Article de méthode

Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

DOI :

10.3791/67699

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28 février 2025

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1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous démontrons la méthode de caractérisation des vésicules extracellulaires (VE) collectées à partir de fluides biologiques, tels que les larmes et la salive, de sujets humains. Le scanner utilisé dans cette méthode est capable de détecter le phénotype, la taille et le nombre total de particules des VE à partir de 1 μL de l’échantillon.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures produites à partir de cellules et participent à la communication intercellulaire en transportant des biomolécules d’une cellule à une autre. Il a été démontré que les VE parcourent de courtes et de longues distances dans le corps et sont spécifiques aux tissus. Les VE ne se trouvent pas seulement dans les tissus, mais ils peuvent également être trouvés dans pratiquement tous les fluides corporels, tels que les larmes, la salive, le liquide céphalo-rachidien, le sang, etc. Même si les VE peuvent être collectés de manière non invasive à partir des larmes et de la salive, seuls de petits volumes peuvent être collectés à la fois, ce qui peut causer des problèmes pour obtenir suffisamment de VE pour analyser les protéines. Le scanner dont il est question dans cet article est un analyseur de nanoparticules qui apporte une solution à ce problème, en nous permettant de caractériser et d’étudier le phénotype, la taille et le nombre total de particules des VE à partir d’aussi peu que 1 μL de fluide biologique. Ce protocole permettra d’élargir la connaissance des VE à partir de petits volumes d’échantillons difficiles à extraire des patients. Cela pourrait améliorer le confort des patients et potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une gamme de maladies et de troubles.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules communiquent avec les cellules voisines par le biais de divers mécanismes de signalisation, notamment la libération de vésicules extracellulaires (VE), qui jouent un rôle clé dans la communication intercellulaire. Les VE participent à la communication intercellulaire en transmettant des cargaisons génétiques, telles que l’ADN, l’ARN et les protéines, d’une cellule à une autre 1,2,3,4,5. Actuellement, il existe trois catégories de VE : les exosomes, les microvésicules et les corps apoptotiques, qui se caractérisent par leur taille. Les exosomes sont les plus petits, avec un diamètre de 30 à 150 nm 6,7,8, et sont formés à partir du système de membrane endosomale 9,10,11 (Figure 1). Les microvésicules sont plus grandes que les exosomes en ce sens qu’elles varient de 100 à 1000 nm12, 13, 14 et bourgeonnent de la membrane plasmique11, 12, 13 (Figure 1). Les corps apoptotiques sont les plus grands des EV et varient de 1000 à 5000 nm 12,14,15, et ils bourgeonnent également de la membrane plasmique 12,16,17 (Figure 1). Outre la taille, les VE peuvent être classés en fonction d’autres caractéristiques biophysiques, notamment la densité, les marqueurs moléculaires tels que CD63, CD81, CD9 et le mécanisme de biogenèse18. Les VE peuvent parcourir de courtes distances entre des cellules adjacentes et de longues distances dans tout le corps 19,20,21,22,23. Les VE peuvent être trouvées dans les fluides biologiques tels que le sang24, 25, 26, le liquide céphalo-rachidien27, 28, 29, les larmes30, 31, 32 et la salive33, 34, 35, pour n’en nommer que quelques-uns.

À ce jour, l’ultracentrifugation est l’une des méthodes les plus connues pour isoler les VE à partir des échantillons36, 37 et 38. Cette méthode nécessite plusieurs cycles de centrifugation et d’ultracentrifugation qui peuvent être effectués en augmentant la vitesse pour isoler les VE des cellules et des débris cellulaires. Cette méthode peut être démarrée à basse vitesse avec des cellules à granulés qui seront suivies d’une vitesse moyenne pour éliminer les vésicules plus grandes et, enfin, d’une étape d’ultracentrifugation pour les granulés EV18. Bien que l’ultracentrifugation soit considérée comme la meilleure méthode d’isolation, certaines limites existent encore en ce sens qu’elle modifie la morphologie des VE 39,40,41. Une autre technique utilisée pour isoler les VE est la cytométrie en flux, qui met en évidence les avantages de l’évaluation de plusieurs points temporels et finaux et de l’analyse à haut débit d’une seule VE. Cependant, les limites de la cytométrie en flux comprennent, sans s’y limiter, l’obstruction des pores et des signaux faibles. Une autre approche utilisée est la centrifugation par gradient, qui utilise des matériaux de différentes densités à centrifuger avec les VE et permet une meilleure séparation des VE par rapport à l’ultracentrifugation. Bien que cette technique améliore la séparation, elle demande beaucoup de main-d’œuvre, de temps et peut entraîner une perte importante d’échantillon. De plus, les précipitations et la filtration peuvent également être utilisées pour isoler les VE. Ces deux techniques sont simples et rapides, mais elles peuvent toutes deux entraîner la contamination de l’échantillon. Bien qu’il existe plusieurs techniques pour isoler les VE, chaque technique a ses avantages et ses limites, qui sont énumérés ci-dessous (Tableau 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54, 55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67.

Une fois les VE isolés, des tests moléculaires peuvent être effectués pour caractériser les VE. Les Western blots sont un test courant pour rechercher l’expression des protéines de surface et de cargaison 68,69,70 et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour l’expression des miARN 71,72,73 pour les VE 74,75,76. Ces tests sont établis et peuvent générer des résultats intrigants. Une limitation de ces méthodes est qu’elles nécessitent une grande quantité de protéines ou d’ARN à partir des VE pour obtenir une lecturede 77, ce qui est un problème pour les échantillons qui ont un petit volume ou une faible concentration de VE, pour commencer.

L’analyseur de nanoparticules dont il est question dans cet article permet à l’utilisateur de surmonter bon nombre des limitations énoncées dans le tableau 1 et le tableau 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90 . Cette méthode ne nécessite pas l’utilisation de techniques d’isolation, ce qui aidera à surmonter le rendement réduit des VE. Cette méthode permet également à l’utilisateur d’analyser les protéines de surface et de cargaison, le nombre total d’VE et la taille des VE à partir d’un volume d’échantillon aussi faible que 1 μL. Pour ce faire, on utilise des puces de tétraspanine fournies par l’entreprise qui utilise une puce à anticorps avec des anticorps de tétraspanine, CD63, CD81 et CD9, pour identifier les VE dans une solution, comme le montre la figure 2. Les anticorps fluorescents confirment la présence de VE, tout en empêchant les particules contaminantes de fausser les résultats.

L’objectif global de cette technique est de fournir une méthode moins chronophage pour analyser les VE ainsi que d’analyser les VE à partir d’un petit volume d’échantillon. L’utilisation de cet analyseur de nanoparticules permet aux utilisateurs d’analyser la taille, le nombre total de particules et les protéines de surface à partir d’aussi peu que 1 μL d’un échantillon, ce qui est idéal pour les fluides biologiques tels que les larmes et la salive.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les études décrites étaient conformes à la Déclaration d’Helsinki. Le consentement écrit de chaque sujet a été obtenu avant d’être inclus dans l’étude. L’approbation de l’Institutional Review Board (IRB) de l’hôpital universitaire d’Aarhus (1-10-72-77-14) et de l’Institut Dean McGee (1576837-2) a été reçue conformément aux directives fédérales et institutionnelles. Avant le traitement, tous les échantillons de larmes et de salive ont été anonymisés. Toutes les études ont été examinées et approuvées par le North Texas Regional Institutional Review Board (#2020-030). Le protocole suivant adhère à toutes les directives et a été approuvé, comme mentionné ci-dessus.

1. Jour 1 : Préparation de l’échantillon et incubation

  1. Prélever des échantillons de liquide biologique, c’est-à-dire des larmes et de la salive d’un ou des sujets ou décongeler des échantillons du congélateur.
    1. Larmes : Prélevez passivement les larmes du ménisque latéral à l’aide d’un tube capillaire en verre.
      1. Placez le tube capillaire en verre sur la paupière inférieure, en faisant attention de ne pas toucher la cornée.
      2. Prélever un volume de 10 μL de larmes en 10 min.
      3. Utilisez les larmes immédiatement ou conservez-les à -20 °C.
    2. Salive : Recueillir la salive de la bave passive dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL
      1. Laissez le donneur accumuler de la salive dans sa bouche.
      2. Demandez au donneur de baver dans le tube à l’aide d’un entonnoir.
      3. Utilisez la salive immédiatement ou conservez-la à -20 °C.
  2. Placez la ou les pastilles de tétraspanine dans la plaque de lavage des copeaux pendant 15 minutes avant d’ajouter des échantillons pour leur permettre d’atteindre la température ambiante. Lorsque vous placez les copeaux dans le puits, assurez-vous que les numéros sont sur la face inférieure vers le haut et que les copeaux ne touchent pas les parois latérales du ou des puits.
  3. Enregistrez le numéro d’identification et le numéro de la puce dans l’ordinateur portable pour garder une trace de la ou des puces.
  4. Branchez le bus série universel (USB) fourni avec le kit, puis extrayez et enregistrez le dossier avec le numéro de kit associé dans une zone désignée de votre choix.
  5. Pipette 99 μL de la solution B dans un tube de 1,5 mL.
  6. Ajoutez 1 μL de liquide biologique dans le tube de 1,5 mL préparé à l’étape précédente.
  7. Faites tourner les tubes.
  8. Prélever 70 μL de la solution de l’étape 1.6 et pipeter sur la puce de tétraspanine.
  9. Placez le film sur la plaque de lavage des copeaux pour éviter que l’échantillon ne s’évapore.
  10. Incuber pendant 16 h à température ambiante (RT) sur un banc sans vibrations.

2. Jour 2 : Lavage des copeaux

  1. Allumez la machine à laver les copeaux.
  2. Retirez le film de l’étape 1.9 de la plaque.
  3. Placez la plaque dans la rondelle à copeaux, en vous assurant qu’elle se verrouille en place, et fermez le couvercle.
    REMARQUE : La plaque ne se déplacera pas facilement si elle est correctement verrouillée en place.
  4. Appuyez sur l’option CW-TETRA v0 sur la laveuse de copeaux.
  5. Sélectionnez la rangée de départ et le nombre de rangs à laver.
  6. Appuyez sur Continuer sur la machine à laver les copeaux.
  7. Pendant que la ou les puces sont lavées, préparez la solution de blocage contenant les anticorps dans un tube comme suit :
    1. Préparez 300 μL de solution de blocage par puce.
    2. Ajouter 0,6 μL ou chaque anticorps par puce (vortex et spin down des anticorps avant de les ajouter à la solution de blocage)
    3. Vortex la solution bloquante + cocktail d’anticorps.
      REMARQUE : Couvrez la solution de blocage + le cocktail d’anticorps de la lumière pour assurer la stabilité des anticorps. Celui-ci doit être effectué le jour de l’utilisation.
  8. Lorsque le laveur de copeaux émet un bip, ajoutez 250 μL de solution bloquante + cocktail d’anticorps sur le ou les copeaux.
  9. Fermez le couvercle et appuyez sur Continuer.
    REMARQUE : Le laveur de copeaux va maintenant effectuer une incubation de 1 à h ainsi que plusieurs cycles supplémentaires de lavage et de rinçage.
  10. Lorsque le laveur de copeaux émet un bip, retirez la plaque de lavage des copeaux et déplacez le(s) copeau(s) sur la rampe.
  11. Remettez la plaque dans la rondelle à copeaux, en vous assurant qu’elle se verrouille en place. Fermez le couvercle et appuyez sur Continuer.
  12. Lorsque le laveur de copeaux a terminé le programme, retirez la plaque et placez le(s) copeau(s) sur une serviette en papier. Couvrez le(s) jeté(s) de la lumière.

3. Jour 2 : Balayage de la ou des puces

  1. Mettez le scanner sous tension et ouvrez le logiciel de numérisation.
    REMARQUE : Le scanner sera soumis à des auto-vérifications pour indiquer s’il y a des erreurs ou si la numérisation peut être poursuivie.
  2. Sélectionnez Enregistrer le dossier et choisissez l’emplacement d’enregistrement des fichiers.
  3. Sélectionnez Dossier ChipFile et choisissez le dossier enregistré à l’étape 1.4.
  4. Sélectionnez l’option déroulante pour choisir chaque copeau et localisez-le dans la position de la copeau sur le mandrin. Répétez cette étape pour toutes les puces qui doivent être analysées.
  5. Activez la fluorescence en cliquant sur les trois cases sous Position de la puce. Les carrés deviendront respectivement jaunes, bleus et rouges.
  6. Retirez le couvercle du mandrin en appuyant sur le couvercle et tirez-le.
  7. Placez le(s) copeau(s) sur le mandrin, en vous assurant qu’ils sont solidement fixés.
  8. Remettez le couvercle du mandrin en place les chevilles dans les trous, appuyez et faites glisser le couvercle pour le verrouiller en place.
  9. Placez le mandrin sur la scène, en vous assurant qu’il se verrouille en place.
  10. Sélectionnez Analyser les puces.
  11. Sélectionnez OK.
  12. Une fois que la platine est complètement entrée dans la machine, fermez la porte.
    REMARQUE : Il faut environ 12 minutes pour scanner une seule puce.
  13. Une fois que le programme a fini d’analyser la ou les puces, ouvrez la porte pour éjecter la vérification de l’étape afin de voir si les analyses ont réussi.
    1. Si les balayages ont réussi, jetez la ou les puces et placez le prochain ensemble de puces sur le mandrin, ou remettez le mandrin vide sur la scène. Ensuite, quittez le logiciel et éteignez la machine lorsque vous avez terminé.
    2. Si les analyses n’ont pas réussi, examinez le code d’erreur et corrigez-le.

4. Traitement des données

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse.
  2. Sélectionnez Données de pré-numérisation et choisissez le dossier contenant l’analyse de l’étape 3.2 du jour 2.
  3. Sélectionnez Suivant.
  4. Étiquetez la ou les puces dans la colonne Nom de l’échantillon avec le nom de l’échantillon en cliquant sur la cellule et en saisissant l’ID de l’échantillon.
  5. Ensuite, étiquetez les tétraspanines dans la colonne Nom du canal . Rouge = CD63, Vert = CD81 et Bleu = CD9.
  6. Sélectionnez Suivant.
  7. Sélectionnez CV élevé dans le groupe Sélectionner un point pour inspecter la liste déroulante et désactiver les CV élevés pour chaque puce en désactivant un ou deux points.
  8. Ensuite, sélectionnez Compte élevé et essayez de désactiver les avertissements de nombre élevé.
    REMARQUE : Certains échantillons peuvent avoir un nombre trop élevé, mais ils peuvent tout de même être analysés.
  9. Sélectionnez Tous les spots dans le menu déroulant, sélectionnez Montage Spot et vérifiez visuellement chaque éclat pour détecter toute déformation ou rayure qui peut être présente.
  10. Sélectionnez Suivant.
  11. Dans le canal CD63, réglez le minimum sur 300 pour vous débarrasser des globules rouges dans la ligne Moy % inclus ; les cellules jaunes sont fines et passent au canal CD81. Si la définition de la valeur minimale sur 300 ne fait pas passer la cellule rouge en jaune ou en blanche, passez à l’étape 4.14 pour le dépannage.
  12. Dans le canal CD81, réglez le minimum sur 300 pour vous débarrasser des globules rouges dans la ligne Moy % inclus ; les cellules jaunes sont fines et se dirigent vers le canal CD9. Si la définition de la valeur minimale sur 300 ne fait pas passer la cellule rouge en jaune ou en blanche, passez à l’étape 4.14 pour le dépannage.
  13. Dans le canal CD9, réglez le minimum sur 400 pour vous débarrasser des globules rouges dans la ligne Moy % inclus ; Les cellules jaunes sont acceptables et passez à l’étape 4.15. Si la définition de la valeur minimale sur 400 ne fait pas passer la cellule rouge en jaune ou en blanc, passez à l’étape 4.14 du dépannage.
  14. Dépannage
    1. Augmentez la valeur minimale de 100 unités.
    2. Si l’étape 4.14.1 n’a pas fonctionné, sélectionnez la puce dans la section Choisir les puces sur lesquelles travailler et choisissez la puce. Sélectionnez Nombre de particules et désactivez le ou les endroits où le nombre de particules est élevé. Sélectionnez Intensité/Taille, sélectionnez Tous les jetons et voyez si cela résout le problème.
    3. Si l’étape 4.14.2 n’a pas fonctionné, sélectionnez la puce dans la section Choisir les puces sur lesquelles travailler et choisissez la puce. Sélectionnez Single-Chip Cutoffs et augmentez le minimum de 100 unités. Sélectionnez ensuite Tous les jetons pour voir si la cellule rouge est maintenant jaune. Si cela ne fonctionne pas, répétez cette étape jusqu’à ce que la cellule % moyen inclus soit jaune ou blanche.
  15. Sélectionnez Suivant.
  16. Désélectionnez le canal de messagerie instantanée.
  17. Définissez la valeur de la carte thermique dans le coin inférieur droit pour inclure toutes les particules et sélectionnez Ajouter un graphique au rapport.
    1. Ajustez le nombre maximal dans la liste déroulante et entrez manuellement une valeur.
  18. Ensuite, sélectionnez le menu déroulant en haut au milieu sous Sondes de capture et sélectionnez CD63.
  19. Sélectionnez Ajouter un tracé au rapport pour ajouter le nombre total de particules au rapport.
  20. Sélectionnez le menu déroulant sous Mode d’analyse, choisissez Colocalisation et Ajouter un tracé au rapport.
  21. Ensuite, sélectionnez Taille, sélectionnez Changer la vue en Tracé, puis sélectionnez Ajouter un tracé au rapport.
  22. Enfin, sélectionnez Images , puis Ajouter un tracé au rapport.
  23. Répétez les étapes 4.18 à 4.22 pour les CD81 et CD9, en veillant à désélectionner le canal IM à chaque fois.
  24. Une fois que tous les éléments ont été ajoutés au rapport, sélectionnez Exporter le rapport, assurez-vous qu’il est enregistré dans le bon fichier, puis sélectionnez Dossier.
    REMARQUE : Des fichiers Excel et des images ont été générés et peuvent maintenant être utilisés pour une analyse plus approfondie.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lors de l’analyse des taches sur les puces, visez une concentration optimale de VE en observant les VE marqués par fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9, et le canal MIgG30,91 doit rester noir, car il s’agit du canal de contrôle comme le montre la figure 3A. Le taux de CD81 sera réduit pour les fluides biologiques. S’il n’y a pas de fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9, il y a absence de VE (Figure 3B). Veillez à ne pas trop saturer la puce (Figure 3C). Il sera donc difficile pour le logiciel d’analyse de calculer la précision de la taille, du nombre total de particules et des phénotypes des VE. À partir des points de concentration optimale, le logiciel d’analyse sera en mesure de mesurer la taille (50-200 nm), le nombre total de particules et l’expression de la tétraspanine des VE (figure 4) et sera exporté dans des feuilles de calcul individuelles pour une analyse plus approfondie. L’analyse de la tétraspanine inclura la colocalisation des protéines de surface sur les VE. La colocalisation sera représentée par un « / », par exemple, « CD63/CD81 ». Cela ne signifie pas que CD63 et CD81 sont combinés ; cela signifie que CD63 et CD81 sont situés à la surface du VE.

Ces résultats fourniront des informations précieuses entre les échantillons sains et malades. Nous serons en mesure de déterminer si des échantillons sains ou des échantillons malades produisent plus de VE, des VE plus grands ou plus petits, et le phénotype des VE. L’une ou l’autre de ces caractéristiques pourrait jouer un rôle dans la biogenèse et/ou la progression de la maladie. Grâce à ces résultats, nous serons en mesure de voir s’il y a une absence ou une augmentation des niveaux de tétraspanine, ce qui peut donner un aperçu des processus cellulaires et de la formation des VE.

figure-results-1
Figure 1 : Les types et les tailles des différents VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Schéma de la façon dont les puces tétraspanine capturent et détectent les VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Optimisation des concentrations de VE. (A) Concentration optimale des VE. (B) Résultat négatif : aucun VE présent. (C) Sursaturation des VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Données générées par l’analyseur de nanoparticules. (A) Taille du diamètre de l’IL mesurée en nanomètres. (B) Nombre total de particules des VE. (C) Phénotype colocalisé EV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

TechniqueAvantagesLimitations
UltracentrifugeHaute pureté42,43Changements de morphologie EV42,44
Homogénéité42,45Nécessite un grand volume42,44,46
Fonctionnalité42,43Cher42,43
Cytométrie en fluxÉvaluation d’échantillons à plusieurs points temporels47Signal faible48,49
Plusieurs points de terminaison47,50Pores obstrués51
Analyse d’un seul véhicule électrique à haut débit52,53
Centrifugation à gradient de densitéProduire des échantillons d’une grande pureté54Main-d’œuvreintensive 55,56
Variété d’échantillons55,57Chronophage55,58 
Perte de rendement importante54
PrécipitationSimple59,60Contamination36,44,61
Rapide61,62Non spécifique63
Haut rendement44,59,62
pH neutre36
FiltrationSimple64 Exosomes pièges65
Rapide64Endommage les grandes vésicules36
Bon marché64Gâteau de filtration66,67
Obstruction des exosomes65

Tableau 1 : Avantages et limites des techniques d’isolation des VE. Une liste des différentes façons d’isoler les VE, y compris leurs avantages et leurs limites.

TechniqueAvantagesLimitations
Diffusion dynamique de la lumièreMesure de particules dont la taille varie de 1 nm à 6 μM78 Ne convient pas pour la mesure d’échantillons d’exosomes complexes avec une grande plage de taille79 
La limite inférieure est de 10 nm, ce qui convient aux systèmes monodispersés79 Impossible de distinguer les protéines contaminées des exosomes79
Microscopie électronique à transmission (MET)Observer la morphologie des exosomes79,80 Préparations d’échantillons compliquées79 
Observer la structure interne81 Impossible de distinguer les exosomes en fonction de leur taille et de leur forme en raison de signaux de fluorescence exagérés82 
Analyse du suivi des nanoparticulesMesure de la concentration, de la taille et de la distribution granulométrique des exosomes dans la gamme de 10 nm à 2 μM78 Impossible de différencier les VE des agrégats de protéines et d’autres contaminants83 
Préparation et mesure rapides des échantillons78,84Instrument NTA85 coûteux 
Les échantillons peuvent être récupérés sous forme native84 Sensible aux vibrations85
Western Blot (WBs)peut analyser qualitativement et quantitativement les protéines marqueurs79,86 Compliqué et chronophage79 
Analyse d’exosomes à partir de milieux de culture cellulaire79 Les isolats de VE peuvent contenir des lipoprotéines et d’autres contaminants86 
Cytométrie en fluxUne sensibilité plus élevée et une imagerie haute résolution pourChronophage et laborieux avec une limite de détection de 400 nm79,88 
distinguer les exosomes colorés des confinements87 
Faible concentration d’échantillon requise79 Les signaux optiques entravent la précision et la résolution88 
ExoviewMesurer les tétraspanines (CD9, CD63 et CD81) sur les exosomes89 Ne mesure pas les grandes tailles de VE75
Mesure les protéines cargo EV90

Tableau 2 : Avantages et limites des techniques de caractérisation des VE.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étape la plus critique de ce protocole est de s’assurer qu’une concentration optimale de VE est atteinte. Il doit y avoir suffisamment de VE présents pour obtenir une lecture, mais pas trop de VE qui sursatureront la puce. La meilleure façon de déterminer la concentration optimale de VE est d’effectuer un cycle d’optimisation avec 1 μL d’échantillon et de voir si la concentration doit être ajustée. Une autre étape critique consiste à voir s’il y a une abondance de débris cellulaires dans l’échantillon, ce qui peut être déterminé en visualisant de gros morceaux sur les puces dans le logiciel d’analyse. Si l’échantillon contient des débris cellulaires, une simple centrifugation ou un filtrage de l’échantillon devrait résoudre ce problème.

Une étape supplémentaire cruciale consiste à s’assurer que les copeaux ne touchent pas les parois du puits et à éviter tout contact avec la zone centrale des copeaux lorsque vous les placez sur la rampe. Le scanner lira à partir du carré au centre de la puce, il est donc essentiel d’éviter de toucher cette zone avec la pince pour éviter de perturber les VE.

Cette méthode présente certaines limites, telles que la concentration insuffisante de VE pour la détection par l’instrument. La concentration pourrait être améliorée soit en séchant l’échantillon, soit en utilisant un tube concentrateur. Une autre limitation est que le logiciel d’analyse ne mesure que les VE dans la gamme de 50 à 200 nm, à l’exclusion de certaines microvésicules et de tous les corps apoptotiques des mesures de taille75.

Il existe de nombreuses façons d’isoler (Tableau 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67) et analyser les VE (Tableau 2 78,79,80,81,82,83,84,85, 86,87,88,89,90), et l’étalon-or actuel pour l’isolation des VE est l’ultracentrifugation 36,37,38 pour granuler les cellules pour des tests tels que Western Blots 68,69,70 et PCR 71,72,73,74,75 et 76. Bien que ce protocole fonctionne bien pour les grands échantillons 42,44,46, l’obtention de fluides biologiques peut être difficile et, souvent, seul un petit volume d’échantillons peut être recueilli à la fois, ce qui n’est pas idéal pour l’ultracentrifugation. En revanche, l’utilisation de cet analyseur de nanoparticules permet à l’utilisateur de générer des données précieuses, telles que la taille, le nombre total de particules et le phénotype des VE, dans aussi peu que 1 μL d’échantillon, ce qui le rend idéal pour les fluides biologiques. Nous serons en mesure d’élargir la connaissance des VE à partir de petits volumes d’échantillons difficiles à extraire, ce qui peut augmenter le confort du patient et éventuellement trouver des cibles thérapeutiques potentielles pour diverses maladies et troubles.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent ou autre conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier les NIH pour le financement (EY031316 et EY034714). Nous tenons également à remercier l’UNTHSC et le NTERI pour l’espace de laboratoire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100Incuber, laver, rince et sèche les copeaux de tétraspanine. Ce modèle actuel n’est plus disponible. Prix au moment de l’achat : 9 995,00 $
Logiciel ExoView AnalyzerNanoViewN/AAnalyse les informations de la puce et produit des fichiers Excel pour une analyse plus approfondie. N’est plus disponible.
ExoView R100NanoViewEV-R100Utilisé pour scanner les puces de tétraspanine à 3 longueurs d’onde. Ce modèle actuel n’est plus disponible. Prix au moment de l’achat :  ; $110,000.00
Logiciel ExoView ScannerNanoViewN/AScanne les puces à 3 longueurs d’onde différentes. N’est plus disponible.
EV-TETRA-CComprend 8 puces de tétraspanine, une solution d’incubation, une solution de blocage, un anticorps CD63, un anticorps CD81, un anticorps CD9, une solution A, une solution B, une clé USB et un couvercle de plaque.

Références

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