Quantification du comportement de toilettage de Drosophila melanogaster pour l’évaluation des phénotypes de toilettage excessif

Summary

La méthode présentée ici implique l’annotation manuelle d’images acquises de Drosophila melanogaster pour des comportements de toilettage spécifiques. Il permet de quantifier à la fois le nombre de séances de toilettage et le temps total consacré au toilettage afin d’évaluer les phénotypes atypiques d’auto-toilettage.

Abstract

Les changements observables dans le toilettage stéréotypé sont appliqués de manière translationnelle dans des organismes modèles. Ces changements sont représentatifs de pathologies qui suscitent des déviations similaires dans le comportement humain ; par exemple, le toilettage excessif agit comme un proxy pour les comportements obsessionnels et compulsifs présents dans des conditions telles que le syndrome de Gilles de la Tourette ou le trouble obsessionnel-compulsif. Le test de toilettage présenté permet d’évaluer les phénotypes anormaux d’auto-toilettage chez Drosophila melanogaster. Les mouches sont enregistrées pendant une période de 10 minutes, et ces enregistrements sont observés et annotés à l’aveugle pour les comportements de toilettage préalablement définis. Des mesures quantitatives de la fréquence des séances de toilettage et du temps consacré à l’autotoilettage peuvent être obtenues en annotant manuellement les séquences. Le test est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériaux qui ne sont pas déjà disponibles dans les environnements de laboratoire et est facilement adaptable pour répondre aux besoins spécifiques de toute étude visant à observer le toilettage. De plus, le faible niveau de compétence requis pour effectuer le test, par rapport aux méthodes automatisées à forte intensité informatique, rend le protocole bien adapté aux petits laboratoires et aux étudiants. Nous discutons en détail des étapes requises pour effectuer ce test et de ses limites actuelles.

Introduction

Drosophila melanogaster est un organisme modèle bien établi dans les études comportementales et neurobiologiques, fournissant un aperçu des mécanismes à l’origine de comportements humains analogues. L’auto-toilettage dans cet organisme est un comportement hautement régulé et bien défini, suivant des modèles stéréotypés qui se distinguent facilement les uns des autres¹. Les comportements de toilettage séparés présentés par la mouche peuvent généralement être classés par région anatomique², étant plus facilement définie comme postérieure ou antérieure. Le toilettage de la drosophile se concentrera d’abord sur la région antérieure puis passera à l’extrémité postérieure³. Dans des conditions typiques, les mouches présentent des comportements de toilettage pour maintenir la propreté (par exemple, en enlevant la poussière) et se produisent en réponse à une exposition à des stimuli externes potentiellement nocifs comme les microbes pathogènes⁴.

Des anomalies dans le comportement de toilettage, en particulier le toilettage obsessionnel spontané, ont été utilisées dans divers systèmes modèles comme indicateur de comportement obsessionnel et/ou compulsif. Les résultats translationnels observant les comportements de toilettage obsessionnel chez des organismes tels que les rongeurs, les oiseaux et les chiens ont donné un aperçu des conditions suscitant un comportement compulsif similaire chez les humains⁵. Il s’agit notamment de conditions telles que la trichotillomanie, le trouble obsessionnel compulsif et le syndrome de Gilles de la Tourette⁶. Le comportement de toilettage excessif a également été utilisé comme référence dans l’évaluation des phénotypes comportementaux dans des modèles de conditions neurodéveloppementales similaires chez Drosophila melanogaster. Des comportements de toilettage obsessionnel ont été observés dans des modèles de mouches du syndrome de l’X fragile (FSX) et des troubles du spectre autistique associés (TSA). Un toilettage spontané excessif se produit sous des mutations de dfmr1, l’orthologue de l’ASD et le gène FMR1⁷ associé à FSX. Il y a en outre un changement notable dans la distribution du toilettage entre les extrémités postérieures et antérieures chez ces mutants⁸. Ces changements sont interprétés comme le reflet de comportements obsessionnels et compulsifs centrés sur le corps affichés par certains patients atteints de ces conditions. En utilisant le test de toilettage décrit ici, nous avons observé des comportements de toilettage chez les mouches après une inactivation médiée par l’ARNi du gène de la drosophile Atg8a produit par des pilotes GAL4 disponibles dans le commerce et des lignées⁹ d’ARN-UAS.

Cette méthode implique l’annotation manuelle d’images prises de mouches pour des comportements de toilettage spécifiques. Les études antérieures visant à évaluer le comportement de toilettage, telles que celles utilisant des méthodes indirectes comme les colorants, bien qu’efficaces pour quantifier l’efficacité du toilettage, ne permettent pas de mesurer la durée ou la fréquence du toilettage¹⁰. Ce test permet toutefois de quantifier la fréquence et la durée du toilettage de la drosophile , à la fois de manière générale et par région anatomique. La méthode détaillée ici présente certains avantages par rapport aux méthodes automatisées actuelles, car elle est facilement modifiable et peut être menée par des personnes n’ayant pas de connaissances en informatique. L’équipement requis étant facilement disponible dans la plupart des laboratoires, nous présentons une manière rentable d’évaluer la présence d’un phénotype d’auto-toilettage excessif (voir le tableau des matériaux). Cela rend la méthode facilement accessible aux établissements de premier cycle et facilement adaptable aux environnements de formation ou aux laboratoires d’enseignement.

Protocol

REMARQUE : La figure 1 présente une vue d’ensemble du protocole.

1. Préparation au tournage

1. Placez quatre plats à trois puits côte à côte sur une surface blanche, en recouvrant chacun d’une lame de verre.
2. Positionnez une caméra (ici, un système Raspberry Pi, mais n’importe quelle caméra capable de vidéo haute définition suffit) au-dessus des paraboles.
   1. Assurez-vous que toutes les paraboles sont dans le cadre et la mise au point.
   2. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’éblouissement sur les lames qui limiterait la visibilité des mouches dans le plat. Éliminez l’éblouissement en ajustant la position de la plaque ou en atténuant les lumières dans l’espace d’enregistrement.
   3. Utilisez une haute résolution (minimum 1920 x 1080 pixels) pour visualiser avec précision les membres des mouches.
3. Marquez la position de la parabole et de la caméra sur la paillasse où se déroule l’enregistrement.
   REMARQUE : Cela limitera le temps passé à l’étape 2 dans l’utilisation future de l’appareil. Effectuer les tests en même temps et dans le même espace limitera la variabilité du comportement en fonction de facteurs allant au-delà des manipulations prévues.
4. Anesthésier légèrement les mouches de 4 à 9 jours froides sur un bloc de glace recouvert de parafilm et d’une serviette en papier (l’anesthésie au CO₂ aura un impact significatif sur le comportement).
   1. Tapotez les mouches sur le bloc et, une fois anesthésiées, déplacez-les vers les chambres d’observation le plus rapidement possible à l’aide d’un pinceau.
      REMARQUE : Ce transfert doit se produire le plus rapidement possible, car une exposition excessive à une anesthésie de toute nature peut avoir un impact négatif sur les mouches.
5. Placez une seule mouche dans chaque puits.
6. Laissez les fichiers s’acclimater à leur nouvel environnement pendant 30 minutes après l’anesthésie. Ne touchez pas ou ne dérangez pas les puits contenant des mouches après ce point, car des facteurs de stress supplémentaires auront un impact sur le comportement.

2. Enregistrement des mouches

1. Après l’acclimatation de 30 minutes, enregistrez les mouches à l’aide d’un appareil photo.
2. Utilisez une caméra Raspberry Pi exécutée par PiSpy¹¹ pour la collecte de données comportementales.
   REMARQUE : Le logiciel est gratuit et disponible sur GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), et un système Pi peut facilement être configuré pour moins de 300 $. D’autres caméras, si elles sont déjà disponibles, sont également suffisantes pour l’enregistrement de séquences
3. Démarrez un enregistrement avec Pi avec le flux de commande suivant.
   1. Ouvrez le terminal et tapez cd PiSpy. Ensuite, tapez python3 PiSpy.py, entrez la durée d’enregistrement souhaitée et entrez la fréquence d’images souhaitée. Sélectionnez la résolution souhaitée et cliquez sur Capture rapide.
   2. Utilisez la fonction d’aperçu de l’appareil photo pour vous assurer que les mouches sont nettes et suffisamment visibles.
4. Enregistrez les mouches pendant 10 minutes à une fréquence d’images recommandée de 24 ips et enregistrez le fichier (PiSpy l’enregistre automatiquement dans le dossier vidéos).

3. Analyse vidéo (figure 2)

1. Pour analyser la vidéo, importez le fichier dans le logiciel Elan 6.8¹².
   REMARQUE : Ce logiciel, bien qu’il ait été développé à l’origine pour les suifs psycholinguistiques, permet l’annotation détaillée des vidéos et l’analyse approfondie des comportements de toilettage
2. Attribuez chaque ligne comme illustré ci-dessous pour annoter manuellement les séquences des individus.
   1. Pour ce faire, utilisez le flux de commande suivant : Niveau > Ajouter un nouveau niveau > Type d’emplacement dans l’antenne parabolique sur Nom du niveau > Ajouter.
3. En fonction des besoins d’une étude, notez et quantifiez divers comportements spécifiques (toilettage antérieur et postérieur, marche, sommeil et station debout).
   1. Faites des annotations en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Double-cliquez sur le niveau à annoter. Faites un clic droit et faites glisser le curseur le long du niveau sélectionné pendant une période au cours de laquelle un seul combat de toilettage est présenté. Cliquez avec le bouton gauche, sélectionnez Nouvelle annotation et double-cliquez sur la période nouvellement mise en surbrillance. Tapez l’abréviation du comportement affiché à ce moment-là.
   2. Observez les vidéos lentement, parcourez-les avec une souris et annotez. Zoomez sur un seul puits de mouche pendant l’annotation pour éviter la fausse identification des comportements. Il peut s’agir de taper sur le bord du verre par la mouche ou de déplacer les pattes, ce qui peut initialement ressembler à du toilettage.
4. Une fois la vidéo entièrement annotée, obtenez une répartition de chaque comportement. Assurez-vous que la même abréviation ou annotation est utilisée dans toutes les vidéos pour utiliser cette fonctionnalité.
   REMARQUE : Elan 6.8 indique le nombre de fois qu’un comportement se produit, la durée totale des comportements et le temps moyen consacré à chaque comportement.
   1. Définissez les séances de toilettage comme 2 secondes de toilettage ininterrompu. Identifiez chaque comportement observé comme suit. Définir les paramètres des régions anatomiques avant la réalisation du test.
      1. Toilettage antérieur : Identifiez le toilettage effectué dans la région antérieure du corps de la mouche comme étant un toilettage antérieur.
         REMARQUE : Ce comportement impliquera presque toujours un mouvement de frottement sur une partie antérieure, comme la tête ou la trompe, avec les deux pattes avant de la mouche.
      2. Toilettage postérieur : Identifiez le toilettage effectué à l’extrémité avant-postérieure du corps de la mouche comme étant un toilettage postérieur.
         REMARQUE : De plus, des ailes ont été incluses dans la région postérieure pour plus de simplicité. Ce comportement impliquera presque toujours un mouvement de frottement avec l’ensemble des pattes centrales et les plus postérieures à la volée. Un bon indicateur qu’il y a toilettage postérieur est le fait qu’à première vue, la mouche peut donner l’impression qu’il lui manque ses pattes les plus postérieures, comme le montre la figure 2D.

Results

Ce test produit des données quantitatives mesurant le temps et la fréquence des comportements de toilettage à partir de séquences annotées. La figure 2 présente une image représentative de la configuration et de la définition des comportements. Étant donné la subjectivité introduite par l’analyse vidéo, toutes les annotations des vidéos doivent être cachées par le chercheur qui effectue l’analyse.

Cette méthode a été utilisée pour évaluer le rôle du gène de la

Discussion

Dans l’ensemble, ce test facilement exécutable et rentable permet une caractérisation robuste du comportement de toilettage de Drosophila melanogaster . Cette technique donne un aperçu de la fréquence, du temps passé à s’engager et de la distribution anatomique d’un grand nombre de comportements de toilettage précédemment identifiés. Un bon indicateur que le toilettage aura lieu ou est en cours est les changements dans le placement des pattes, en particulier le fait de lever l’u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carte Micro SD de 16 Go	Adafruit	1294	À utiliser lors de l’introduction du système d’exploitation
Affichage	Adafruit	3578	Tout écran pouvant être connecté par HDMI ou câble flexible est suffisant
Drosophila Atg8a-RNAi Ligne UAS	Bloomington Stock Center	34340	Ligne utilisée dans les données représentatives
Drosophile Ok6 Pilote	N/A	N/A	Ligne utilisée dans les données représentatives
Lames de verre	Fisher Scientific	12-550-A3	Maintient les mouches en confinement
Dissipateurs thermiques	Adafruit		Empêche la surchauffe de l’ordinateur
Objectif	Adafruit	4563	Utilisé uniquement avec caméra HD PiCamera
	Adafruit	4561	La version HD a été utilisée ici, mais une caméra standard peut être utilisée sous contraintes budgétaires
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	L’ordinateur PiSpy fonctionne sur
câble Ribbion Adafruit		1648	Pour une utilisation dans la connexion de composants SB de l’appareil photo et de l’écran
Boîtier	Adafruit	4301	Protège l’ordinateur
Spot Plate	Fisher Scientific	S99406	Les versions Pyrex étaient déjà disponibles pour notre utilisation, mais des paraboles de culture cellulaire ou des plaques d’affichage en plastique suffisent également
Trépied	Best Buy	6355959	Pour la suspension et le positionnement de la caméra, tout appareil capable de cela est suffisant
Alimentation USB C	Adafruit	1995	Fournit de l’énergie à l’ordinateur