Cette méthode décrit l’exploitation du signal endogène dans un modèle murin transgénique ARL13B-CENTRIN-2 pour imager des cils primaires in situ, en trois dimensions sur de grandes surfaces de tissu minéralisé, de la collecte de tissus à l’analyse de l’organisation des cils. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres types de tissus.
Article de méthode
Imagerie volumétrique et analyse des cils primaires dans le tissu musculo-squelettique à l’aide du modèle murin ARL13B-CENTRIN-2
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cil primaire est un organite solitaire non mobile assemblé par la plupart des types de cellules. Il est essentiel au développement et à l’homéostasie du squelette et à la coordination des réponses cellulaires aux signaux biochimiques et mécaniques de leur environnement. En raison de sa taille à l’échelle du micromètre, le cil primaire est difficile à imager in situ pour être caractérisé dans les tissus, à haut débit et sans biais optiques. Une compréhension de son organisation dans son environnement 3D in vivo sera essentielle pour comprendre les rôles ciliaires dans la physiologie et la maladie. La lignée de souris ARL13B-CENTRIN-2 présente un marqueur mCherry sur la protéine de l’axonème ciliaire ARL13B et un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP) sur la protéine du centriole CENTRIN-2, localisé à la base du cil. Cette ligne de souris permet d’imager le cil primaire sans avoir besoin de coloration, ce qui réduit le nombre d’étapes de la collecte d’images et contourne les problèmes de rapport signal/bruit. Cette publication décrit un protocole étape par étape pour imager les cils primaires dans les tissus musculo-squelettiques tout en préservant le signal fluorescent. Il décrit également un pipeline d’analyse d’images universellement applicable, permettant une quantification non biaisée des caractéristiques des cils, telles que la longueur et l’orientation 3D.
Introduction
Le cil primaire est un organite essentiel dans le développement et l’homéostasie de nombreux tissus et organes, y compris le squelette. Au cours de la croissance postnatale, elle régule la minéralisation du cartilage lors de l’ossification endochondrale1. Chez l’homme, les mutations génétiques qui affectent les protéines liées aux cils provoquent une gamme de maladies et de troubles du développement, connus sous le nom de ciliopathies. Une compréhension de l’organisation des cils primaires à l’intérieur des tissus est importante pour comprendre comment ils régulent le comportement cellulaire au niveau des organes. Il a été démontré que l’incidence, la longueur et l’orientation des cils primaires varient à l’intérieur et entre les tissus, ce qui suggère un rôle de l’organisation tissulaire dans leur fonction 2,3,4. La plaque de croissance, la couche de cartilage à l’extrémité des os longs où la majeure partie de la croissance osseuse postnatale se produit dès le début de la vie et jusqu’à l’adolescence, est un tissu très organisé avec des cellules chondrocytaires disposées en colonnes. Dans la plaque de croissance, les chondrocytes passent par des étapes de différenciation, du repos à la prolifération en passant par l’hypertrophie.
Cette organisation cellulaire est perdue dans certaines ciliopathies, ce qui suggère que les cils primaires peuvent jouer un rôle dans la coordination de cette organisation cellulaire et/ou, à tout le moins, être associés à la polarisation cellulaire. De plus, l’orientation primaire des cils semble jouer un rôle dans leur fonction mécanosensorielle, avec des différences observées entre les régions porteuses et non porteuses dans le cartilage articulaire4. Nos propres études récentes ont impliqué des rôles différentiels dans différentes régions du cartilage articulaire et de la plaque de croissance 5,6. Des études antérieures qui ont imagé des cils primaires dans la plaque de croissance ont été limitées à la 2D, ce qui perd des informations liées à l’organisation des cils dans les tissus ou sont limitées à un petit nombre de cellules en 3D, ce qui réduit l’échelle et la puissance de l’analyse 7,8.
Parmi les défis de l’imagerie du cil primaire, citons sa taille à l’échelle du micromètre et la non-spécificité des anticorps d’immunohistochimie. L’utilisation d’un signal fluorescent natif garantit une localisation et une spécificité fortes. Les signaux fluorescents natifs peuvent toutefois être difficiles à imager dans les tissus minéralisés, car le long processus de décalcification pour intégrer les tissus dans la paraffine peut entraîner une perte de signal. La cryosection des échantillons congelés à l’état natif permet d’éviter cette perte en accélérant le processus d’enrobage et de sectionnement.
Pour imager les cils primaires in situ, une double lignée de souris transgénique a été générée par Bangs et al., qui exprime la protéine de type facteur de ribosylation ADP-ribosylation (ARL13B) fusionnée à mCherry et CENTRIN-2 fusionnée à GFP9. ARL13B est une petite GTPase localisée à la membrane du cil primaire, et CENTRIN-2 est une protéine centriolaire localisée aux deux centrosomes à la base du cil10,11. Cette lignée de souris permet donc d’imager des cils primaires marqués par fluorescence sans avoir besoin d’immunohistochimie.
Le protocole décrit ici utilise cette lignée transgénique pour imager des cils primaires en 3D dans des plaques de croissance postnatale murines avec microscopie confocale, ne nécessitant qu’une coloration supplémentaire au 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Des centaines de cils primaires dans des centaines de cellules peuvent être imagés et analysés collectivement dans un contexte tissulaire. Un pipeline d’analyse d’images mesure ensuite l’incidence, la longueur et l’orientation des cils primaires dans les différentes régions de la plaque de croissance. Le pipeline est également capable de quantifier ces caractéristiques pour les centrioles. Un aperçu des étapes du protocole est présenté à la figure 1.
Protocole
L’élevage et les expériences ont été menés conformément aux cadres éthiques de l’Université d’Oxford et dans le cadre d’une licence de projet accordée par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Ce protocole a été réalisé sur des souris âgées de 2 à 10 semaines, mais fonctionnerait dans le cartilage des souris au-delà de cet âge.
1. Prélèvement de tissus
- Euthanasiez les souris en remplissant une boîte contenant les souris avec du dioxyde de carbone jusqu’à 80 % en volume et en maintenant sa concentration pendant 5 min. Effectuer une luxation cervicale.
- Disséquez le tissu d’intérêt.
REMARQUE : Vous trouverez ci-dessous un protocole pour disséquer les genoux de la patte arrière, y compris les plaques de croissance tibiale et fémorale et le cartilage articulaire.- Inciser la peau au niveau du pied et couper jusqu’en haut de la cuisse. Retirez la peau de la ligne d’incision à l’aide d’une pince.
- Coupez les tissus musculaires et adipeux des jambes.
- Pour détacher la jambe du corps, coupez proprement le fémur en haut de la hanche. Coupez le pied au bas du tibia.
- Retirez tout excès de muscle et de tissu adipeux restant sur la jambe.
2. Fixation et enrobage tissulaires
REMARQUE : Tout au long du protocole, veillez à garder le tissu dans l’obscurité pour éviter la perte de signal fluorescent.
- Fixez le mouchoir dans du formol à 10 % à température ambiante pendant 4 h.
- Transférez les mouchoirs dans du formol à 2,5 % à 4 °C pendant la nuit.
- Transférez les tissus à 30 % de saccharose dans de l’eau distillée (dH2O) et tournez doucement à température ambiante pendant la nuit ou pendant 3 jours à 4 °C. Remplissez les tubes jusqu’en haut pour assurer une immersion complète du tissu pendant la rotation. Suite à cette incubation, le tissu va couler au fond du tube.
- Placez une petite quantité de glace carbonique dans une boîte séparée et placez le cryomoule sur le dessus. Tracez une ligne de milieu de super cryoenrobage (SCEM) et placez le membre le long de celle-ci, avec la rotule vers le bas et en écartant le tibia et le fémur pour que la jambe soit aussi plate que possible. Maintenez en place avec une pince jusqu’à ce que le SCEM commence à se solidifier et que le membre ne bouge plus lorsqu’il n’est pas maintenu vers le bas.
- Couvrir complètement de SCEM en remplissant le moule jusqu’en haut. Placez l’échantillon dans la boîte de glace sèche, en gardant l’échantillon à plat pour éviter tout mouvement du tissu, jusqu’à ce que le SCEM se solidifie complètement.
- Transférer à -20 °C.
3. Sectionnement
- Retirez le bloc du moule et coupez-le à une taille qui s’adapte au mandrin d’un cryostat. Fixez le bloc au mandrin en appliquant SCEM sur le mandrin et en plaçant le bloc sur le dessus.
- Laisser solidifier pendant au moins 5 min à -20 °C dans le cryostat.
- Fixez le mandrin au porte-échantillon et une lame au porte-lame.
- Coupez le bloc jusqu’à ce que la plaque de croissance tibiale soit atteinte. Idéalement, sectionnez avec le tibia pointant vers le haut.
- Coupez le ruban de cryofilm à une taille qui s’adapte à l’échantillon avec suffisamment d’espace autour de lui. Montez le cryofilm sur la surface coupée, en assurant une adhérence étanche du cryofilm à l’aide d’un outil adapté. Coupez des sections de 40 à 60 μm d’épaisseur pour obtenir des sections épaisses à deux cellules. Prélevez le ruban à l’aide d’une pince et placez-le sur une lame, côté échantillon vers le haut, et la plaque de croissance tibiale dans l’alignement de la lame courte de la lame.
- Conservez les lames d’échantillon à -20 °C.
4. Préparation et montage des diapositives
- Décongelez la lame horizontalement à température ambiante.
- Lavez la lame avec une goutte de PBS pendant 3 x 5 min pour retirer le SCEM.
- Colorer avec du DAPI 10 μM pendant 1 min.
- Lavez la diapositive avec une goutte de PBS pendant 2 x 5 min.
- Monter, couvrir avec une lamelle et laisser à température ambiante pendant la nuit. Scellez les bords de la lamelle avec un scellant pour lamelle.
- Image du lendemain.
5. Imagerie par microscopie confocale
REMARQUE : La résolution de l’objectif 40x/1,4 sur le microscope confocal utilisé est de 240 nm.
- Installez le microscope.
- Allumez le microscope et ouvrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Système .
- Sous l’onglet Acquisition , cliquez sur Smart Setup pour configurer les canaux. Sélectionnez et ajoutez les canaux GFP, mCherry et DAPI. Sélectionnez l’option Airyscan et la fonction SR8Y dans le triangle Airyscan (entre la résolution et le multiplexage de vitesse 8Y). Cliquez sur Meilleur signal | OK (figure supplémentaire S1A).
- Dans l’onglet Localiser , sous Contrôle du microscope, sélectionnez l’objectif 40x/1.4 avec immersion dans l’huile.
- Localisez la région qui vous intéresse.
- Placez la glissière dans le support de diapositive et remontez l’objectif jusqu’à ce que l’huile touche la lamelle.
- Placez la plaque de croissance ou toute autre région d’intérêt sous le trajet de la lumière.
- Dans l’onglet Localiser , cliquez sur Fluorescence, sélectionnez DAPI, et à l’aide de l’oculaire, déplacez le support de diapositive avec le joystick pour positionner la plaque de croissance ou la région d’intérêt sous le champ de vision.
- Dans l’onglet Acquisition , commencez par sélectionner le canal DAPI uniquement.
- Cliquez sur Continu pour afficher l’image de ce canal à l’écran et vous assurer que la plaque de croissance est en vue.
- Ouvrez la visionneuse de tuiles en cliquant sur Afficher la visionneuse dans l’onglet Tuiles . Ajoutez le nombre de tuiles requis (généralement 1 tuile dans la direction x et 3 à 5 dans la direction y) et cliquez sur Aperçu et démarrer (figure supplémentaire S1B).
- Vérifiez que les tuiles couvrent les trois zones de la plaque de croissance : repos, prolifération et hypertrophie. Ajustez la position et le nombre de carreaux selon vos besoins.
- Configurez les paramètres d’imagerie.
- Cliquez sur Continu dans l’onglet Acquisition . Dans l’onglet Canaux , ajustez le gain (maître) et la puissance laser pour afficher clairement les noyaux à l’écran. Laissez le détecteur Airyscan s’aligner. Ouvrez la fenêtre de réglage du détecteur Airyscan en cliquant sur le symbole de la rosette en mosaïque au bas de la fenêtre ; une fois alignées, toutes les tuiles deviendront vertes (figure supplémentaire S1C).
- Sélectionnez les canaux GFP et mCherry individuellement et répétez ces étapes en réglant le gain (maître), la puissance laser et alignez le détecteur Airyscan.
- Sélectionnez les trois canaux et cliquez sur Continu. Laissez le détecteur Airyscan s’aligner.
- Dans l’onglet Mode d’acquisition, définissez les valeurs Taille de l’image, Pixel, Taille, Taille d’image, Vitesse et Moyenne. Voir la figure supplémentaire S1D,E pour les valeurs des paramètres du mode d’acquisition, du gain (maître) et de la puissance laser pour les voies utilisées.
- Acquérir des images.
- Dans l’onglet Acquisition , cliquez sur la case à cocher Z-Stack .
- Avec uniquement le canal DAPI sélectionné, cliquez sur Continu pour afficher l’image à l’écran. Déplacez l’objectif vers le bas jusqu’au plan le plus proche à imager. Dans l’onglet Z-Stack , cliquez sur Définir le premier plan, concentrez-vous sur le dernier plan à afficher, puis cliquez sur Définir le dernier plan. Image 30-40 μm z-stacks.
- Réglez l’intervalle sur 0,15 μm.
- Déplacez-vous vers le centre de la pile z. Dans l’onglet Tuiles , sous Régions de tuiles, cliquez sur Vérifier , puis sur Définir Z et passer au suivant.
- Sous l’onglet Stratégie de mise au point , vérifiez que la stratégie de mise au point est définie sur Utiliser les valeurs Z/Surface de mise au point définies dans la configuration des tuiles.
- Cliquez sur Démarrer l’expérience pour lancer l’acquisition de l’image.
- Traitement d'images
- Dans l’onglet Traitement, sélectionnez Mode unique ou Batch . Sélectionnez Traitement Airyscan. Cochez Traitement 3D et sélectionnez Filtre automatique standard. Sélectionnez l’image brute acquise et lancez le traitement (Figure supplémentaire S2A).
- Une fois le traitement Airyscan terminé, sélectionnez Assemblage dans les méthodes de traitement. Sélectionnez Nouvelle sortie, Fusionner les tuiles, Corriger l’ombrage et Tout par référence, avec la référence DAPI. Sélectionnez l’image traitée par Airyscan et lancez le traitement (figure supplémentaire S2B).
- Enregistrez les images brutes et les images en double traitement. Ce dernier est enregistré automatiquement en mode Batch .
6. Analyse d’images
REMARQUE : Le pipeline d’analyse utilisé ici a été personnalisé en fonction des besoins de cette étude. Les détails de l’exploitation du pipeline sont présentés à la figure supplémentaire S3.
- Importez le fichier image czi dans le logiciel. Ouvrez le panneau d’analyse ; dans la liste déroulante , sélectionnez Nouveau pipeline...
- Pour créer un pipeline de détection de cellules, importez le segmenteur Python Cellpose dans le pipeline12. Réglez Model_Name sur cyto2, Input_channel sur 2, Second_channel sur 3, Diameter_in_μm sur 10, Flow_threshold sur 0,4 et Cellprob_threshold sur 0. Ajoutez un opérateur Importer des objets de document (renommé Importer des étiquettes manuelles) avant et un opérateur Filtre de fonctionnalité d’objet (renommé Filtre de taille) après le pipeline en cliquant sur + Ajouter une opération. Voir la figure supplémentaire S3A pour les valeurs des paramètres du pipeline.
- Déplacer l’observateur vers le premier plan d’intérêt
- Cliquez sur l’icône de l’outil Dessiner des objets
- Cliquez sur l’icône du mode Polygone
- Dessiner la zone à analyser
- Déplacer l’observateur vers le dernier plan d’intérêt
- Dessiner la zone à analyser
- Cliquez sur la coche verte Appliquer les modifications
- Cliquez sur l’icône Afficher le tableau des objets
- Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objet créé et sélectionnez Renommer l’objet pour renommer l’objet avec un nom approprié. Faites un clic droit sur l’objet créé et cliquez sur Ajouter une balise. Ajoutez une balise appelée Région d’analyse.
- Exécutez ce pipeline en cliquant sur la flèche bleue vers l’avant en haut du panneau Analyse .
- Pour créer un pipeline de détection primaire de cils et de centrioles, ouvrez le panneau d’analyse, dans la liste déroulante, sélectionnez Nouveau pipeline.... Ajoutez les opérateurs suivants au pipeline : Importer des objets de document (renommé Importer des étiquettes manuelles), deux opérateurs de segment de seuil d’intensité (renommé Seuil de cils et Seuil de centriole), Fractionnement (renommé Fractionnement de centriole), Filtre de fonction d’objet (renommé Filtre de taille de fractionnement de centriole) et Compartiment (renommé Compartiment - Cellule). Voir la figure supplémentaire S3B pour les valeurs des paramètres du pipeline.
- Exécutez ce pipeline en cliquant sur la flèche bleue vers l’avant en haut du panneau Analyse.
- Ouvrez la fenêtre Objets. Cliquez sur IM/Export..., sélectionnez Exporter Excel.... Sélectionnez les fonctionnalités suivantes à enregistrer : # Enfants, Nom, Noms des parents, Limites orientées 3D Côté court, Côté moyen, Côté long, Angle XY, Angle XZ, Angle YZ, Boîte englobante X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, SizeX, SizeY, SizeZ, Centre de la géométrie X, Y, Z, Plan Premier, Last, Count, Sphericity (maillage), Volume (mesh), Surface Area (mesh).
Résultats
La plaque de croissance d’une souris âgée de 6 semaines a été imagée à l’aide du protocole décrit et l’organisation primaire des cils a été cartographiée dans le tissu. Une image des trois régions de la plaque de croissance - au repos, proliférative et hypertrophique - a été capturée et analysée dans le pipeline d’analyse (Figure 2A). Les cellules individuelles peuvent être identifiées par la coloration DAPI, avec leur axonème ciliaire en rouge et leurs centrioles en vert. La résolution utilisée par cette méthode est suffisamment élevée pour discriminer les centrioles individuels (Figure 2B). À cette résolution, les cils peuvent être visualisés dans leur environnement 3D, pointant dans différentes directions (Vidéo 1).
Des images de résolution inférieure, avec des objectifs de grossissement plus élevé, peuvent également être capturées pour visualiser les cils primaires sur une plus grande région de tissu ; cependant, ceux-ci ne conviennent pas à l’analyse de l’orientation des cils en 3D. Par exemple, les cils primaires du cartilage articulaire ont été imagés avec l’objectif 20x, démontrant que la méthode fonctionne également sur d’autres tissus (Figure 2C). À cette résolution, les axonèmes ciliaires en rouge peuvent être identifiés, mais les centrioles sont plus difficiles à discriminer. L’os sous-chondral a tendance à présenter beaucoup de signal de fond GFP, ce qui rend difficile l’identification du centriole dans ce tissu.
Le pipeline peut détecter des cellules individuelles, des cils primaires et des centrioles, et il fonctionne pour les jeunes plaques de croissance très organisées et les plaques de croissance plus âgées où les colonnes sont moins bien définies, comme chez les souris de 10 semaines (Figure 3). Les cellules et les cils sont détectés en 3D, comme on peut les voir sur l’ensemble de la pile z.
Figure 1 : Flux de travail expérimental. Organigramme des différentes étapes du protocole, de la collecte de tissus à l’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cils primaires dans les tissus murins de la souris ARL13B-CENTRIN-2. (A) Une plaque de croissance âgée de 6 semaines, avec DAPI en blanc, CENTRIN-2 en vert et ARL13B en rouge, imagée avec l’objectif 40x. (B) Zoomez sur un cil primaire individuel et ses deux centrioles. (C) Cartilage articulaire et os sous-chondral d’une souris âgée de 4 semaines, imagés avec l’objectif 20x. (D) Rein d’une souris âgée de 6 semaines imagé à l’aide du même pipeline que pour le tissu musculo-squelettique. (E) Agrandissement de la boîte blanche en D montrant les cils primaires individuels et leurs centrioles dans le rein. Barres d’échelle = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pipeline de détection de cellules et de cils. Exemple d’application du pipeline d’analyse d’images sur une plaque de croissance âgée de 10 semaines. (A) Image ouverte dans le logiciel. (B) Résultat du pipeline de détection de cellule. (C) Résultat du pipeline de détection des cils et des centrioles. Les cils sont en rose et les centrioles en vert. La vue latérale illustre que la résolution est suffisamment élevée pour distinguer les cils orientés dans différentes directions en 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1 : Reconstruction tridimensionnelle d’une plaque de croissance de 6 semaines à partir de la souris ARL13B-CENTRIN-2. La reconstruction tridimensionnelle a été réalisée dans le logiciel Imaris et enregistrée sous forme de vidéo d’animation. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Figure supplémentaire S1 : Paramètres d’acquisition d’images sur le système de microscope. (A) Fenêtre de configuration intelligente pour ajouter les chaînes et choisir le mode Airyscan . (B) Visualiseur de tuiles pour sélectionner et prévisualiser les tuiles à imager. (C) Fenêtre de réglage du détecteur Airyscan , où l’alignement des détecteurs Airyscan est confirmé une fois que toutes les tuiles deviennent vertes. (D) Réglages laser pour les trois canaux. (E) Paramètres du mode d’acquisition et de la pile Z. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Paramètres de traitement d’image sur le système de microscope. (A) Paramètres de traitement Airyscan. (B) Paramètres de couture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Pipelines d’analyse d’images personnalisés. (A) Pipeline de détection de cellules à l’aide des canaux GFP et DAPI. (B) Pipeline de détection des cils primaires et des centrioles à l’aide des canaux mCherry et GFP, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Dans ce protocole, il est essentiel de procéder aux étapes de traitement et d’intégration des tissus immédiatement après le prélèvement. Les blocs et lames de tissus, cependant, peuvent être conservés pendant au moins 3 mois à -20 °C. Plusieurs étapes de ce protocole peuvent être modifiées pour s’adapter à différentes applications, en particulier l’épaisseur de la section, le grossissement et les paramètres d’empilement z. Cela aura un impact sur la profondeur de l’imagerie et la résolution obtenue. Les changements d’ouverture numérique et de mode de résolution ont pu être utilisés pour obtenir une résolution encore plus élevée et la taille de l’intervalle des piles z a diminué. Cependant, cela augmenterait le temps d’imagerie ou réduirait la taille du champ de vision qui peut être imagé. Les paramètres d’imagerie décrits sont les exigences minimales identifiées pour l’analyse 3D de l’orientation des cils primaires.
Le choix du support de montage est important pour obtenir une haute résolution. L’indice de réfraction du support de montage doit être similaire à celui du support d’immersion pour minimiser la dégradation de l’image dans la pile z. L’indice de réfraction du monteur et de l’huile d’immersion utilisés ici ont des indices de réfraction de 1,52 et 1,518, respectivement. La fonction Airyscan du microscope confocal utilisé ici offre des images à super-résolution. D’autres microscopes à super-résolution pourraient être utilisés ; Cependant, nous avons constaté que le mode confocal seul n’était pas suffisant pour obtenir la résolution requise pour la taille des zones imagées. La résolution maximale du mode Airyscan du Multiplex SR-8Y est de 120/160 nm en x/y et de 450 nm en z, et le nombre maximal d’images/s est de 47,5. Nous avons trouvé que le mode Multiplex SR-4Y Airyscan, qui présente une résolution maximale de 140 nm en x/y et 450 nm en z mais des images à la moitié de la vitesse avec un nombre maximum d’images/s de 25, ne présente pas de différence significative pour l’imagerie des cils primaires en 3D. De même, le mode super-résolution (SR) d’Airyscan, qui offre la résolution la plus élevée sur ce microscope - 120 nm en x/y et 350 nm en z - prendrait plus de temps à imager, car son nombre maximum d’images/s est de 4,713.
Le signal GFP de fond peut être observé dans d’autres tissus tels que le muscle. Pour minimiser cela, la portée des lasers peut être réduite pour réduire le chevauchement avec d’autres longueurs d’onde. Cette ligne a déjà été utilisée pour imager les cils primaires de l’embryon, les cultures de cellules primaires, les fibres musculaires et l’épithélium pigmentaire rétinien 9,14,15. Nous avons réussi à imager des cils primaires dans les reins, le cartilage et les tissus osseux. Une certaine optimisation des paramètres d’imagerie sera probablement nécessaire pour différents tissus ; Cependant, ce protocole de cryosection doit assurer la préservation du signal.
Des sections épaisses à deux cellules (40-60 μm) sont suffisantes pour obtenir des informations d’orientation 3D dans la plaque de croissance, car cela permet d’imager des cellules entières et leurs cils primaires. Pour d’autres tissus où les cellules sont plus grandes que les chondrocytes, comme les adipocytes, des sections plus épaisses peuvent être nécessaires pour collecter des données sur la population cellulaire. Selon la résolution en profondeur du microscope utilisé, il peut être impossible d’imager en profondeur dans des sections plus épaisses. Les techniques de nettoyage des tissus entraîneraient probablement une perte du signal endogène mCherry et GFP en raison du temps que cela nécessite. Cela a été exploré, car des méthodes de clarification ont été utilisées pour d’autres images dans le membre, mais cela n’a pas été jugé nécessaire dans ce contexte. Notre expérience avec le CD31-RFP endogène suggérait que les techniques de nettoyage devraient être optimisées avec soin et sur mesure.
Cette lignée ARL13B-CENTRIN-2 peut être croisée avec d’autres lignées de souris pour étudier plus en détail l’organisation des cils primaires dans les tissus. Par exemple, nous l’avons croisé avec un aggrecan-Cre IFT88fl/fl pour éliminer conditionnellement IFT88, une protéine primaire des cils dont la délétion empêche la ciliation, dans les cellules exprimant des agrégats (chondrocytes postnatals)5,6. Ces signaux fluorescents ARL13B et CENTRIN-2 peuvent ensuite être utilisés pour mesurer l’efficacité des perturbations génétiques au niveau de la structure ciliaire dans les tissus et toute modification associée de l’organisation ciliaire. C’est exactement ce que font actuellement les travaux en cours. Notre premier objectif sera de quantifier, avec cette méthodologie plus robuste, l’effet de la délétion d’IFT88 sur la prévalence des cils. Auparavant, nous l’avons évalué en utilisant l’immunofluorescence et avons estimé qu’il s’agissait d’une réduction de 20 %6. Cette méthode peut également être combinée à l’immunohistochimie pour imager des cils primaires en combinaison avec d’autres protéines, par exemple, une protéine de membrane cellulaire.
Le transgène sur ARL13B peut avoir un effet sur l’expression d’ARL13B et la longueur des cils primaires. Des études antérieures ont mesuré différentes longueurs de cils primaires avec la lignée ARL13B-CENTRIN-2 par rapport à ARL13B non transgène dans certaines régions du cerveau de la souris, sans différence dans d’autres16. Une autre étude a observé des différences dans la longueur des cils primaires dans une lignée de souris ARL13B marquée à la GFP par rapport à ARL13B non marquée dans des fibroblastes embryonnairesde souris 10. Les travaux en cours visent à vérifier tout changement dans la longueur des cils primaires dans la plaque de croissance et d’autres tissus en comparant les résultats obtenus à l’aide de la lignée de souris ARL13B-CENTRIN-2 avec une coloration d’anticorps contre ARL13B non transgénique.
Le pipeline d’analyse d’images de ce protocole a été conçu pour mesurer ultérieurement le pourcentage de ciliation, la longueur et l’orientation 3D des cils primaires, ainsi que le nombre de centrioles et la position dans la plaque de croissance. Le logiciel d’analyse d’images permet de créer des pipelines personnalisés en modifiant les étapes impliquées. Le résultat de ce pipeline est une feuille de calcul avec les mesures des caractéristiques choisies pour les cellules, les cils et les centrioles détectés. La post-analyse peut ensuite être effectuée dans R ou un autre logiciel en fonction des objectifs de l’étude. Comme pour les paramètres d’imagerie, les étapes du pipeline et les paramètres spécifiques peuvent être modifiés pour travailler sur différentes images et en fonction des objectifs de l’étude. Dans l’ensemble, cette méthode permet une analyse à haut débit des cils primaires par rapport à celle publiée précédemment dans la plaque de croissance. Le nombre de cellules et de cils associés qui peuvent être étudiés permet des mesures plus importantes et plus fiables.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions tous les membres du personnel de la BSU à l’Institut Kennedy de rhumatologie, en particulier Albertino Bonifacio, pour l’élevage. Nous remercions le Centre d’excellence d’imagerie biomédicale Oxford-ZEISS pour son aide dans l’utilisation du microscope, en particulier le Dr Jacky (Ka Long) Ko pour son aide dans le développement du pipeline d’analyse d’images. Ce travail a été soutenu par le Kennedy Trust of Rheumatology Research (Johnson) et le Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC, BB/X007049/1).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 22 x 50 mm Couvercles | FisherScientific ; | ||
| logiciel arivis Vision4D | Zeiss | N/A | Logiciel d’analyse d’images ; |
| Microscope confocal à balayage laser ; | Zeiss | Zeiss 980 Airyscan 2 | |
| CoverGrip CoverGrip Scellant pour lamelles ; | Biotium ; | 23005 | |
| Cryofilm type 3C(16UF) (type feuille) 2,0 cm de largeur | Section-lab | C-FUF303 | À acheter directement chez Section-lab |
| Cryostat | Leica | CM1900 UV | |
| DAPI | invitrogen | D1306 | |
| Moules à base jetables ; | epredia | 58952 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | gibco | 14190 | |
| Formalin | Sigma | 20260630 | |
| Imaris software ; | Oxford Instruments ; | N/A | Logiciel d’analyse d’images pour la reconstruction 3D ; |
| Huile d’immersion 518F | Zeiss | ISO 8036 ; | |
| Lames Microtome | Feather | 02.075.00.006 | |
| SlowFade Glass Antifade Mountant ; | invitrogen | S36917 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Super Cryoembedding Medium (SCEM) | Section-lab | C-EM001 | À acheter directement chez Section-lab Superfrost |
| Plus Lames de microscope | avantor | 631-0108 | |
| Zen software | Zeiss | N/A | Freeware pour la microscopie confocale à balayage laser |
Références
- Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. Expression of primary cilia in mammalian cells. Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).
- Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon. J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).
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