Article de méthode

In situ Isolement et culture de bactéries récalcitrantes du sol à l’aide d’une puce d’isolement (iChip)

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DOI :

10.3791/67692

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6 août 2025

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la conception et l’utilisation d’une puce d’isolement (iChip) pour la culture in situ de microbes récalcitrants du sol dans leur milieu naturel. Il décrit également la culture in situ de bactéries du sol productrices d’antimicrobiens. Le protocole peut être adapté pour récupérer des bactéries de diverses niches avec d’autres propriétés souhaitables.

Résumé

Les écosystèmes abritent des millions de microbes environnementaux, dont certains sont capables de produire des produits biotechnologiques pertinents tels que des enzymes, des vitamines, des acides aminés, des acides organiques, des agents antiparasitaires et des agents antimicrobiens. La plupart de ces bactéries environnementales sont jugées « inculturables » car les méthodes de culture en laboratoire ne répondent pas à leurs exigences nutritionnelles et environnementales. De plus, comme ils coexistent dans la nature, ils peuvent également dépendre d’un nutriment ou d’un métabolite produit par un autre membre de la communauté microbienne. L’intégration de la diversité microbienne « non cultivée » dans la culture sera l’occasion d’explorer la vaste gamme de produits bioactifs qu’ils peuvent coder. Cet article décrit la mise en œuvre de la technologie iChip, une chambre de diffusion multicanaux développée pour une culture in situ à haut débit des bactéries « non cultivables ». Compte tenu de la menace mondiale de la résistance aux antimicrobiens, l’article fournit un protocole détaillé pour la culture in situ et la récupération d’isolats de la « matière noire » microbienne capable de produire des agents antimicrobiens, à titre d’exemple. Ce protocole décrit les étapes impliquées, depuis l’étape du prélèvement des échantillons de sol jusqu’à la récupération des isolats, et met en évidence les facteurs plausibles qui peuvent influencer le succès de l’isolement. L’utilisation de cette technologie facilite non seulement l’isolement de bactéries autrement « incultivables » pour la découverte d’antibiotiques, mais permet également aux chercheurs de se plonger dans l’écologie complexe du sol, qui peut ensuite être exploitée pour une myriade d’autres applications.

Introduction

De riches dépôts de microbes jusqu’alors inexplorés existent dans des environnements naturels tels que le sol, les plans d’eau et les environnements extrêmes. Cependant, il est difficile d’exploiter cette énorme biodiversité de microbes, car la plupart d’entre eux ne peuvent pas être facilement cultivés à l’aide de milieux et de méthodes de laboratoire traditionnels. La grande anomalie de la numération sur plaque décrit ce phénomène, mettant en évidence les nombres discordants de micro-organismes qui peuvent être observés visuellement par rapport à ceux qui se développent dans les milieux de culture1. En contournant cette barrière et en permettant l’accès à la diversité inculturable des microbes et de leurs produits, on pourrait répondre à divers besoins biotechnologiques.

Par exemple, le développement de la résistance aux antimicrobiens est devenu une menace pour la santé publique mondiale. Les grandes sociétés pharmaceutiques ont été réticentes à poursuivre la découverte de nouveaux antimicrobiens, ce qui a entraîné une diminution du taux de découverte par rapport au taux d’émergence de la résistance aux antibiotiques existants 2,3. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux antimicrobiens4. Étant donné que les communautés microbiennes ont évolué ensemble de manière concomitante ou en compétition5, elles ont développé le potentiel de produire de nouveaux composés chimiques qui augmentent leurs chances de survie. L’énorme diversité des microbes environnementaux et de leurs produits n’a pas été pleinement explorée, car les méthodes traditionnelles basées sur la culture en laboratoire conduisent souvent à l’isolement de microbes similaires et connus. En effet, les milieux et les méthodes de culture conventionnels sont biaisés en faveur de la culture de microbes pertinents pour l’homme et ne parviennent pas à imiter les environnements naturels. La conception de milieux de culture pour cultiver les microbes environnementaux est un défi, car la croissance de certaines espèces peut nécessiter divers nutriments, souvent produits par d’autres microbes à proximité, et des conditions environnementales spécifiques.

Pour répondre à ce problème et cultiver les microbes environnementaux in situ, des chambres de diffusion ont d’abord été développées6. La chambre de diffusion est un joint torique en acier inoxydable. L’espace à l’intérieur du cycle est rempli de gélose ensemencée avec une dilution d’échantillon appropriée. Le haut et le bas de l’anneau sont ensuite scellés par des membranes en polycarbonate, qui permettent la diffusion des nutriments et des métabolites dérivés du sol tout en empêchant l’infiltration d’autres microbes dans la chambre6. Après l’ensemencement, la plaque est placée dans l’environnement dans lequel l’échantillon est prélevé pour permettre la culture in situ. La chambre de diffusion était très efficace et a permis de cultiver de nombreux microbes auparavant inculturables. Cependant, la conception du joint torique avec gélose est devenue laborieuse et à faible débit, laissant ouvert un espace de problème pour d’autres innovations6. Peu de temps après, une puce d’isolement (iChip), capable de réaliser la culture in situ et la récupération simultanée à haut débit de cultures pures, a été conçue7. Cette conception est conceptuellement identique à celle d’une chambre de diffusion, mais se compose de plusieurs canaux où chaque canal agit comme une chambre de diffusion indépendante, permettant la récupération potentielle d’une seule microcolonie de chaque chambre8. La réinvention de la conception de la chambre de diffusion a considérablement amélioré le débit de la technologie et a permis d’isoler et de cultiver une plus grande biodiversité de taxons à partir du sol, de l’eau de mer9, des sources chaudes10, etc. La teixobactine, un antibiotique récemment décrit, a été découverte à la suite de la technologie décrite ci-dessus11. Il a présenté un nouveau mécanisme d’action antimicrobienne et s’est avéré mortel contre les agents pathogènes provoquant des infections invasives, démontrant que l’isolement à haut débit des microbes à partir de la « matière noire » microbienne peut être efficacement rationalisé pour la découverte de produits naturels pertinents sur le plan biotechnologique à l’aide de cette technologie12.

Cet article sert de guide procédural pour la mise en œuvre efficace de cette technologie à haut débit pour la culture in situ et la récupération de bactéries récalcitrantes productrices d’antimicrobiens à partir de la « matière noire » microbienne du sol. Le protocole décrit la conception d’une puce d’isolement, la collecte des échantillons, la préparation des échantillons, l’ensemencement, l’incubation et la récupération. Bien que le protocole présenté démontre la culture in situ de microbes à partir du sol, il peut être facilement adapté à la culture in situ de microbes à partir de n’importe quel environnement. Les capacités à haut débit de cette technologie pourraient augmenter la probabilité de découvrir de nouveaux microbes et d’utiliser leur potentiel de biosynthèse pour diverses applications biotechnologiques.

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Protocole

1. Conception et impression 3D

  1. Choisissez la conception et la taille en fonction du type d’échantillon, du volume par chambre de diffusion, des dimensions de la membrane à utiliser et du débit requis (nombre de chambres de diffusion).
    REMARQUE : L’épaisseur de la plaque centrale et le diamètre de chaque canal déterminent le volume de chaque chambre de diffusion cylindrique. La taille dépend du nombre de chambres de diffusion individuelles à loger, et les dimensions de la membrane dépendent directement du nombre de chambres de diffusion couvertes (Figure 1).
  2. Utilisez l’option d’insertion de formes dans n’importe quel logiciel de présentation pour insérer des cercles des dimensions nécessaires pour servir d’iChip. Insérez des cercles plus petits à l’intérieur pour représenter les canaux. Disposez les petits cercles dans le motif souhaité pour préparer un dessin préliminaire pour la plaque supérieure/inférieure et la plaque centrale. Sélectionnez le design et utilisez le menu contextuel pour enregistrer le design préliminaire sous forme d’image.
  3. À l’aide de la conception préliminaire comme modèle, commencez à créer une conception bidimensionnelle (2D) à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
    1. Dans le menu d’esquisse, insérez des formes prédéfinies, principalement des cercles, pour créer le design de base des plaques et de la gamme de canaux.
    2. Utilisez l’option de cote pour définir les dimensions réelles des plaques et des canaux. Cliquez sur OK pour finaliser le design, puis utilisez la fonction d’extrusion pour convertir le design 2D en un modèle 3D de l’épaisseur souhaitée.
    3. Enfin, utilisez le menu Fichier Enregistrer pour enregistrer une copie du modèle 3D au format de fichier stéréolithographie (STL), compatible avec l’impression 3D.
  4. Choisissez le matériau d’impression en fonction de l’application souhaitée, en tenant compte de facteurs tels que la méthode de stérilisation préférée et le site de plantation. Par exemple, choisissez un matériau résistant à la température si l’autoclave sera utilisé pour la stérilisation ou s’ils seront plantés dans un site où la température est élevée.
    REMARQUE : L’impression 3D pour cette expérience a été réalisée à l’aide d’un matériau semblable à la céramique qui peut résister à des températures élevées allant jusqu’à 268 °C et était donc autoclavable.
  5. Choisissez une méthode d’impression 3D adaptée, en fonction des dimensions (détail et résolution) et du matériau utilisé.
    REMARQUE : L’impression 3D utilisant la stéréolithographie, une méthode de fabrication additive, peut créer des structures complexes en durcissant une résine thermodurcissable avec un laser ultraviolet (UV). La stéréolithographie peut être utilisée avec plusieurs matériaux et permet d’excellents états de surface et une résolution de détail élevée.

2. Prélèvement d’échantillons de sol

  1. Téléchargez et installez une application mobile de géocodage qui permet d’identifier des sites de 3 m x 3 m dans le monde entier en fournissant une adresse unique de 3 mots pour le site à partir de n’importe quel magasin d’applications mobiles. Identifier un site pour le prélèvement d’échantillons de sol. Ensuite, ouvrez l’application mobile de géocodage pour identifier le site d’intérêt et son adresse unique en trois mots.
  2. Notez l’adresse unique en trois mots, la date, l’heure, la profondeur à laquelle l’échantillon doit être prélevé, les conditions météorologiques, la faune et la flore à proximité, l’exposition du site et la température du site (surface et sous-surface à la profondeur souhaitée).
    REMARQUE : Le sol peut contenir des bactéries pathogènes. Par conséquent, utilisez un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouses de laboratoire, etc.) et suivez les protocoles appropriés au niveau de biosécurité 2. Minimisez les contacts pour éviter la contamination et l’exposition de l’échantillon. Désinfectez la surface de travail avant et après la manipulation d’échantillons de sol.
  3. Décontaminez la pelle en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 % et en l’essuyant. Décontaminez la boîte en polystyrène, dans laquelle la terre doit être recueillie, en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 % et en l’essuyant. Laissez l’éthanol résiduel sécher complètement avant de continuer.
    REMARQUE : Bien que ce protocole utilise une boîte en polystyrène pour recueillir l’échantillon et effectuer l’incubation, des solutions de rechange telles que des contenants en verre et en métal peuvent également être utilisées si vous le souhaitez.
  4. Retirez toute matière végétale, litière de feuilles et/ou pierres de la surface pour exposer la couche arable. Décontaminez à nouveau la pelle comme avant, nettoyez la terre végétale et évaluez le sol à une profondeur de 3 à 6 pouces sous la surface. Utilisez une règle pour mesurer la profondeur à partir de la surface. À l’aide de la pelle stérilisée en surface, prélevez 4 à 5 kg de terre à la profondeur souhaitée dans la boîte en polystyrène.
  5. Fermez la boîte avec un couvercle. S’il y a plus d’un échantillon à prélever, décontaminer la pelle entre deux sites d’échantillonnage pour éviter la contamination croisée. Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, transportez-les immédiatement au laboratoire.

3. Préparation de l’échantillon pour l’ensemencement

  1. À partir de l’échantillon de sol prélevé, peser 1 g de sol exempt de débris, de roches et de litière de feuilles dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL contenant 10 mL de solution saline stérile.
    REMARQUE : Conservez une partie de l’échantillon de sol car le glycérol stocke13,14 à -80 °C pour conserver la population microbienne indigène pour les besoins futurs.
  2. Mélangez le sol avec la solution saline en tourbillonnant pendant environ 10 s pour créer une boue de sol. Laissez le tube de centrifugation intact pendant 5 minutes pour permettre aux grosses particules de saleté dans le tube de se déposer. Ensuite, transférez soigneusement la suspension de sol surnageant dans un tube à essai frais étiqueté « S ».
  3. En utilisant la suspension de sol comme échantillon non dilué, effectuer une dilution en série en transférant 1 mL de l’échantillon dans 9 mL de solution saline stérile dans un tube frais. Préparez des dilutions de 10-1 à 10-5.
    REMARQUE : La numération sur plaque des suspensions de sol dilué sur des milieux non sélectifs peut fournir des renseignements sur la densité des bactéries dans l’échantillon, qui peuvent être utilisés pour choisir la dilution appropriée pour l’ensemencement. Cependant, notez qu’il ne s’agit que d’une estimation des bactéries cultivables présentes dans l’échantillon.

4. Ensemencement et assemblage

  1. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, décontaminez la plaque supérieure, la plaque inférieure et la plaque centrale en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes. Rincez l’excès d’éthanol en lavant les plaques avec de l’eau déminéralisée stérile et laissez-les sécher à l’air libre dans une boîte de Pétri stérile.
  2. Placez la plaque du milieu dans une boîte de Pétri stérile, prête pour l’ensemencement. Ensuite, faites fondre le milieu de gélose SMS dans un micro-ondes, laissez-le refroidir et transférez 22,5 ml de gélose SMS à 45 °C dans un tube à centrifuger de 50 ml.
  3. À cela, ajoutez 2,5 mL d’une dilution appropriée de l’échantillon de sol et mélangez bien par inversion douce, tout en évitant l’introduction de bulles d’air.
    REMARQUE : Choisissez une dilution appropriée pour l’ensemencement. Pour obtenir une densité de semis finale comme dans la dilution 10-4 , choisissez la suspension 10-3 car l’échantillon sera dilué 10 fois dans le milieu utilisé pour le semis.
    1. Choisissez la dilution d’ensemencement pour immobiliser 1 cellule par chambre, qui peut ensuite se développer en une colonie in situ.
      REMARQUE : L’eau distillée peut également être utilisée à la place du milieu SMS pour imiter l’environnement du sol et permettre la croissance de micro-organismes qui ne se développent que dans de telles conditions. En option, des agents antifongiques comme le cycloheximide peuvent également être ajoutés au substrat de semis pour éviter la croissance fongique.
  4. Verser lentement 3 à 4 ml de gélose SMS épépinée sur la plaque centrale, en couvrant toute la surface. Laissez ensuite le milieu gélosé SMS prendre pendant environ 5 à 10 minutes. Vérifiez si le milieu gélosé SMS est réglé. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir stérile, grattez l’excès de gélose SMS de la surface de la plaque, en laissant derrière vous les bouchons de gélose dans les chambres de diffusion individuelles.
  5. Après avoir retiré la feuille de protection de l’un des filtres à membrane en polycarbonate de 0,03 μm, placez-la soigneusement à l’intérieur de la plaque supérieure à l’aide d’une pince stérile. Ensuite, placez un autre filtre à membrane en polycarbonate de 0,03 μm sur le côté exposé de la plaque centrale ensemencée à l’aide d’une pince stérile.
  6. Placez les plaques supérieure et inférieure, en prenant en sandwich la plaque centrale et les membranes en polycarbonate, en prenant soin d’aligner les trous de vis dans toutes les plaques, pour terminer l’assemblage (Figure 1B). Serrez les écrous et les boulons pour fixer l’ensemble.
    REMARQUE : Il est recommandé d’assembler en parallèle une iChip de contrôle avec uniquement une gélose SMS stérile, sans semis, et de la planter dans le sol avec celle ensemencée pour vérifier l’étanchéité. Cela exclurait l’entrée possible de microbes de l’environnement et agirait comme un contrôle négatif.

5. Culture in situ et récupération

  1. Créez une dépression plus grande que la taille de l’iChip dans le sol recueilli dans la boîte en polystyrène à l’aide d’une pelle stérile. Plantez l’ensemble verticalement dans la dépression et tassez fermement avec de la terre, en vous assurant que toutes les surfaces sont complètement couvertes. Prévoyez ensuite une culture in situ pour la durée souhaitée de 2 à 4 semaines. Pendant l’incubation, utilisez de l’eau distillée stérile pour humidifier le sol périodiquement afin d’éviter que les bouchons de gélose SMS ensemencés dans les chambres de diffusion ne se dessèchent.
    REMARQUE : Placer l’ensemble en position verticale empêche les infiltrations continues d’eau à travers les chambres de diffusion lors de l’humidification régulière du sol, comme cela peut se produire s’il est planté horizontalement.
  2. Après l’incubation souhaitée, délogez doucement le sol autour de l’iChip planté pour le récupérer. Ensuite, lavez-le avec une solution saline stérile pour éliminer les particules de sol adhérentes et transférez-le dans une enceinte de biosécurité pour un traitement ultérieur.
  3. Détachez les écrous et les boulons de l’assemblage. Ensuite, démontez-le soigneusement. À l’aide d’une pince stérile, retirez les membranes en polycarbonate et transférez la plaque centrale dans la boîte de Pétri préparée.
  4. À l’aide d’applicateurs en bois stériles, récupérez les bouchons de gélose individuels dans chaque chambre de diffusion. Inoculez la gélose dans un milieu approprié comme la gélose SMS ou la gélose au bouillon de soja tryptique 0,1x pour tenter la culture en laboratoire.
    REMARQUE : Les isolats cultivés peuvent ensuite être soumis à un dépistage pour la production d’antimicrobiens par des méthodes courantes telles que la gélose15.
  5. Alternativement, colorer et imager les bouchons de gélose récupérés contenant des bactéries de sol récalcitrantes cultivées in situ pour confirmer la croissance des microcolonies dans des conditions in situ .
    REMARQUE : Pour améliorer la sensibilité de la détection, la gélose broyée peut également être colorée à l’aide de colorants fluorescents qui peuvent colorer les bactéries, suivie d’une microscopie à fluorescence.

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Résultats

L’iChip utilisée dans ce protocole a été conçue, imprimée en 3D et assemblée comme le montre la figure 1. La figure 2 présente une vue d’ensemble du protocole décrit. L’échantillon de sol utilisé pour l’expérience a été prélevé sur le campus de l’IIT Jodhpur au Rajasthan, en Inde. L’adresse unique en trois mots de l’emplacement était « communiquer.superviser.récurrence ». L’emplacement choisi était une zone semi-aride avec une température de 40 °C le jour de l’é...

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Discussion

Les nombreux habitats uniques sur Terre abritent des communautés microbiennes distinctes qui représentent une énorme diversité. Cela reste inexploré en raison des limites dans la fourniture de conditions de croissance appropriées requises pour leur culture. Certaines bactéries dépendent des métabolites libérés par d’autres pour leur survie et sont donc incapables de survivre indépendamment dans des conditions de laboratoire. De plus, les bactéries jouent également un rôle crucial dans l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

A.V. a été soutenu par le programme de bourses de recherche du Premier ministre (PMRF) du gouvernement de l’Inde. V.V. a été soutenu par le programme INSPIRE (Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship) du ministère des Sciences et de la Technologie du gouvernement indien. La visite d’I.B. a été partiellement financée par une bourse Fulbright APE de l’USIEF. Les auteurs remercient le Département de biosciences et de bio-ingénierie et l’Institut indien de technologie de Jodhpur pour le soutien logistique et la fourniture d’infrastructures pour ce travail. Nous remercions vivement le Dr Sudarshna Negi, Mme Aastha Kapoor, M. Tamal Dey, M. Bharat Pareek, M. Ajeet Singh et d’autres membres du Laboratoire de physiologie microbienne de l’IIT Jodhpur.

Cohorte de participants à l’ADSB-2024

La cohorte de participants au cours de courte durée sur la découverte d’antibiotiques dans les bactéries du sol (ADSB) 2024, organisé au Département de biosciences et de bio-ingénierie de l’Institut indien de technologie de Jodhpur (Noms classés par ordre alphabétique) :

Abinash Kumar Jena, Banishree Jali, Bharat Gurnani, Bharat Pareek, Dipro Mukherjee, Garima Kanwar Shekhawat, GT Vishnu, Jayita Sarkar, Krishna Saharan, Kriti Singhal, Lekh Raj, Mitta Bindusree, Phulen Sarma, Priyanka Kumari, Rachana Dinesh, Satyendra Singh et Swathi Sujith

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Imprimante 3DProtolabs, États-Unis1631-833 Fournisseur deservices d’impression 3D
Agarose  ;Himedia, IndeMB002Composant multimédia
Casamino AcidsSisco, Inde68806Composant multimédia
Caséine Digest  ;ASES, IndeC5890Composant multimédia
Membrane polycarbonateSterlitech, États-UnisPCT00347100Consommable
Fécule de pomme de terreHimedia, IndeGM403Composant multimédia
PowerPointMicrosoft, États-Unis n/aUtilisé pour la création des composants iChip conception préliminaire
PTC CreoPTC, USAN/AUtilisé pour la 3D assistée par ordinateur modélisation des composants de l’iChip Bouillon de
soja tryptiqueHimedia, IndeM011Support de laboratoire
What3WordsWhat3Words, Royaume-Unin/aUtilisé pour l’enregistrement des coordonnées du lieu d’échantillonnage

Références

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Mots-clés

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