Article de méthode

Détermination de quatre composants dans un système d’administration d’ARN de nanoparticules lipidiques par chromatographie liquide combinée à un détecteur de diffusion de la lumière par évaporation

DOI :

10.3791/67711

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30 mai 2025

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous établissons une méthode d’analyse quantitative pour quatre composants dans un système de distribution d’ARN de nanoparticules lipidiques (LNP) à l’aide d’une chromatographie liquide à haute performance combinée à un détecteur de diffusion de lumière par évaporation (ELSD). La méthode a une bonne séparation, une sensibilité élevée et une efficacité élevée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente une méthode d’analyse des composants des nanoparticules lipidiques (LNP). La LNP, qui sert de vecteur pivot pour les médicaments à base d’ARN, se compose principalement de cholestérol, de PEG avec modifications, de lipides ionisables et de lipides auxiliaires. Ces composants présentent une faible polarité, ce qui entraîne une forte rétention et des difficultés de séparation à l’aide de la chromatographie en phase inverse, ainsi que des caractéristiques d’absorption ultraviolette distinctes. Afin de relever ce défi, un système de chromatographie liquide a été couplé à un détecteur de diffusion de lumière par évaporation (ELSD). En ajustant systématiquement le type de colonne chromatographique et en optimisant le programme d’élution par gradient de la phase mobile, une séparation de base rapide et complète des quatre composants critiques a été réalisée. L’utilisation de la dernière technologie ELSD a considérablement amélioré la sensibilité de détection et élargi la plage linéaire de la méthode. Les résultats expérimentaux ont démontré que, dans une plage de concentration de 5 μg/mL à 250 μg/mL, les quatre composantes de la LNP présentaient une excellente linéarité avec des coefficients de corrélation tous supérieurs à 0,999, et que la précision variait de 94,2 % à 108,0 %. Dans les expériences de précision, les écarts-types relatifs du temps de rétention et de la surface du pic pour une solution étalon de 10 μg/mL étaient inférieurs à 0,1 % et 2 %, respectivement. Lors de l’utilisation de cette méthode pour analyser différents échantillons de LNP, tous les composants sont séparés avec succès et leurs contenus respectifs sont quantifiés avec précision, ce qui souligne la robustesse de l’adaptabilité de cette approche analytique.

Introduction

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Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont l’un des systèmes de distribution de gènes non viraux les plus avancés, principalement utilisés pour l’administration de médicaments à base d’acides nucléiques, tels que les oligonucléotides antisens, les petits nucléotides interférents, l’ARNm, etc. 1,2,3. La LNP est généralement composée de quatre composants : les lipides ionisables, les lipides modifiés au polyéthylène glycol (PEG), les phospholipides et le cholestérol. Le composant clé est les lipides ionisables, qui sont le facteur décisif de l’efficacité de l’administration de médicaments à base d’acides nucléiques. Les trois autres composants peuvent augmenter la stabilité de la LNP et réduire la reconnaissance du système immunitaire 4,5,6.

Les rapports variables des quatre composants de la LNP peuvent avoir un impact significatif sur le processus d’auto-assemblage des nanoparticules, affectant des propriétés telles que l’efficacité d’encapsulation de l’ingrédient pharmaceutique actif (API), son efficacité d’administration et le taux de libération in vivo 7,8,9. Par conséquent, il est essentiel d’établir une méthode d’analyse quantitative des composants LNP, facilitant ainsi la synthèse d’un système optimal de distribution LNP10,11.

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique contemporaine largement utilisée dans l’analyse pharmaceutique et est appréciée pour son efficacité, sa sensibilité et ses capacités d’automatisation élevées. L’HPLC englobe divers détecteurs, y compris les détecteurs ultraviolets (UV) conventionnels, ainsi que les détecteurs à usage général tels que les détecteurs d’indice de réfraction (RID), les détecteurs de diffusion de lumière par évaporation (ELSD), les détecteurs d’aérosols chargés (CAD) et les détecteurs de radiofréquence (RF) hautement sélectifs, entre autres12.

Dans le cas de l’analyse des quatre composants de la LNP, qui n’ont pas de groupes absorbant les UV distincts et ne produisent donc aucune réponse dans les détecteurs UV, l’utilisation de détecteurs à usage général a été envisagée. Bien que le RID soit l’une de ces options, il ne convient pas à l’analyse de gradient et offre une sensibilité relativement plus faible par rapport aux deux autres détecteurs à usage général ; Par conséquent, il n’a pas été choisi12. De plus, si les détecteurs CAD sont dotés d’une sensibilité élevée, leur coût prohibitif les rend moins attrayants12.

Par conséquent, le détecteur ELSD a été sélectionné. Ce détecteur dispose d’une option de mode de gain distinctive - le mode « large » - qui permet l’analyse simultanée des composants à haute concentration et à l’état de traces, améliorant ainsi la sensibilité et élargissant la plage linéaire.

Cet article utilise un système HPLC couplé à l’ELSD, permettant une séparation efficace et une analyse quantitative des quatre composants de la LNP grâce à l’optimisation des colonnes chromatographiques, à l’élution du gradient des phases mobiles et à d’autres conditions13.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation de l’acte

  1. Configuration de l’instrument
    1. Mettre en place un système HPLC couplé à un ELSD.
  2. Installation de la colonne
    1. Installez la colonne chromatographique (C4-300 ; 150 mm × 4,6 mm de diamètre intérieur, 5 μm), en suivant la direction de la flèche sur la colonne, avec une extrémité connectée à la sortie de l’échantillonneur automatique et l’autre à l’entrée de l’ELSD.
  3. Préparation de phase mobile
    1. Préparez les phases mobiles : la phase A, une solution aqueuse de 10 mM de TEAA (pH = 7,0), et la phase B, une solution de méthanol de 10 mM de TEAA (pH = 7,0).
    2. Pour préparer la phase A, pesez avec précision 1,01 g de triéthylamine, dissolvez-le dans 1000 ml d’eau, mélangez bien et ajustez le pH à 7,0 avec de l’acide acétique.
    3. Pour préparer la phase B, dissoudre 1,01 g de triéthylamine dans 1000 mL de méthanol, mélanger et ajuster le pH à 7,0 avec de l’acide acétique.
  4. Édition de méthode
    1. Allumez les interrupteurs d’alimentation de chaque module du LC-ELSD et lancez le logiciel LabSolutions . Ensuite, ouvrez la fenêtre Analyse en temps réel .
    2. Cliquez sur Fichier et sélectionnez Nouveau pour créer un nouveau fichier de méthode. Modifiez le temps d’arrêt du LC dans la méthode sur 15 et cliquez sur Appliquer à tous les temps d’acquisition.
    3. Ensuite, cliquez sur Pompe pour modifier les paramètres de la pompe. Sélectionnez le mode d’analyse Gradient binaire à haute pression (B.GE) et réglez le débit sur 1,0 mL/min.
    4. Ensuite, réglez la concentration initiale de la pompe B ( %B) à 80 % et modifiez le gradient de phase mobile : à 3 min, %B est de 80 %, à 4 min, %B est de 85 % de 5,5 min à 12 min, %B est de 100 %, à 12,1 min, %B revient à 80 %.
    5. Ensuite, cliquez sur Four à colonne et réglez la température du four sur 55 °C. Enfin, cliquez sur ELSD pour modifier la température du tube de dérive à 40 °C. Enregistrez la méthode.
      REMARQUE : Le tableau 1 présente un résumé des paramètres.
  5. Démarrez et équilibrez l’instrument.
    1. Cliquez sur Télécharger et Démarrer pour démarrer et équilibrer l’instrument.

2. Préparation de solutions étalons et d’échantillons

  1. Préparation de solutions standard
    1. Peser avec précision 10,0 mg des quatre substances étalons de la LNP séparément, les dissoudre dans 1 mL de méthanol et agiter jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous pour obtenir des solutions mères avec une concentration de 10 mg/mL pour chaque composant.
    2. À l’aide d’une pipette, transférez avec précision 100 μL de chacune des quatre solutions mères dans un flacon d’échantillon, puis ajoutez 600 μL de méthanol. Bien mélanger pour préparer une solution intermédiaire mixte 1 d’une concentration de 1000 μg/mL.
    3. Transférez avec précision 20 μL de chacune des quatre solutions mères dans un flacon d’échantillon, puis ajoutez 920 μL de méthanol. Bien mélanger pour préparer une solution intermédiaire mixte 2 à une concentration de 200 μg/mL.
    4. Ensuite, préparer une série de solutions étalons à des concentrations de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL et 250 μg/mL par dilution en série conformément au tableau 2.
  2. Préparation des échantillons
    1. À l’aide d’une pipette, transférez avec précision 100 μL de l’échantillon dans un flacon d’échantillon, puis ajoutez 900 μL de méthanol et mélangez bien. À ce stade, assurez-vous que la concentration de LNP dans l’échantillon est diluée 10 fois et que la LNP est dissociée du médicament à base d’acide nucléique.

3. Acquisition de données

  1. Placez les solutions étalons et les solutions d’échantillon dans l’échantillonneur automatique du chromatographe liquide.
  2. Cliquez sur Lot en temps réel dans la barre d’outils de l’assistant de la fenêtre Analyse en temps réel . Ensuite, cliquez sur Nouveau dans le menu Fichier pour créer une table de lots.
  3. Dans la table de lots, entrez le # du flacon, le nom du bac, le fichier de données et le volume d’injection de la solution étalon et de l’échantillon, puis sélectionnez le fichier de méthode enregistré à l’étape 1.4. Cliquez sur Enregistrer le fichier de commandes dans le menu Fichier pour enregistrer le fichier de commandes.
  4. Attendez que la pression du chromatographie liquide et la ligne de base du chromatogramme soient stables. Ensuite, cliquez sur Démarrer Realtime Batch dans la barre d’outils de l’assistant pour démarrer l’acquisition des données.

4. Analyse des données

  1. Etablir des courbes d’étalonnage
    1. Ouvrez la fenêtre du navigateur du logiciel LabSolutions et faites glisser les données de la solution standard dans la vue des résultats quantitatifs pour établir une courbe d’étalonnage. Ensuite, modifiez les paramètres de traitement des données. Cliquez sur Modifier dans la vue Méthode.
    2. Dans la fenêtre Paramètres d’intégration , remplacez la valeur de pente par 10000. Ensuite, dans les paramètres d’identification, remplacez la méthode d’identification par Bande et définissez la bande passante par défaut sur 0,1 min.
    3. Après cela, modifiez les paramètres quantitatifs. Changez la méthode quantitative en Étalon externe et réglez le # du niveau d’étalonnage sur 7. Sélectionnez le type de courbe d’étalonnage Exponentiellement. Ensuite, modifiez le composé.
    4. Entrez les noms et les concentrations de solution standard des quatre composants LNP. Double-cliquez sur l’apex du pic pour mettre à jour les temps de rétention. Enfin, cliquez sur Afficher pour terminer la modification des paramètres de traitement des données.
    5. Modifiez le type d’échantillon dans la vue Résultats quantitatifs sur Standard (point de calcul). En fonction des concentrations, réglez les niveaux de la solution étalon de 1 à 7. Une fois les courbes d’étalonnage établies, cliquez sur Fichier dans la barre de menu et enregistrez le fichier de méthode.
  2. Analyse quantitative d’échantillons
    1. Faites glisser les données des échantillons dans la vue des résultats quantitatifs de la fenêtre du navigateur, qui affichera les résultats de concentration des quatre composants LNP dans les échantillons.

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Résultats

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L’analyse de la solution étalon LNP à l’aide de cette méthode a permis d’obtenir un degré de séparation supérieur à 1,5 pour les quatre composants, réalisant ainsi la séparation de base. De plus, aucun résidu n’a été observé dans les solutions étalons à haute concentration, comme le montre la figure 1. Une courbe d’étalonnage a été établie à l’intérieur d’une plage de concentration de 5 à 250 μg/mL, présentant des coefficients de corrélation tous supérieurs à 0,999, indiquant une large plage...

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Discussion

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Les quatre composantes de la LNP présentent une polarité relativement faible. Lorsqu’ils sont analysés à l’aide d’une colonne C18, les composés cibles présentent une forte rétention dans la colonne, conduisant à l’élargissement du pic de phospholipides pour les composants fortement retenus. De plus, après l’analyse de solutions à haute concentration, les résidus s’accumulent à la tête de la colonne C18, ce qui pourrait compromettre la précision de la quantification. Le chromatogramme est...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remerciez les sociétés biopharmaceutiques d’avoir fourni les échantillons LNP pour l’expérience, et gratitude envers Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd pour avoir fourni la colonne de chromatographie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalanceShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdAP135W
ColonneShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (Chine) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO.,LTD
LCShimadzu (Chine) CO.,LTDLC40D XR
MéthanolANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipette-100 & micro ; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-100
Pipette-1000 & micro ; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Système d’eau ultra-pureMilliporeZIQ7000T0C
Mélangeur VortexANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

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Mots-clés

Nanoparticules lipidiquesAnalyse des composants des LNPlution par gradientS paration de la ligne de baseChromatographie liquide haute performanceCourbe d talonnageM thode l talon externe

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