Article de méthode

Visualisation de la dynamique microbienne du cycle du méthane dans les zones humides côtières

DOI :

10.3791/67715

⸱

31 janvier 2025

 ,  ,  , 
1School of Earth, Environmental and Marine Sciences, University of Texas - Rio Grande Valley

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole détecte les principaux gènes du cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas et visualise leur distribution spatiale afin d’améliorer la compréhension de la régulation du méthane et de ses impacts environnementaux dans ces écosystèmes dynamiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les zones humides côtières sont la plus grande source biotique de méthane, où les méthanogènes convertissent la matière organique en méthane et les méthanotrophes oxydent le méthane, jouant ainsi un rôle essentiel dans la régulation du cycle du méthane. Les zones humides du sud du Texas, qui sont soumises à des événements météorologiques fréquents, à des niveaux de salinité fluctuants et à des activités anthropiques dues au changement climatique, influencent le cycle du méthane. Malgré l’importance écologique de ces processus, le cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas reste insuffisamment exploré. Pour combler cette lacune, nous avons développé et optimisé une méthode de détection des gènes liés aux méthanogènes et aux méthanotrophes, y compris mcrA comme biomarqueur pour les méthanogènes et pmoA1, pmoA2 et mmoX comme biomarqueurs pour les méthanotrophes. De plus, cette étude visait à visualiser les modèles de distribution spatiale et temporelle de l’abondance des méthanogènes et des méthanotrophes à l’aide du logiciel de système d’information géographique (SIG) ArcGIS Pro. L’intégration de ces techniques moléculaires à la visualisation géospatiale avancée a fourni des informations essentielles sur la distribution spatiale et temporelle des communautés de méthanogènes et de méthanotrophes dans les zones humides du sud du Texas. Ainsi, la méthodologie établie dans cette étude offre un cadre solide pour cartographier la dynamique microbienne dans les zones humides, améliorer notre compréhension du cycle du méthane dans des conditions environnementales variables et soutenir des études plus larges sur les changements écologiques et environnementaux.

Introduction

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Les zones humides côtières sont des écosystèmes vitaux qui contribuent à la régulation du climat, à la conservation de la biodiversité et à la gestion de l’eau par des processus tels que la séquestration du carbone, l’évapotranspiration et les émissions de méthane (CH4)1. Ces écosystèmes, qui comprennent les zones humides d’eau douce et d’eau salée2, sont très productifs et constituent des zones critiques pour l’absorption de dioxyde de carbone (CO2) et la capture de la matière organique dans les environnements terrestres et marins 3,4. Les interactions dynamiques au sein de ces zones humides stimulent la production et la consommation microbiennes de CH4 5, ce qui les positionne comme l’une des plus grandes sources naturelles de CH46. En tant que deuxième gaz à effet de serre le plus important, le CH4 a un potentiel de réchauffement planétaire environ 27 à 30 fois supérieur à celui du CO2 4,7,8,9, ce qui rend l’étude des émissions de CH 4 des zones humides côtières essentielle à l’ère du changement climatique. L’émission de CH4 est influencée par divers facteurs environnementaux, en particulier la salinité, qui joue un rôle crucial dans les processus microbiens10. Les zones humides d’eau douce contribuent de manière significative au méthane atmosphérique en raison de leurs faibles niveaux de sulfate, ce qui facilite une plus grande production microbienne de CH4, tandis que les zones humides d’eau salée ont généralement tendance à émettre moins de CH4 en raison de concentrations plus élevées de sulfates 11,12,13.

Les émissions de CH4 provenant des zones humides côtières sont généralement contrôlées par deux groupes de micro-organismes, connus sous le nom de méthanogènes et de méthanotrophes14. Les méthanogènes produisent du CH4 dans les sédiments anoxiques en décomposant des substrats tels que le formiate, l’acétate, l’hydrogène ou les composés méthylés par un processus connu sous le nom de méthanogenèse15. L’enzyme importante de cette voie est la méthyl-coenzyme M réductase (MCR), car elle catalyse l’étape finale et limitante de la méthanogenèse 15,16,17. Le gène mcrA, qui code pour la sous-unité alpha de MCR, est un marqueur fonctionnel que l’on retrouve chez toutes les archées méthanogènes18. De plus, dans les zones humides côtières, la zone de transition sulfate-méthane (SMTZ) se forme au-dessus de la zone méthanogène, où le méthane se diffusant vers le haut et le sulfate se déplaçant vers le bas convergent et s’appauvrissent19. Dans cette zone, les archées méthanotrophes anaérobies (ANME) oxydent le méthane en dioxyde de carbone à l’aide de l’enzyme MCR, tandis que les bactéries sulfato-réductrices (SRB) réduisent le sulfate en sulfure. Les SRB surpassent les méthanogènes pour l’hydrogène et l’acétate, limitant la production de méthane jusqu’à ce que le sulfate soit épuisé16,17.

En revanche, les bactéries méthanotrophes aérobies oxydent le CH4 dans les environnements aérobies20, en utilisant différentes formes de méthane monooxygénase (MMO). Il s’agit notamment de la méthane monooxygénase particulaire (pMMO), une enzyme contenant du cuivre intégrée dans la membrane intracytoplasmique, et de la méthane monooxygénase soluble (sMMO), une enzyme contenant du fer présente dans le cytoplasme. Cependant, pour le pMMO, il existe trois opérateurs de gènes pmoCAB21 ; parmi eux, le gène pmoA est le plus conservateur pour tous les méthanotrophes. Il existe deux gènes biomarqueurs différents pour le pmoA : pmoA1 et pmoA222. De plus, pour une compréhension complète des méthanotrophes, le gène mmoX est utilisé comme outil en biologie moléculaire pour identifier les méthanotrophes23 contenant des sMMO. Cette distinction dans les voies métaboliques et les exigences environnementales des méthanogènes et des méthanotrophes aérobies met en évidence les interactions microbiennes complexes qui régulent le cycle du méthane dans les écosystèmes des zones humides côtières.

La zone humide de Boca Chica (C.-B.), un environnement d’eau salée productif dans le sud du Texas, subit des influences de marée du golfe du Mexique (GOM), entraînant des niveaux de salinité de surface variables, notamment en raison de sa proximité avec l’hypersaline Laguna Madre24. Cette action des marées, alternant entre les marées hautes et basses, fait fluctuer les niveaux d’oxygène25 , ce qui pourrait modifier l’activité méthanogène et méthanotrophe dans les sédiments26. En revanche, les zones humides d’eau douce côtières sont considérées comme un point chaud important pour les flux de CH4 27. Les zones humides d’eau douce côtières du sud du Texas, y compris Resaca Del Rancho Viejo (RV) et Lozano Banco (LB), éloignées des effets de marée du GOM, ont une gestion hydrologique distincte. Le VR subit des débits pulsés complétés par de l’eau de rivière pendant les faibles niveaux d’eau, tandis que le LB fonctionne comme un système d’écoulement hors ligne sans une telle supplémentation. De plus, RV et LB maintiennent des niveaux de salinité plus faibles en raison d’un débit élevé d’eau douce pompée artificiellement et du fait qu’il s’agit d’un lac de bras mort, respectivement. Les différents facteurs environnementaux peuvent influencer de manière significative le cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas. Cependant, le cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas reste une zone qui n’a pas encore fait l’objet d’une enquête approfondie.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR en temps réel (également appelée PCR quantitative [qPCR]) représentent des techniques fondamentales et largement utilisées pour détecter et quantifier l’abondance relative de gènes spécifiques dans les échantillons environnementaux. Ces techniques amplifient spécifiquement les régions ciblées de l’ADN pour indiquer la présence et la quantité relative de gènes liés au cycle du CH4, fournissant ainsi des indicateurs du cycle potentiel du méthane. Néanmoins, la disponibilité et l’efficacité des ensembles d’amorces PCR peuvent être limitées par divers facteurs inhibiteurs dans l’ADN environnemental extrait, étant influencés par les types d’environnements28,29. Ainsi, cette étude a principalement établi une méthode PCR optimale pour détecter la présence de gènes liés au cycle CH4 dans les zones humides côtières du sud du Texas (Figure 1), puis a visualisé leur abondance relative quantifiée dans ces écosystèmes. Les résultats de cette étude peuvent être appliqués à d’autres régions côtières afin d’améliorer la compréhension du cycle du CH4 et de la dynamique microbienne dans divers écosystèmes côtiers.

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Protocole

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1. Prélèvement d’échantillons

  1. Prélever des échantillons de sédiments à l’aide d’un échantillonneur instantané ou d’une pelle.
    REMARQUE : Les échantillons ont été prélevés à partir de deux stations de trois milieux humides côtiers distincts pendant les saisons fraîches (octobre-février, la température moyenne est de 20 °C) et chaudes (avril-juin, température moyenne est de 27 °C) de 2023 et 2024. Un échantillonneur instantané de sédiments a été utilisé lors du prélèvement d’échantillons dans les milieux humides d’eau douce côtiers (figure 2) et une pelle a été utilisée pour les milieux humides côtiers d’eau salée influencés par les marées.
  2. Descendez d’abord l’échantillonneur dans le plan d’eau peu profond et laissez-le couler à la surface des sédiments (dans les 50 premiers cm) sous son propre poids, réduisant ainsi au minimum la perturbation de la structure sédimentaire, comme le montre la figure 2.
  3. Retirez-le de la colonne d’eau où la profondeur était généralement de 60 cm à 215 cm30, transférez les échantillons de sédiments dans des sacs à fermeture éclair et rangez-les immédiatement dans une glacière.
    REMARQUE : Nettoyez et lavez l’échantillonneur instantané avec de l’eau déminéralisée (DI) avant de passer aux stations suivantes.
  4. Conservez immédiatement tous les échantillons à -20 °C dans le laboratoire.
  5. Dans chaque site d’échantillonnage, mesurez les paramètres de qualité de l’eau de surface tels que la salinité et la température in situ à l’aide d’un indicateur de qualité de l’eau multiparamètre.
    REMARQUE : Les sondes ont été rincées à l’eau déminéralisée (eau DI) après utilisation dans chaque station.

2. Extraction de l’ADN génomique

  1. Décongelez les échantillons à température ambiante avant de commencer la procédure d’extraction de l’ADN génomique.
  2. Transvaser environ 500 mg d’échantillons de sédiments dans un tube de 15 mL et centrifuger à 4 250 × g pendant 3 minutes pour éliminer toute l’eau.
  3. Extrayez l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN pour le sol en suivant le protocole31 du fabricant avec une petite modification et stockez-le immédiatement à -20 °C.
    REMARQUE : Les modifications ont été apportées pour réduire la redondance et améliorer l’efficacité du flux de travail.
    1. Ajouter jusqu’à 500 mg d’échantillon de sol dans un tube contenant des billes de verre ou des sphères de céramique.
    2. Ajouter 978 μL de tampon de phosphate de sodium à l’échantillon dans le tube contenant une bille ou une sphère.
    3. Ajouter 122 μL de solution de lyse tampon à l’échantillon dans le tube contenant des billes ou des sphères pour solubiliser les contaminants externes.
    4. Homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes à 5 fois le niveau de vitesse pendant 20 s et répéter 2 fois.
      REMARQUE : Un homogénéisateur de broyeur à billes a été utilisé dans cette étude, c’est pourquoi la vitesse a été ajustée.
    5. Centrifuger le mélange pendant 10 min à 14 000 × g.
    6. Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre de 2,0 ml.
    7. Ajouter 250 μL de solution de précipitation des protéines (PPS) pour séparer les acides nucléiques solubilisés des débris cellulaires et de la matrice de lyse. Mélanger en inversant le tube 10x.
    8. Centrifuger à 14 000 × g pendant 5 min pour précipiter la pastille, éliminer les débris cellulaires et lyser la matrice.
    9. Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre de 15 ml.
    10. Ajouter 1,0 mL de suspension Binding Matrix au surnageant dans le tube de 15 mL.
      REMARQUE : Secouez la suspension de la matrice de liaison pour la remettre en suspension avant de l’ajouter.
    11. Permettez la liaison de l’ADN à la matrice de liaison en plaçant les tubes sur un rotateur pendant 2 min.
    12. Placez tous les tubes sur une grille et incubez pendant 3 min pour permettre la stabilisation de la matrice de liaison.
    13. Après 3 min, jeter 750 μL et mélanger délicatement le surnageant restant avec la pastille à l’aide d’une pipette.
    14. Transvaser 750 μL du mélange dans un filtre SPIN et centrifuger à 14 000 × g pendant 1 min. Videz le tube de récupération et réutilisez-le. Répétez l’opération avec le reste du mélange.
    15. Ajouter 500 μL de la solution de lavage préparée (avec la quantité appropriée d’éthanol ajoutée) pour solubiliser davantage les impuretés. Remettez doucement la pastille en suspension en utilisant la force du liquide de la pointe de la pipette.
    16. Centrifuger à 14 000 × g pendant 1 min pour éliminer les impuretés. Videz le tube de récupération et réutilisez-le.
    17. Centrifuger à nouveau à 14 000 × g pendant 2 min sans rien ajouter.
    18. Remplacez le tube de récupération par un tube de récupération neuf et propre et faites sécher à l’air libre le filtre SPIN pendant 5 minutes à température ambiante.
    19. Ajouter 50 μL d’eau libre d’ADN (DES) et centrifuger à 14 000 × g pendant 1 min.
      REMARQUE : Dans ce protocole, 50 μL de DES ont été utilisés pour l’élution de l’ADN afin d’assurer une récupération et une stabilité optimales de l’ADN environnemental extrait (ADNe).

3. Quantification de l’ADN

  1. Ajouter 1 μL d’ADN extrait avec 200 μL de colorant fluorescent dans un tube de 0,5 mL et bien mélanger par pipetage.
  2. Enveloppez immédiatement le tube avec du papier d’aluminium pour que la lumière ne puisse pas pénétrer et incubez à température ambiante pendant 5 min.
  3. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre dans UN mode de concentration d’ADN en suivant le protocole du fabricant.

4. Détection de l’ARNr 16S, du pmoA1 , du pmoA2 , du mmoX et du mcrA par PCR conventionnelle

  1. Avant d’effectuer une PCR conventionnelle (cPCR), décongelez tous les échantillons et réactifs dans un seau à glace.
  2. Diluer tous les échantillons d’ADNe extraits à 10 ng/μL.
    REMARQUE : Une liste d’amorces est donnée dans le tableau 1.
  3. Préparez un mélange réactionnel cPCR de 25 μL pour chaque échantillon, y compris 12,5 μL de 2 mélanges maîtres PCR, 0,5 μL d’amorces directes et inverses (10 μM) (voir le tableau 1 pour la liste des amorces), 1 μL d’ADNe de 10 ng/μL et 10,5 μL d’eau exempte de nucléases.
    REMARQUE : Préparez le mélange principal avec un volume suffisant pour un échantillon supplémentaire afin de minimiser les erreurs de pipetage.
  4. Effectuer une réaction cPCR selon le protocole consistant en une dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 45 s, d’extension à 72 °C pendant 30 s et d’extension finale à 72 °C pendant 5 m, avec une température de recuit variable pour différentes amorces (voir le tableau 1 pour les températures de recuit des différentes amorces utilisées pour différents gènes).
    REMARQUE : Pour le gène mcrA , les amorces ML ont montré la bande souhaitée en utilisant un taux de rampe lent de 0,1 °C/s entre les étapes de recuit et d’extension pour les cinq premiers cycles32.
  5. Visualisez les produits de cPCR dans un gel d’agarose précoloré au bromure d’éthidium (EtBr).
    REMARQUE : Utilisez du gel d’agarose à 2,5 % pour une échelle de 50 pb et du gel à 0,9 % pour une échelle de 1 kb. Utilisez 1 tampon TAE pour un gel d’agarose à 2,5 % et un tampon TAE 0,5 pour un gel d’agarose à 0,9 %.

5. Détection de pmoA1, pmoA2, mmoX et mcrA par PCR quantitative en temps réel

REMARQUE : L’abondance de gènes ciblant les méthanogènes et les méthanotrophes, tels que l’abondance de pmoA1, pmoA2, mmoX et mcrA , a été observée par qPCR à l’aide d’un système de PCR en temps réel.

  1. Préparez les étalons pour chaque gène séparément afin d’obtenir la courbe standard pour chaque gène.
    1. Amplifiez le gène ciblé avec la cPCR, en utilisant les échantillons qui ont produit la bande la plus brillante lors de l’électrophorèse sur gel de chaque gène. Suivez la méthode et les amorces décrites à la rubrique 4.
    2. Purifier les produits amplifiés à l’aide d’un kit d’extraction de gel et mesurer la concentration d’ADN selon la méthode décrite au paragraphe 3 et les conserver à -20 °C.
      REMARQUE : Aliquote les étalons purifiés dans des tubes séparés pour une utilisation ultérieure.
    3. Calculez les copies de gènes à partir de la concentration d’ADN mesurée à l’aide du site Web de calcul du nombre de copies pour la qPCR.
    4. Diluer le nombre de copies calculé de l’étalon avec de l’eau exempte de nucléases pour préparer chaque étalon, allant de 108 à 102 copies/μL, avant d’effectuer la qPCR.
    5. Préparez la courbe standard à l’aide de trois répétitions de chaque numéro de copie, y compris un témoin négatif (NTC, pas d’ADN matrice).
      REMARQUE : La valeur R2 de chaque courbe standard était supérieure à 0,99.
  2. Préparez un mélange réactionnel qPCR de 20 μL pour tous les échantillons, les étalons et le NTC. Effectuez l’analyse qPCR en trois exemplaires pour tous les échantillons.
    1. Placez tous les composants de la réaction, y compris le mélange maître qPCR, les amorces, l’eau sans nucléases, les étalons et les échantillons, sur un support à glace avant de commencer.
    2. Préparez un mélange réactionnel qPCR de 20 μL pour chaque échantillon, étalon et NTC, contenant 10 μL de mélange maître SYBR Green, 0,5 μL de chaque amorce directe et inverse de 10 μM, 8 μL d’eau exempte de nucléases et 1 μL d’ADN matrice de 10 ng/μL, d’eau étalon ou d’eau DI respectivement.
      REMARQUE : Utilisez les ensembles d’amorces qui ont montré qu’ils donnaient des résultats optimaux pour les gènes pmoA1 et mcrA dans la PCR conventionnelle pour la qPCR (voir Tableau 1). Pour améliorer la précision, analysez chaque échantillon en trois exemplaires. Les étapes suivantes constituent une méthode efficace pour préparer des échantillons triples d’un volume combiné de 60 μL par échantillon.
      1. Préparez le mélange réactionnel pour combiner le mélange maître, les amorces avant et arrière pour le gène spécifique et de l’eau sans nucléases dans un tube de 2 ml, à l’exception de l’ADN matrice.
        REMARQUE : Préparez le volume du mélange réactionnel en tenant compte de l’erreur de pipetage. Par exemple, s’il y a 24 échantillons et 8 étalons, calculez le volume total pour 33 réactions au lieu de 32 réactions afin de minimiser les erreurs de pipetage. Dans ce cas, le volume total requis pour les réactions triples serait le suivant : 990 μL de mélange maître (33 échantillons x 3 répétitions x 10 μL), 49,5 μL d’amorces directes (33 échantillons x 3 répétitions x 0,5 μL), 49,5 μL d’amorces inverses (33 échantillons x 3 répétitions x 0,5 μL) et 792 μL d’eau exempte de nucléases (33 échantillons x 3 répétitions x 8 μL).
      2. Préparer les tubes PCR en fonction du nombre d’échantillons et d’étalons.
      3. Versez 57 μL du mélange réactionnel préparé dans chaque tube PCR.
        REMARQUE : Pour effectuer une qPCR pour chaque échantillon en trois exemplaires, préparez un volume total de mélange réactionnel de 57 μL par échantillon (à l’exclusion de l’ADN matrice, de l’étalon ou de l’eau). Ce volume sera divisé à parts égales en trois puits pour un échantillon, avec 19 μL alloués à chaque puits.
      4. Ajoutez 3 μL d’ADN matrice, d’eau standard ou d’eau sans nucléases dans chaque tube et mélangez en tapotant doucement le fond du tube.
        REMARQUE : Le volume total du mélange réactionnel préparé pour un échantillon serait maintenant de 60 μL dans chaque tube.
    3. Aliquote 20 μL du mélange réactionnel préparé de chaque tube dans les puits désignés d’une plaque qPCR à 96 puits. Scellez la plaque PCR avec un film d’étanchéité PCR adhésif à l’aide d’un applicateur.
    4. Centrifugez la plaque scellée à 1 000 × g pendant 1 min pour assurer un bon mélange afin d’éliminer toute bulle dans les puits.
  3. Placez la plaque PCR dans le thermocycleur. Allumez la machine qPCR, puis ouvrez le logiciel associé pour configurer le protocole.
    1. Configurez le protocole conformément aux directives du master mix qPCR. Utilisez le protocole suivant : 95 °C pendant 10 min, suivi de 95 °C pendant 15 s et d’un pas d’extension à 72 °C pendant 30 s. Effectuez l’étape de recuit à la température de recuit spécifiée pour les apprêts correspondants dans le tableau 1 pendant 45 s. Effectuez toutes les exécutions qPCR pendant 35 cycles.
    2. Configurez la plaque qPCR à 96 puits avec des étalons et des NTC dans la même configuration que la plaque contenant l’échantillon.
  4. Utilisez la méthode de la courbe standard de quantification absolue pour quantifier le produit amplifié et le nombre de copies de gènes dans chaque échantillon33.

6. Visualisation des gènes du cycle du méthane sur la carte des zones humides côtières du sud du Texas

  1. Ouvrez le logiciel de système d’information géographique (SIG) ArcGIS Pro et enregistrez le fichier de projet sous le nom de Zone d’étude dans le dossier spécifié sur l’ordinateur.
  2. Cliquez sur la carte en haut à gauche | Fond de carte et sélectionnez Terrain avec étiquettes comme fond de carte.
  3. Cliquez sur Localiser | Recherchez et lorsque la barre de recherche s’ouvre, localisez la zone d’étude en tapant le nom de la zone ; La zone apparaîtra.
  4. Dessinez la zone spécifique à l’aide du géoréférencement.
    1. Cliquez sur Voir | Volet Catalogue à partir de la couche supérieure.
    2. Double-cliquez sur Dossier dans le catalogue | Nom du fichier.
    3. Faites un clic droit sur le fichier de géodatabase (.gdb), puis cliquez sur Nouveau | Les options Classe d’entités et Créer une classe d’entités s’affichent.
    4. Tapez la case Nom et Alias et cliquez sur Terminer en bas.
    5. Cliquez sur Voir | Contenu de la procédure. Le nom de l’alias s’affiche dans le volet Contenu.
    6. Cliquez sur Modifier à partir du calque supérieur | Créer. La fenêtre Create Features (Créer des entités ) s’ouvre. Double-cliquez sur le volet Alias dans Créer des fonctionnalités et les options de retour d’outil Configurer apparaîtront.
    7. Sélectionnez Lignes, puis esquissez des lignes sur la carte pour créer une limite extérieure de la zone d’étude. Double-cliquez sur la carte lorsque vous avez terminé.
  5. Réduisez le logiciel SIG, puis ouvrez une feuille de calcul. Tapez le nom de l’échantillon dans la première colonne, entrez la latitude dans la deuxième colonne et la longitude dans la troisième colonne. Utilisez les quatre colonnes suivantes pour les données qPCR de pmoA1, pmoA2, mmoX et mcrA.
  6. Enregistrez le fichier au format CSV dans n’importe quel dossier spécifique de l’ordinateur.
  7. Ouvrez à nouveau le logiciel SIG et cliquez sur Ajouter des données | Données ponctuelles XY.
  8. Sélectionnez le fichier CSV dans le dossier de l’ordinateur dans la zone Table d’entrée . Renommez le nom du fichier dans la classe d’entités en sortie, puis cliquez sur Exécuter pour afficher les points d’échantillonnage sur la carte.
  9. Cliquez sur la barre de recherche virtuelle en haut et recherchez Krigeage.
  10. Sélectionnez le fichier de la station d’échantillonnage, puis pmoA1.
  11. Cliquez sur l’onglet Environnement | sélectionnez l’abscisse curviligne d’échantillonnage dans Calque et masque | cliquez sur Exécuter.
  12. Suivez les protocoles mentionnés aux étapes 6.9, 6.10 et 6.11 pour créer du krigeage pour pmoA2, mmoX et mcrA pour toute la zone d’étude.
  13. Créez une mise en page de la carte.
    1. Cliquez sur Insérer à partir de la couche supérieure | Nouvelle mise en page, puis sélectionnez ANSI - Paysage.
    2. Cliquez sur le cadre de la carte, sélectionnez la carte avec le krigeage et placez toutes les cartes dans la mise en page en dessinant un rectangle. Cela rendra la carte visible dans la mise en page.
    3. Sélectionnez la flèche vers le nord et placez-la dans la mise en page pour indiquer la direction du nord.
    4. Sélectionnez Barre d’échelle pour afficher l’échelle de la zone sur la carte.
    5. Cliquez sur Légende pour afficher les légendes, puis placez-la dans la mise en page.
    6. Cliquez sur Grille et sélectionnez l’une des options de réticule noir. Cela créera la grille avec la latitude et la longitude et l’affichera dans le volet de contenu avec l’étiquette Noir Horizontal Étiquette Graticule.
    7. Double-cliquez sur Étiquette horizontale noire Graticule, puis sélectionnez Composants. Cliquez sur les coches 1 et la grille, puis supprimez ces composants en cliquant sur le signe de croix à leur droite.
  14. Cliquez sur Partager dans le calque supérieur, puis cliquez sur Exporter la mise en page. Sélectionnez le type de fichier PDF, enregistrez le fichier sur l’ordinateur à l’aide de la zone Nom, définissez la résolution verticale sur 500 DPI et cliquez sur Exporter pour créer le fichier PDF de la carte.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour comprendre la distribution et l’abondance des gènes liés au cycle CH4 (mcrA, pmoA1, pmoA2 et mmoX) dans les zones humides côtières du sud du Texas, l’ADNe extrait de chaque échantillon a été analysé par cPCR et qPCR. Des amorces universelles pour chaque biomarqueur ont été sélectionnées pour exécuter la cPCR à partir d’études antérieures (Tableau 1)22,34,35,36,37, et des modifications ont été apportées pour optimiser les températures et les concentratio...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les zones humides côtières sont reconnues comme contribuant de manière importante au méthane atmosphérique, un important gaz à effet de serre40. Bien qu’il y ait eu des études sur les flux de méthane et les méthanogènes dans les zones humides 41,42,43, on sait peu de choses sur la façon dont les méthanotrophes fonctionnent dans différents environnements ou selon diverses pratiques de gestion, en particulier dans les zones humides avec des niveaux d’eau ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants envers les membres de C-REAL pour leur aide dans l’observation sur le terrain et les analyses en laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR 0,2 mLThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
Tubes PCR 0,5 mLPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 &mu ; Embouts LThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Pointe de pipette Racked or Reload System Tips Natural ; 10&mu ; L ; | Fisher Scientific
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