (CFP) afin de permettre des analyses immunologiques et protéomiques complètes. Les PFC ont été obtenues à partir de cultures de M. tuberculosis H37Rv cultivées dans des conditions chimiquement définies pour assurer une expression contrôlée des protéines. Le surnageant de culture a été purifié par filtration et concentré à l’aide d’un système de fibres creuses pour retenir les protéines supérieures à 10 kDa. Le fractionnement a été réalisé par focalisation isoélectrique en phase liquide, séparant les protéines en fonction de leurs points isoélectriques en 20 fractions distinctes. Une résolution supplémentaire a été réalisée à l’aide d’une électrophorèse préparative sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE), suivie d’une électroélution, produisant 30 fractions protéiques. Les protéines fractionnées obtenues grâce à cette approche constituent une ressource précieuse pour le profilage immunologique et les analyses protéomiques basées sur la spectrométrie de masse. En isolant et en caractérisant systématiquement les protéines sécrétées, cette étude contribue à l’identification de biomarqueurs protéiques spécifiques à la tuberculose, ce qui pourrait améliorer la précision du diagnostic et faire progresser notre compréhension de la pathogenèse de M. tuberculosis .
Introduction
Des recherches approfondies ont mis en évidence le rôle significatif des protéines sécrétées dans la croissance et les interactions immunitaires de Mycobacterium tuberculosis1. Le filtrat de culture de M. tuberculosis contient un ensemble complexe de composants protéiques et non protéiques, ce qui en fait une ressource précieuse pour comprendre sa biologie et ses propriétés immunogènes. Les premières études protéomiques ont identifié près de 450 protéines dans le filtrat2 de la culture, dont beaucoup jouent un rôle essentiel dans l’induction de réponses immunitaires contre la tuberculose. L’identification de ces antigènes immunologiquement pertinents est essentielle pour mettre au point des diagnostics et des vaccins innovants contre la tuberculose. Cependant, les progrès dans ce domaine sont entravés par la complexité de la réponse immunitaire à l’infection à M. tuberculosis et les limites techniques des méthodes de purification biochimique utilisées pour isoler les protéines mycobactériennes.
Diverses techniques de séparation ont été employées pour résoudre les protéines de M. tuberculosis, facilitant la détection de protéines mineures mais fonctionnellement significatives et élargissant la portée des études protéomiques. Une méthode de séparation idéale résout efficacement les mélanges de protéines complexes en un nombre limité de fractions distinctes. Deux approches largement utilisées pour séparer les protéines mycobactériennes sont les méthodes basées sur la chromatographie et les méthodes basées sur l’électrophorèse 1,2.
Les techniques chromatographiques, y compris l’affinité, l’échange d’ions et la chromatographie en phase inverse, sont la pierre angulaire du fractionnement des protéines depuis plus d’une décennie. Ces méthodes ont été largement utilisées pour séparer les protéines de M. tuberculosis 3. Cependant, ils sont limités par des facteurs tels que de faibles rendements en protéines et l’interférence de composants non protéiques, ce qui peut compliquer les analyses immunologiques ultérieures. Ces inconvénients limitent l’utilité de la chromatographie pour identifier les antigènes immunologiquement pertinents.
Pour remédier à ces limitations, une méthode de séparation bidimensionnelle basée sur l’électrophorèse a été adoptée. Dans la première dimension, les protéines sont séparées en fonction de leur focalisation isoélectrique (IEF) à l’aide d’un système IEF préparatif, qui sépare les protéines en fonction de leurs points isoélectriques. Dans la deuxième dimension, les protéines sont résolues en fonction de la masse moléculaire à l’aide de SDS-PAGE préparative, suivie d’une élution à l’aide d’un instrument d’élution en gel entier.
Cette approche bidimensionnelle offre plusieurs avantages. Il réduit considérablement la complexité des protéines de filtrat de culture (CFP) en les fractionnant en 600 fractions distinctes. De plus, les fractions conviennent à l’analyse immunologique directe car le processus d’élution n’introduit pas de composants qui interfèrent avec les tests immunologiques cellulaires 4,5,6.
Ce protocole détaille la préparation et la séparation des protéines de filtrat de culture pour l’analyse immunologique6.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Croissance de Mycobacterium tuberculosis et préparation de protéines de filtrat de culture (CFP)
- Préparation du milieu liquide de Sauton
- Combiner les composants suivants dans 950 mL d’eau distillée : Glycérol, 30,0 mL ; Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4), 0,5 g ; Sulfate de magnésium, 0,5 g ; Acide citrique, 2,0 g ; Hydrolysat de caséine, 0,5 g ; Sulfate d’ammonium ferrique, 0,05 g ; Glutamate de sodium, 4,0 g.
- Ajustez le pH à 7,2 en utilisant de l’hydroxyde de potassium à 40 % (environ 5 ml/L).
- Augmenter le volume à 1 L et faire cuire l’autoclave à 15 psi pendant 20 min.
- Préparation de suspension mycobactérienne
- Transférer les colonies de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) cultivées sur des pentes Lowenstein-Jensen (LJ) dans 2 mL de milieu liquide de Sauton.
- Brisez les amas mycobactériens en les secouant vigoureusement avec des billes de verre dans des conditions stériles.
- Initier la croissance mycobactérienne
- Transférez la suspension bactérienne dans une bouteille McCartney contenant 10 ml de milieu liquide Sauton.
- Incuber le flacon à 37 °C pendant 2 semaines.
- Développer la culture
- Transférez la culture cultivée dans 200 ml de milieu Sauton’s dans une bouteille de 1 L.
- Incuber sur un agitateur à 37 °C pendant 4 semaines.
- Transvaser la culture en phase logarithmique dans une fiole de 4 L contenant 2 L de milieu de Sauton.
- Cultivez la culture à 37 °C dans des conditions stationnaires pendant 4 semaines supplémentaires jusqu’à ce qu’une pellicule de surface se forme.
- Récolte des protéines de filtrat de culture (CFP)
- Récoltez la culture par centrifugation à 1 000-1 500 x g pendant 30 min à température ambiante.
- Filtrer le surnageant à travers un système de filtration sous vide de 0,45 μm.
- Concentrer le filtrat contenant du CFP à l’aide d’un système de filtration à flux tangentiel avec une coupure de 10 kDa.
- Stockage de la PCP récoltée
- Estimez la teneur en protéines à l’aide de la trousse de dosage des BCA disponible dans le commerce.
- Aliquote les protéines, ajoutez de l’azoture de sodium à une concentration finale de 0,2 % et stockez-les à -80 °C.
2. Focalisation isoélectrique préparative en phase liquide (IEF)
- Préparation de l’échantillon de protéines
- Solubiliser Mycobacterium tuberculosis CFP dans 60 mL de tampon de séparation IEF contenant 8 M d’urée, 1 mM de dithiothréitol (DTT), 5 % de glycérol, 2 % de digitonine et 2 % d’ampholytes (pH 3,0-10,0 et pH 4,0-6,0 dans un rapport de 1:4).
- Mise en place du système IEF
- Remplissez la chambre d’anode avec de l’acide phosphorique 0,1 M et la chambre cathodique avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M.
- Assemblez la cellule IEF préparative selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Réalisation de l’IEF
- Chargez jusqu’à 350 mg de protéines dans le système IEF.
- Focaliser les protéines à 4 °C avec un système d’eau circulatoire de refroidissement.
- Appliquez une puissance constante de 12 W jusqu’à ce que la tension se stabilise à environ 1400 V, puis continuez pendant 30 minutes supplémentaires.
- Collecte et analyse des fractions
- Récoltez les fractions de l’IEF et déterminez leur pH.
- Analysez chaque aliquote par SDS-PAGE et visualisez les protéines à l’aide de la coloration à l’argent.
3. SDS-PAGE préparative et élution sur gel entier
- Préparation d’échantillons pour SDS-PAGE
- Mélangez les fractions IEF avec le tampon d’échantillon 6x SDS-PAGE disponible dans le commerce.
- Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min.
- Exécution d’un SDS-PAGE préparatoire
- Chargez jusqu’à 10 mg de protéines dans un gel de polyacrylamide de 16 cm × 20 cm avec un gel empilable à 4 % et un gel résolutif à 12,5 %.
- Faites fonctionner l’électrophorèse à un courant constant de 50 mA jusqu’à ce que la face du colorant soit à 2 cm du bas.
- Élution des protéines du gel
- Équilibrer le gel dans le tampon d’élution (60 mM de Tris, 40 mM de CAPS, pH 9,4) pendant 10 min.
- Transférez le gel dans l’instrument d’élutation de gel entier.
- Eluter les protéines en appliquant un courant constant de 250 mA pendant 1 h.
- Collecte et analyse des fractions
- Éluer les protéines séparées en 30 fractions individuelles, chacune d’un volume de 2,5 ml.
- Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode d’estimation des protéines BCA en suivant les instructions du fabricant.
- Analysez 10 μg de protéines de chaque fraction par SDS-PAGE et visualisez à l’aide de la coloration à l’argent.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 1 illustre la complexité des protéines de filtrat de culture (CFP) préparées. Initialement, 100 μg de CFP ont été soumis à une analyse 2D-SDS PAGE pour évaluer sa complexité. Cette analyse a révélé la présence de près de 100 taches protéiques distinctes dans la CFP (Figure 1).
Les 20 fractions collectées lors de chaque passage ont été analysées par SDS-PAGE. Parmi celles-ci, trois fractions représentatives de trois séries di...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les protéines de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis représentent un mélange complexe de divers composants protéiques présents à des concentrations variables. Des études protéomiques ont identifié jusqu’à 1 314 protéines dans le CFP 4,5. De nombreuses recherches ont mis en évidence le rôle crucial des CFP dans la modulation des réponses immunitaires. Plus précisément, les CFP jouent un rôle indispensab...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ä ; Système de filtration à flux tangentiel KTA ; | CYTIVA | 29038437 | |
| Ampholytes (pH 3,0 à 10,0 ) | BIO-RAD | 1632094 | |
| Ampholytes (pH 4,0 à 6,0 ) | BIO-RAD | 1631143 | |
| Dosage des protéines BCA ; | MERCK | 71285-M | |
| CASQUETTES | MERCK | Réf. C2632 | |
| Hydrolysat de caséine | MERCK | 65072-00-6 | |
| Acide citrique | MERCK | C0759 | |
| Digitonine | MERCK | 300410 | |
| La TNT | MERCK | D9779 | |
| Sulfate d’ammonium ferrique | HIMEDIA | GRM10944 | |
| Glycérol | MERCK | Référence G5516 | |
| Glycérol ; | MERCK | 252859 | |
| Lowenstein-Jensen slants ; | HIMEDIA | Réf. SL001 | |
| Sulfate de magnésium | MERCK | Référence M7506 | |
| Système de filtration sous vide à dégagement rapide Millipore Stericup | MERCK | S2HVU11RE | |
| Acide phosphorique ; | MERCK | 695017 | |
| Dihydrogénophosphate de potassium | MERCK | Réf. P0662 | |
| Hydroxyde de potassium | MERCK | 484016 | |
| Cellule préparative IEF (Rotofor) ; | BIO-RAD | 170-2986 ; | |
| Azoture de sodium ; | MERCK | S2002 | |
| Glutamate de sodium | MERCK | 49621 | |
| Hydroxyde de sodium | HIMEDIA | Référence MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| Urée | MERCK | Référence U5128 | |
| Appareil à éluter en gel entier ; | BIO-RAD | 1651250 |
Références
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
- Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
- Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
- Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
- Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
- Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
- Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
- Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
