Séparation et fractionnement de protéines de paroi cellulaire et de membrane cellulaire de Mycobacterium tuberculosis pour l’analyse des protéines en aval

Résumé

Ce protocole sépare les protéines insolubles de la paroi cellulaire et de la membrane en fractions simples (1 à 5 protéines) à l’aide d’une focalisation isoélectrique préparative (IEF) basée sur un point isoélectrique, suivie d’une séparation en fonction de la masse moléculaire. Les fractions résultantes peuvent être utilisées directement pour l’analyse immunologique et protéomique sans purification supplémentaire.

Résumé

Les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane des mycobactéries, qui jouent un rôle central dans la pathogenèse de la tuberculose, ont été séparées avec succès à l’aide de la focalisation isoélectrique préparative (IEF) et de l’électrophorèse préparative sur gel de dodécylsulfate de sodium et polyacrylamide (SDS-PAGE). Suivi de l’élution sur gel, surmontant les limites des méthodes conventionnelles de séparation des protéines hydrophobes. Au cours de cette procédure, des colonies de M. tuberculosis ont été transférées à partir d’obliques de Lowenstein-Jensen dans 2 mL de bouillon 7H9, dispersées avec des billes de verre, puis incubées à 37 °C pendant 2 semaines. Ensuite, la culture a été mise à l’échelle jusqu’à 200 mL et cultivée dans un agitateur pendant 4 semaines. Il a été porté à 1 L avec 500 ml de bouillon 7H9 et cultivé pendant 4 semaines supplémentaires. Les mycobactéries cultivées ont été granulées par centrifugation à 1741 × g pendant 30 min. Pour chaque pastille de 2 g, 1 mL de tampon de rupture a été ajouté et l’échantillon a été soniqué. Le lysat a été centrifugé à 3436 × g pendant 15 minutes pour éliminer les cellules non brisées, et le surnageant a été concentré. Ce surnageant (lysat de cellules entières) a été centrifugé à 13751 × g pendant 30 minutes pour granuler les protéines de la paroi cellulaire. Le surnageant restant a été ultra-centrifugé à 100 000 × g pendant 4 h pour séparer la membrane cellulaire et le cytosol. Les protéines isolées de la paroi cellulaire et de la membrane ont été chargées sur un système IEF préparatif liquide à 4 °C et séparées à 12 W jusqu’à ce que la tension se stabilise à 1400 V, ce qui sépare 20 fractions. Ces fractions IEF ont été séparées par SDS-PAGE préparatif, et les protéines ont été éluées à l’aide d’un éluter de gel entier à 250 mA, ce qui a donné 30 fractions. Grâce à ce protocole, nous avons pu identifier de nouvelles parois cellulaires de M. tuberculosis et des biomarqueurs spécifiques de la membrane, et il montre également un potentiel pour caractériser des protéines similaires chez d’autres agents pathogènes.

Introduction

Des études immunologiques ont démontré qu’en plus des protéines solubles, qui sont faciles à purifier, la réponse immunitaire humaine aux agents pathogènes tels que M. tuberculosis est également dirigée contre les protéines hydrophobes présentes dans la paroi cellulaire¹ et les protéines membranaires^{cellulaires 2} de Mycobacterium tuberculosis. Ces protéines de la paroi cellulaire et de la membrane jouent un rôle crucial dans le contrôle immunologique contre de nombreux agents pathogènes, y compris la tuberculose. Certaines de ces protéines sont signalées comme des antigènes immunodominants qui montent la réponse des lymphocytes T et B. En revanche, d’autres protéines sont identifiées comme des signatures moléculaires d’agents pathogènes qui sont reconnus pour initier une réponse immunitaire innée, tels que les motifs moléculaires associés à l’agent pathogène (PAMP) par les cellules immunitaires, initiant ainsi une réponse immunitaire. Par exemple, les lipoprotéines mycobactériennes telles que LprG, LpqH, LprA et PhoS1 sont reconnues par le récepteur de type Toll 2³.

La nature hydrophobe des protéines de la paroi cellulaire et de la membrane présente des défis techniques importants en termes de solubilisation et de séparation. Des études ont montré que les protéines membranaires constituent environ 20 à 30 % des régions codantes de tous les organismes, y compris les mycobactéries ^4,5. En raison de leur nature intrinsèque et des défis techniques, les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane sont plus difficiles à solubiliser et à isoler que les protéines solubles. En conséquence, seulement 2 % des structures protéiques membranaires ont été signalées⁶. Plusieurs facteurs contribuent à la difficulté d’isoler ces protéines. Le principal défi est leur faible abondance dans la cellule, ce qui complique l’isolement des protéines individuelles pour une caractérisation plus poussée⁷. De plus, ces protéines ont tendance à s’agréger, ce qui complique davantage leur solubilité. Ce problème peut être résolu en ajoutant des détergents pour faciliter la solubilisation. Cependant, certaines protéines peuvent encore former des agrégats même en présence de détergents, auquel cas des agents chaotropiques et des agents réducteurs peuvent être utilisés pour améliorer la solubilité.

L’utilisation de détergents pour la solubilisation peut interférer avec les méthodes de séparation ultérieures. Par exemple, les détergents chargés ne peuvent pas être utilisés avec la chromatographie échangeuse d’ions, et tous les détergents peuvent perturber la chromatographie d’interaction hydrophobe⁸. Par conséquent, le choix d’un détergent compatible avec la méthode de séparation choisie est essentiel. Une autre étape importante dans l’isolement des protéines de la paroi cellulaire et de la membrane est l’élimination des détergents utilisés pour la solubilisation, car ceux-ci peuvent interférer avec les analyses fonctionnelles ultérieures des protéines.

Nous avons développé une méthodologie robuste qui permet de surmonter de nombreux défis associés à l’analyse des protéines membranaires, en particulier les protéines hydrophobes de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire. L’un des principaux défis de l’étude de ces protéines est leur solubilisation, car leur nature hydrophobe les rend difficiles à extraire et à analyser. La méthodologie décrite ici utilise un tampon de focalisation isoélectrique (IEF) spécialement formulé, qui solubilise efficacement les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire. Cette étape de solubilisation est critique car elle permet l’analyse ultérieure de ces protéines hydrophobes.

Un avantage supplémentaire de cette méthode est sa capacité à réduire la complexité du mélange de protéines. En utilisant deux techniques de séparation complémentaires, basées sur le point isoélectrique (pI) et le poids moléculaire des protéines, cette méthodologie sépare efficacement les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire en fractions simplifiées. Chaque fraction ne contient généralement qu’une à trois protéines, ce qui améliore considérablement la résolution et facilite la caractérisation en aval.

Cette méthodologie, développée à l’aide de la paroi cellulaire de Mycobacterium tuberculosis et des protéines membranaires cellulaires comme système modèle, relève efficacement les défis associés à l’isolement et à l’analyse des protéines hydrophobes. Il fournit une approche fiable pour l’isolement, la séparation et la caractérisation de ces fractions protéiques complexes, améliorant ainsi la capacité de les étudier en détail.

Protocole

Cette étude a été conforme aux directives gouvernementales en vigueur et a été approuvée par le Comité consultatif scientifique institutionnel et le Comité d’éthique. Le consentement éclairé a été obtenu de la population étudiée avant le prélèvement des échantillons.

1. Élevage de M. tuberculosis

1. Transvaser environ 10 colonies de M. tuberculosis à partir d’obliques de Lowenstein-Jensen dans 2 mL de milieu de bouillon 7H9 (suspendre 2,35 g de base de bouillon Middlebrook 7H9 dans 400 mL d’eau distillée, 50 mL de supplément d’albumine oléique dextrose catalase [OADC], 0,5 g de Tween 80 et prélever jusqu’à 500 mL)
   REMARQUE : M. tuberculosis est un agent pathogène du groupe de risque 3 ; il doit être manipulé dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) dans l’installation de niveau 3. Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être utilisé.
2. Dispersez les cellules à l’aide de billes de verre dans des conditions stériles dans un agitateur de bouteille à 15 tr/min pendant 1 min.
3. Transférez la suspension bactérienne dans 10 mL de milieu de bouillon 7H9 dans une bouteille McCartney et incubez à 37 °C pendant 2 semaines dans un incubateur à 30 tr/min.
4. Augmentez la culture en phase logarithmique à 200 ml de milieu de bouillon 7H9 et cultivez dans un shaker pendant 4 semaines à 30 tr/min.
5. De plus, intensifier la culture dans une fiole de 1 L contenant 500 mL de milieu de bouillon 7H9 et la faire pousser en tant qu’agitateur à 30 tr/min pendant 4 semaines à 37 °C.
6. Récoltez les mycobactéries par centrifugation à 1741 g pendant 30 min.

2. Préparation des protéines de lysat de cellules entières

1. Soumettre la pastille bactérienne isolée à la sonication selon un protocole standard.
2. Préparez le tampon de rupture avec la composition suivante : 20 mM de Tris avec 8,5 % (8,5 g pour 100 mL) de NaCl.
3. Ajustez le pH final à 7,4 avec du HCl concentré.
4. Ajouter des inhibiteurs de protéase fraîchement préparés au tampon de rupture aux concentrations suivantes (les détails des inhibiteurs de protéase à ajouter sont énumérés dans le tableau supplémentaire 1)
5. Traiter les bacilles de M. tuberculosis (volume de 100 mL emballés et pesés) pour chaque 2 g de pastille de cellules bactériennes, ajouter 1 mL de tampon de rupture avec du lysozyme (1 mg/5 mL de suspension cellulaire) et incuber pendant 15 min à 37 °C en agitant doucement.
6. Suspendez les bacilles dans le double de son volume de tampon de rupture.
7. Ajouter 0,04 % (poids/vol) d’azoture de sodium et 0,05 % de Tween 80 au tampon.
8. Perturber les cellules bactériennes dans le tampon de rupture à l’aide d’un sonicateur avec un cycle de 9 s allumé et 9 s éteint pendant 30 min à 40 % d’amplitude, en maintenant la suspension sur de la glace pour éviter la dénaturation des protéines.
9. Centrifuger le lysat préparé à 3438 g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer les cellules intactes.
10. Concentrer le surnageant à l’aide de concentrateurs centrifuges (coupure de 3 kDa - 5 mL).
11. Déterminer la concentration protéique dans le surnageant à l’aide du test de quantification de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA) en utilisant la protéine BSA comme norme.
    REMARQUE : Dans l’analyse SDS-PAGE, chargez 50 μg de protéines pour l’analyse.

3. Isolement des protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire par ultracentrifugation

1. Isolez la paroi cellulaire, la membrane cellulaire et les protéines cytosoliques de l’ensemble du lysat cellulaire en suivant le protocole de Raja et ^al.9. comme décrit ci-dessous.
2. Centrifuger le lysat cellulaire entier à 13751 × g à 4 °C pendant 30 min, en séparant les protéines de la paroi cellulaire sous forme de pastille.
3. Soumettre le surnageant à une ultracentrifugation à 100 000 × g à 4 °C pendant 4 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse, en séparant les protéines de la membrane cellulaire sous forme de pastille et en laissant les protéines cytosoliques dans le surnageant.
4. Estimer les concentrations de protéines dans la paroi cellulaire et les fractions membranaires cellulaires à l’aide du dosage des protéines BCA.
   REMARQUE : Dans l’analyse SDS-PAGE, chargez 50 μg de protéines pour l’analyse. La paroi cellulaire et la membrane cellulaire séparées sont stockées dans un congélateur à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

4. Focalisation isoélectrique préparative en phase liquide (Rotofor [appareil IEF])

1. Solubiliser les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire isolées par ultracentrifugation dans un tampon IEF contenant 8 M d’urée, 1 mM de DTT, 5 % de glycérol, 2 % de digitonine.
2. Ajouter 2 % d’ampholytes (pH 3,0 à 10,0 et pH 4,0 à 6,0 dans un rapport de 1:4)
3. Fractionner les protéines solubilisées à l’aide d’un système IEF liquide maintenu à 4 °C avec un bain d’eau de refroidissement.
4. Effectuez la séparation IEF conformément aux instructions du fabricant, en appliquant une puissance constante de 12 W jusqu’à ce que la tension se stabilise (entre 1300 V et 1600 V).
5. Continuez le fonctionnement IEF pendant 30 minutes supplémentaires après la stabilisation de la tension, avec une durée totale d’environ 5 à 6 h.
6. Collectez les différentes fractions IEF à l’aide d’une pompe à vide et déterminez leurs valeurs de pH.
7. Soumettez les fractions séparées (50 μg) à SDS-PAGE et visualisez les protéines à l’aide du bleu brillant de Coomassie (CBB) ou de la coloration à l’argent. Conservez les fractions IEF séparées dans un congélateur à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

5. SDS-PAGE préparative et élution de gel entier

1. Mélangez les fractions de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire séparées par l’IEF avec 6 tampons d’échantillon SDS-PAGE et chauffez à 95 °C pendant 5 minutes avant l’analyse SDS-PAGE.
2. Séparez les fractions protéiques dans la deuxième dimension à l’aide de gels de polyacrylamide de 16 cm et de 20 cm composés d’un gel de résolution à 12,5 % et d’un gel d’empilement à 4 %.
3. Utilisez un seul puits d’échantillon de 13 cm de long pour charger l’échantillon.
4. Effectuez l’électrophorèse à un courant constant de 50 mA/gel jusqu’à ce que la face du colorant atteigne le bas du gel.
5. Équilibrer le gel dans le tampon d’élution (60 mM Tris, pH 9,4 ; 40 mM d’acide 3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic [CAPS]) pendant 10 min après l’électrophorèse.
6. Transférez le gel dans un appareil d’élution de gel entier tel que décrit par le fabricant de l’instrument.
7. Éluer les protéines du gel en faisant fonctionner l’éluteur à un courant constant de 250 mA pendant 1 h.
8. Prélever environ 30 fractions de protéines, chacune d’un volume de 3 ml, de chaque gel à l’aide d’une pompe à vide.
9. Quantifier la concentration en protéines dans les fractions éluées à l’aide du dosage des protéines BCA.
10. Soumettre 10 μg des fractions éluées à l’analyse SDS-PAGE et visualiser par coloration au bleu brillant (CBB) de Coomassie.
    REMARQUE : Les fractions entières éluées de gel séparées ont été stockées dans le congélateur à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

Résultats

Isolement des protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire par ultracentrifugation à grande vitesse
Les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane ont été isolées à partir de lysats de cellules entières par ultracentrifugation, comme indiqué dans le protocole. L’analyse SDS-PAGE des profils protéiques séparés des fractions subcellulaires, de la paroi cellulaire, de la membrane cellulaire et du cytosol de M. tuberculosis est illustrée à la figure 1...

Discussion

La nature hydrophobe des protéines de la paroi cellulaire et de la membrane présente d’importants défis expérimentaux dans leur solubilisation et leur séparation. Dans le protocole mentionné ci-dessus, nous avons décrit une nouvelle méthode de séparation bidimensionnelle basée sur l’électrophorèse pour isoler efficacement ces protéines hydrophobes. Dans ce protocole, nous avons d’abord séparé les protéines de la membrane et de la paroi cellulaire en fonction de leurs points isoélectrique...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
7H9 bouillon  ;	Himedia  ;	M198
40 % Bio-Lyte 3/10 Ampholyte  ;	BIO-RAD	1631113
Dosage des protéines BCA  ;	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 Ampholyte  ;	BIO-RAD	1631152
concentrateurs centrifuges 3 kDa	MERCK	Z629456
Digitonine.	MERCK	D141
Dnase	MERCK	11284932001
La TNT	MERCK	D9779
EDTA	MERCK	E9884
EGTA	MERCK	E3889
Glycérol	MERCK	Référence G5516
Leupeptine	MERCK	E18
Pepstatine A	MERCK	P5318
PMSF	MERCK	78830
Rnase	MERCK	10109134001
Rotofor  ;	BIO-RAD	170-2986	; appareil de focalisation isoélectrique (IEF)
Sonicateur	Vibra-cell, Soniques	VC 750
TLCK	MERCK	Réf. T7254
TPCK	MERCK	4376
urée	MERCK	Référence U5378
Appareil à éluter en gel entier  ;	BIO-RAD	1651250