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Article de méthode

Administration efficace et sûre de gènes dans le rein de souris par injection rétrograde lente de vecteurs viraux adéno-associés

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DOI :

10.3791/67716

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1 août 2025

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1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

Dans cet article

Résumé

Ce rapport détaille la méthode d’injection localisée des vecteurs AAV via le bassinet du rein pour un transfert de gènes efficace et sûr dans le rein de souris.

Résumé

La mise au point d’outils et de méthodes in vivo efficaces pour l’administration de gènes au rein est cruciale pour faire progresser la recherche fondamentale sur les reins et la thérapie génique pour les maladies rénales. En outre, la prise de conscience croissante des maladies rénales monogéniques, stimulée par des tests génétiques avancés, souligne le potentiel de la thérapie génique pour traiter et même guérir les maladies rénales génétiques difficiles à traiter. À cet égard, les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) ont suscité une attention croissante en tant que plate-forme robuste pour l’administration de gènes in vivo ; cependant, la méthode la plus efficace et la plus sûre pour l’administration de gènes médiés par un vecteur AAV à chaque type de cellule thérapeutiquement pertinent dans le rein n’a pas encore été entièrement établie. Ici, la méthode d’injection rétrograde lente du bassinet du rein (RP) des vecteurs AAV est détaillée, et son fort potentiel de transduction des reins de souris est démontré lorsqu’il est utilisé avec des capsides AAV correctement sélectionnées. De plus, cette méthode s’est avérée efficace non seulement avec les vecteurs AAV purifiés par ultracentrifugation standard au chlorure de césium (CsCl AAV), mais aussi avec les mini-préparations de vecteurs AAV ultrafiltrés par centrifugation (CU AAV), qui peuvent être préparés rapidement et simplement à l’aide de techniques qui ne nécessitent pas d’expertise spécialisée en matière de vecteurs AAV. À titre d’exemple, cette étude démontre que l’injection lente de RP des vecteurs CsCl et CU AAV-KP3 entraîne une transduction robuste des tubules proximaux dans le rein de souris sans lésion tissulaire apparente, contrairement aux approches hydrodynamiques précédemment rapportées qui entraînent inévitablement des lésions tissulaires. Ainsi, cette étude souligne que l’injection lente de RP rétrograde de certains vecteurs dérivés de la capside AAV est une méthode efficace et sûre pour l’administration de gènes au rein. Cette méthode sera applicable à un large éventail de recherches sur les reins, y compris les études de thérapie génique. L’utilisation de mini-préparations vectorielles CU AAV augmentera considérablement le débit et améliorera le temps et la rentabilité nécessaires pour générer des données préliminaires et obtenir des informations cruciales.

Introduction

Des méthodes efficaces et sûres d’administration de gènes dans le rein chez les petits et les grands animaux de laboratoire offrent des opportunités cruciales pour faire progresser la recherche fondamentale sur les reins et explorer des approches thérapeutiques innovantes. La mise en place de telles méthodes est particulièrement pertinente pour la thérapie génique pour diverses maladies rénales. Les progrès récents des tests génétiques cliniques ont révélé une prévalence plus élevée de troubles rénaux monogéniques que ce qui avait été estimé précédemment, affectant environ 30 % des patients atteints d’insuffisance rénale chronique (IRC)1. L’IRC se caractérise par des lésions rénales progressives, conduisant finalement à une insuffisance rénale sans traitement modificateur de la maladie vraiment efficace. L’hémodialyse et la transplantation rénale sont des traitements actuellement disponibles ; cependant, ils ont des limites qui nuisent considérablement à la qualité de vie des patients atteints d’IRC2. Ainsi, la thérapie génique, une approche puissante cliniquement prouvée pour traiter les maladies génétiques, a suscité beaucoup d’attention ces dernières années en tant que nouvelle voie pour le traitement efficace des maladies rénales génétiques conduisant à l’IRC 3,4,5,6. Cette approche peut s’attaquer directement aux causes profondes des maladies et potentiellement offrir un remède.

Malgré les progrès constants dans le domaine, l’administration de gènes au rein reste un défi important dans la recherche et les milieux thérapeutiques. Il est difficile de cibler efficacement les cellules rénales avec des gènes thérapeutiques en raison de la structure complexe de l’organe et des barrières physiologiques uniques, y compris la barrière de filtration glomérulaire, qui est composée de cellules endothéliales glomérulaires, de la membrane basale glomérulaire et des processus du pied podocytaire. Diverses stratégies ont été explorées pour l’administration de gènes ciblant les reins, notamment l’injection directe du cortex rénal (RC) 7,8, l’injection de l’artère rénale (AR) 9,10,11, l’injection de veine rénale (RV) 12,13,14, l’injection du bassinet du rein (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 et l’injection intraveineuse (IV) 19,26,27,28,29,30 de vecteurs d’administration de gènes viraux ou non viraux, ainsi que l’administration d’acides nucléiques par ultrasons et par microbulles 31,32. Ces approches ont démontré des efficacités de transduction variables ou des résultats fonctionnels, produisant souvent des résultats incohérents qui sont difficiles à concilier (examiné dans les références 3,33,34,35). L’administration de gènes au rein est encore sous-développée, ce qui rend difficiles les comparaisons directes entre les systèmes vectoriels et les méthodologies. Cependant, les méthodes d’administration localisées, qui facilitent l’administration d’agents hautement concentrés directement dans le rein, ont généralement donné de meilleurs résultats que l’administration IV systémique. En outre, les vecteurs de virus adéno-associés (AAV), avec leurs profils d’innocuité robustes et leurs antécédents éprouvés en matière de traduction clinique36,37, ont été les plus étudiés et sont considérés comme le premier choix pour le transfert de gènes rénaux.

Les sérotypes AAV courants et les capsides modifiées ont démontré une transduction efficace des cellules mésangiales et mésenchymateuses dans le rein après injection IV chez la souris 28,30,38. Notamment, des études récentes ont montré que l’administration IV d’AAV9 peut effectivement transduire les podocytes dans des modèles murins du syndrome néphrotique et du syndrome d’Alport, bien que cet effet ne soit pas observé dans les reins sains38,39, et que l’administration IV d’une capside AAV2 modifiée peut cibler exclusivement les cellules endothéliales glomérulaires dans les reins sains et enflammés chez la souris40. Historiquement, les tubules rénaux ont été difficiles à transduire, par voie IV. Cependant, il a récemment été découvert que l’injection RP de certaines capsides AAV, telles que AAV-KP141, peut réaliser la transduction des tubules proximaux à des niveaux plus d’un ordre de grandeur supérieurs à ceux atteints avec la capside AAV9de référence 38. Bien que d’autres améliorations soient nécessaires, ces avancées ouvrent de nouvelles voies pour la recherche fondamentale sur les reins et la thérapie génique, offrant des opportunités qui étaient auparavant inaccessibles.

Dans le présent article, l’injection lente de RP rétrograde de vecteurs AAV est décrite comme une méthode efficace et sûre pour l’administration de gènes au rein de souris38. À titre d’exemple représentatif de cette technique, AAV-KP3 a été choisi comme capside exemplaire en raison de la découverte qu’il s’agit de l’une des six capsides (c’est-à-dire AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 et AAV2.7m844) qui ont montré une meilleure transduction rénale par rapport à AAV9 après injection de RP chez la souris38. Notamment, les tissus rénaux rétrogrades lents injectés de RP n’ont montré aucune lésion tissulaire apparente contrairement à ceux traités par des approches hydrodynamiques précédemment rapportés23,24. De plus, les vecteurs miniprepAAV 45 purifiés grossièrement par ultrafiltration centrifuge simple et rapide (c’est-à-dire les vecteurs AAV CU) ont atteint des niveaux de transduction rénale d’environ 70 % de ceux pouvant être atteints par des préparations de vecteurs AAV purifiés par l’ultracentrifugation à gradient standard de chlorure de césium (CsCl) (c’est-à-dire les vecteurs AAV CsCl) lorsqu’ils sont administrés au même titre du génome du vecteur. Ainsi, la méthode et les observations présentées ici constituent une ressource précieuse et pratique pour les chercheurs qui cherchent à améliorer l’administration de gènes au rein chez la souris et chez des animaux potentiellement plus grands.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Oregon Health & Science University (OHSU) et ont été effectuées conformément aux directives pour les soins aux animaux de l’OHSU. Dans cette étude, des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été utilisées. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Production d’un vecteur AAV par transfection de plasmide sans adénovirus

  1. Cultivez 293 cellules de rein embryonnaire humain (HEK) dans le milieu modifié Eagle (DMEM) de Dulbecco à haute teneur en glucose (4,5 g/L) complétée par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de pénicilline et de streptomycine et 1 mM de L-glutamine, dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
  2. Le jour -2 (48 h avant la transfection), déposer 4 x 106 cellules HEK 293 par fiole T225 dans 40 mL du milieu de culture comme décrit à l’étape 1.1. Cela atteint ~95 % de confluence le jour 0.
    REMARQUE : L’échelle de culture peut être ajustée en fonction de l’application. Pour un miniprep AAV (étape 2), préparez un nombre approprié de flacons en fonction du titre cible et de la concentration du vecteur, en tenant compte du fait que le processus de purification entraîne généralement une perte de matière d’environ 50 %. Pour obtenir >6 x10 12 vg/mL de vecteurs AAV9 et AAV-KP3 pour l’injection de RP chez la souris à une dose de 3 x 1011 vg/souris dans une solution de vecteur de 50 μL, il est recommandé d’utiliser au moins 2 flacons. Pour la production de vecteurs AAV à plus grande échelle, comme celle des vecteurs AAV purifiés par gradient de densité CsCl (AAV CsCl), 25 flacons ou plus sont généralement utilisés.
  3. Jour 0 : Transfection de l’ADN plasmidique
    1. Préparation à la transfection
      1. Assurez-vous que les cellules ont atteint une confluence de ~95 %.
      2. Réchauffez le DMEM complété par un mélange de pénicilline et de streptomycine à 1 % et 1 mM de L-glutamine, mais sans FBS (c’est-à-dire un milieu sans sérum) dans un bain-marie à 37 °C.
      3. Laissez la solution linéaire de polyéthylénimine (PEI) atteindre la température ambiante.
    2. Préparation d’un mélange d’ADN plasmidique
      1. Mélangez les plasmides (15 μg chacun de pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap et pHelper) dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans CaCl2 ou MgCl2 dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL. La quantité totale d’ADN est de 45 μg/flacon.
        REMARQUE : Les volumes de solution d’ADN plasmidique peuvent être ignorés s’ils sont minimes. Cependant, il est conseillé d’ajuster le volume si le volume total de la solution est de ≥225 μL. Les séquences des plasmides utilisés dans cette étude sont disponibles dans le fichier supplémentaire 1.
    3. Transfection de l’Île-du-Prince-Édouard
      1. Ajouter 90 μL de solution d’IPE (1 mg/mL) à 1 mL de PBS et mélanger avec le mélange PBS-ADN plasmidique (préparé comme ci-dessus) dans un tube de polypropylène de 50 mL. Le volume final est d’environ 2 mL (5 % du volume du milieu de culture).
      2. Vortex les tubes pendant 5 s et faites tourner brièvement les tubes avec une centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond des tubes.
    4. Conserver à température ambiante pendant 15 min pour former des complexes plasmidique ADN-PEI.
    5. Une fois l’incubation de 15 minutes terminée, ajouter les 40 mL de milieu sans sérum préchauffé préparé à l’étape 1.3.1.2 aux complexes plasmidique ADN-PEI. Le volume est d’environ 42 ml.
    6. Remplacer le milieu de culture de la fiole T225 par des complexes d’ADN plasmidique-PEI contenant un milieu exempt de sérum décrit à l’étape 1.3.4.
    7. Maintenez les cellules dans ce milieu de transfection jusqu’à la récolte du jour 5 (aucun changement de milieu n’est nécessaire).
    8. Le jour 2, observez les cellules transfectées avec le plasmide exprimant des protéines fluorescentes (par exemple, pAAV-CAG-tdTomato) sous un microscope à fluorescence inversée pour évaluer l’efficacité de la transfection du plasmide.
      REMARQUE : Les conditions décrites ci-dessus entraînent généralement des efficacités de transfection supérieures à 70 %. Certains changements morphologiques (p. ex., élongation cellulaire) peuvent être observés, probablement en raison de l’environnement exempt de sérum.
    9. Les jours 3 à 5, continuez à cultiver les cellules transfectées dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
    10. Le jour 5, prélever les cellules et le milieu contenant le virus dans un tube de polypropylène de 50 ml.
    11. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Purification par ultrafiltration centrifuge (CU) de vecteurs AAV (AAV miniprep)

  1. Décongeler l’échantillon congelé de l’étape 1.3.11 dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Conservez 1 mL de lysat brut pour le dosage par transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 1).
  3. Ajouter 80 μL de chlorure de magnésium 1M (MgCl2, concentration finale de 2 mM), 160 μL d’hydroxyde de sodium 0,1M (NaOH, concentration finale de 0,4 mM) et 16 μL d’endonucléase de Serratia marcescens (concentration finale de 100 unités/mL) dans un tube de 50 mL. Incuber à 37 °C pendant 1 h. Agiter l’échantillon toutes les 15 minutes pendant l’incubation.
  4. Prélever l’échantillon traité à l’endonucléase de Serratia marcescens dans un flacon à centrifuger de 250 mL et faire centrifuger à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
  5. Transvasez le surnageant dans un tube en polypropylène de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL.
  6. Filtrez le surnageant pour éliminer les débris à l’aide d’un filtre à seringue en PVDF de 0,45 μm. Conservez 1 mL d’échantillon filtré à 0,45 μm pour le dosage par transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 2).
  7. Ajouter 10 mL d’eau de qualité moléculaire dans un tube d’ultrafiltration centrifuge à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa et centrifuger à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Retirez le flux.
  8. Ajouter 15 mL de sorbitol à 5 % dans du PBS dans le tube d’ultrafiltration centrifuge et centrifuger à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Retirez le flux.
  9. Ajouter jusqu’à 15 mL d’échantillon filtré à 0,45 μm comme décrit à l’étape 2.6 et centrifuger à 2 000 x g à 4 °C pendant 15 min pour obtenir la concentration jusqu’à ce que le volume cible d’environ 500 μL soit atteint. Conservez 1 mL d’écoulement continu pour le dosage par transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 3).
    REMARQUE : Avant chaque centrifugation, remettre le rétentat en suspension à l’aide d’une pipette pour perturber le gradient de concentration. Ne touchez pas la membrane avec la pointe de la pipette. Si le volume cible n’est pas atteint après 15 minutes de centrifugation, étendez la centrifugation au besoin en ajustant la durée en fonction du volume restant dans le tube.
  10. Répétez l’étape 2.9 jusqu’à ce que l’échantillon entier soit filtré, atteignant le volume cible d’environ 500 μL. Gardez 1 mL de l’écoulement continu de la première et de la deuxième itération de l’étape 2.10 de côté pour le test de transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 4 et fraction 5).
    REMARQUE : Un seul tube d’ultrafiltration centrifuge peut être utilisé pour traiter des échantillons obtenus à partir de deux flacons ou plus.
  11. Ajouter 15 mL de sorbitol à 5 % dans du PBS et centrifuger à 2 000 x g à 4 °C pendant 15 min jusqu’à ce que le volume cible d’environ 500 μL soit atteint. Garder 1 mL de liquide à écoulement continu pour le dosage par transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 6).
  12. Répétez l’étape 2.11 (utilisée comme fraction 7).
    REMARQUE : Si des titres AAV plus élevés sont nécessaires pour les expériences en aval, le volume cible final peut être encore réduit à 150 μL.
  13. Transférez le vecteur AAV ultrafiltré dans un tube à bouchon à vis de 2 ml avec un joint torique. Conservez 10 μL de vecteur AAV ultrafiltré pour le dosage par transfert de points d’ADN (utilisé comme fraction 8).
  14. Déterminer les titres d’AAV par transfert de points d’ADN, comme décrit précédemment46.
    REMARQUE : Les vecteurs purifiés en CU (CU AAV) contiennent des niveaux plus élevés de contamination par la capside vide et d’impuretés dérivées de la cellule hôte que les vecteurs purifiés par CsCl (CsCl AAV). Ces facteurs peuvent avoir un impact sur l’efficacité de la transduction et les réponses immunitaires, ce qui nécessite un examen attentif dans l’interprétation des données.

3. Purification du gradient de densité CsCl des vecteurs AAV

  1. Décongeler l’échantillon congelé de l’étape 1.3.11 dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Centrifuger à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min pour éliminer les débris de la cellule.
  3. Prélever les vecteurs AAV du surnageant et du précipité dans le surnageant en ajoutant du polyéthylène glycol 8000 (PEG, concentration finale de 8 %) et du chlorure de sodium (concentration finale de 500 mM).
  4. Incuber sur glace pendant 3 h.
  5. Centrifuger à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min pour obtenir les granulés contenant de l’AAV.
  6. Retirer le surnageant et remettre les granulés en suspension avec 10 ml de tampon de remise en suspension contenant Sarkosyl (50 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 1 % de Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Transférez la suspension de granulés dans un tube de polypropylène de 15 ml et maintenez-la à 4 °C pendant la nuit.
  8. Le lendemain, traitez la suspension de pastilles avec de l’endonucléase Serratia marcescens (concentration finale de 200 unités/mL) et du MgCl2 (concentration finale de 2 mM).
  9. Incuber à 37 °C pendant 1h.
  10. Centrifugeuse à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
  11. Prélever le surnageant et ajouter du chlorure de césium (CsCl, concentration finale de l’indice de réfraction (RI) = 1,3710 +/- 0,0005) et de l’EDTA (concentration finale de 20 mM).
  12. Chargez l’échantillon dans un tube d’ultracentrifugation de 29,9 mL et ajoutez la solution de remplissage (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) jusqu’à ce qu’il soit plein.
  13. Centrifugeuse à 41 000 x g à 12 °C pendant 22 h.
  14. Percez des trous dans le fond et le côté du tube de l’ultracentrifugeuse pour recueillir un total de 15 fractions de 2 ml chacune.
  15. Utilisez 10 μL de chaque fraction pour vérifier l’IR et effectuer le test de transfert de points d’ADN46.
  16. Sur la base des résultats des tests RI et DNA dot blot, déterminez les 5 meilleures fractions qui contiennent des vecteurs AAV.
  17. Combinez les 5 meilleures fractions (total d’environ 10 ml) et ajustez l’IR à 1,3710 +/- 0,0005.
  18. Chargez l’échantillon dans un tube d’ultracentrifugation de 11,2 ml et ajoutez la solution de garniture jusqu’à ce qu’elle soit pleine.
  19. Centrifugeuse à 65 000 x g à 12 °C pendant 12 h.
  20. Percez des trous dans le fond et le côté du tube d’ultracentrifugation de 11,2 ml pour recueillir un total de 18 fractions de 0,5 ml chacune.
  21. Utilisez 10 μL de chaque fraction pour vérifier l’IR et effectuer le test de transfert de points d’ADN46.
  22. Sur la base des résultats des tests RI et DNA dot blot, déterminez les 6 meilleures fractions contenant des vecteurs AAV.
  23. Combinez les 6 meilleures fractions (total d’environ 3 ml) et chargez-les dans une cassette de dialyse.
  24. Faites flotter la cassette de dialyse dans 1,3 L de tampon de dialyse (tampon PBS complété par 0,001 % de tensioactif non ionique) avec une barre d’agitation pendant 2 h pour éliminer le CsCl.
  25. Répétez l’étape 3.24 deux fois (total 6 h de dialyse).
  26. Transférer la cassette à 500 mL de sorbitol à 5 % dans un tampon PBS complété par un tensioactif à 0,001 % pendant 2 h pour le remplacement du tampon.
  27. Prélever l’échantillon de la cassette de dialyse à l’aide d’une seringue et filtrer l’échantillon collecté à l’aide d’un filtre à seringue en PVDF de 0,22 μm.
  28. Détermination des titres AAV par un dosage quantitatif par transfert de points46.

4. Évaluation de la qualité des préparations de vecteurs AAV par SDS-PAGE suivie d’une coloration à l’argent

  1. Mélangez des préparations vectorielles, 1 x 1010 vg pour les vecteurs CsCl AAV, et 1 x 109 et 1 x 1010 vg pour les vecteurs CU AAV, avec 6x tampon Laemmli dans un total de 18 μL (préparation vectorielle : 6x Laemmli = 15:3) et chauffez-les à 100 °C pendant 5 min.
  2. Chargez les préparations de vecteurs AAV traitées thermiquement sur un gel SDS-PAGE à 7,5 % et électrophorèse les échantillons à 20 mA à l’aide d’un tampon courant de gel Tris-glycine-SDS.
  3. Retirez le gel de la cassette de gel, rincez-le à l’eau ultra-pure et tachez-le à l’aide d’un kit de coloration à l’argent selon les instructions du fabricant.
  4. Incuber le gel chargé de vecteurs AAV CsCl dans la solution de développement pendant 7 min, tandis que l’incubation du gel chargé de vecteurs AAV CU pendant 2 min pour éviter la saturation du signal.
    REMARQUE : Les préparations de vecteurs AAV CU contiennent des niveaux plus élevés d’impuretés protéiques que les vecteurs AAV CsCl. Par conséquent, les gels chargés avec des vecteurs CsCl AAV et CU AAV ont été séparés après le fonctionnement du gel et colorés à l’argent séparément pour éviter la saturation du signal en raison de la haute sensibilité de la méthode de coloration.

5. Identification des protéines AAV VP dans les préparations de vecteurs AAV CU par western blot

  1. Mélangez 1 x 109 vg de préparations vectorielles CU AAV avec 6 tampons Laemmli pour un total de 18 μL (préparation vectorielle : 6 x Laemmli = 15:3) et chauffez-les à 100 °C pendant 5 min.
  2. Chargez les préparations de vecteurs AAV traitées thermiquement sur un gel SDS-PAGE à 7,5 % et électrophorèse les échantillons à 20 mA à l’aide d’un tampon courant de gel Tris-glycine-SDS.
  3. Électrotransfert des protéines dans le gel sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF), activée dans du méthanol, à l’aide d’un système de transfert semi-sec.
  4. Bloquez la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans 1 solution saline tamponnée au Tris avec Tween 20 (TBST) à température ambiante pendant 1 h.
  5. Incuber la membrane bloquée avec une solution d’anticorps primaires (anticorps polyclonaux anti-VP de lapin, dilué à 1:1000 avec du lait écrémé à 5 % dans 1x TBST) à 4 °C pendant la nuit.
  6. Lavez la membrane avec 1x TBST pendant 10 min, 3 fois.
  7. Incuber la membrane avec une solution d’anticorps secondaires (anticorps IgG de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort, dilué à 1:5000 avec du lait écrémé à 5 % dans 1x TBST) à température ambiante pendant 1 h.
  8. Lavez la membrane avec 1x TBST pendant 10 min, 3 fois.
  9. Visualisez les signaux sur la membrane à l’aide d’un système d’imagerie par western blot.

6. Injection du bassinet du rein (RP)

  1. Configuration préopératoire et anesthésie
    1. Mesurez le poids corporel de chaque souris dans un bécher en plastique sur une balance précise à 0,1 g.
    2. Administrer du méloxicam (5 mg/kg) par voie sous-cutanée en fonction du poids corporel pour fournir une analgésie préchirurgicale.
    3. Diluez la solution de vecteur AAV à une concentration de 6,0 x 1012 vg/mL avec 5 % de sorbitol dans du PBS et conservez-la sur de la glace.
      REMARQUE : Préparez une solution AAV de plus de 40 μL que le volume total d’injection (50 μL x nombre de souris à injecter) pour tenir compte de l’espace mort dans une seringue en verre étanche au gaz et un tube en polyéthylène PE-10.
    4. Pliez et cassez uniquement la pointe de l’aiguille d’une aiguille de 30 G à l’aide d’un porte-aiguille.
    5. À l’aide d’un stéréomicroscope, connectez la pointe de l’aiguille 30 G, les 15 cm du tube PE-10, une aiguille 30 G et une seringue en verre étanche aux gaz dans cet ordre à partir de la pointe (Figure 1D).
    6. Placez la seringue en verre étanche au gaz connectée sur une pompe à seringue à perfusion.
    7. Aspirer 90 μL de solution de vecteur AAV préparée à l’étape 6.1.3 dans la seringue en verre étanche au gaz à l’aide d’une pompe à seringue à perfusion.
    8. Réglez le mode d’infusion du pousse-seringue comme suit : le volume cible de 50 μL et un débit de 50 μL/min.
    9. Placez une souris dans une chambre en plastique remplie d’isoflurane à 4 % administrée dans 100 % d’oxygène à un débit de 1,5 à 3,0 L/min jusqu’à ce qu’elle soit complètement anesthésiée.
    10. Placez le museau de la souris dans un cône nasal avec un débit d’isoflurane de 1,5 % à 3,0 %. Surveillez la profondeur de l’anesthésie par réflexe de pincement des orteils tout au long de l’intervention chirurgicale.
    11. Couvrez les yeux avec une pommade ophtalmique à l’aide d’un applicateur à bout de coton pour prévenir la dessiccation de la cornée.
    12. Retirez la fourrure du côté arrière gauche de la souris à l’aide d’un dépilatoire à l’aide d’un applicateur à bout de coton.
      REMARQUE : La crème dépilatoire doit être complètement éliminée par rinçage pour éviter l’irritation de la peau.
    13. Placez la souris en position latérale sur un coussin chauffant en boucle fermée relié à une pompe de thérapie thermique pour maintenir la température corporelle à 37 °C (pas besoin de la fixer avec du ruban adhésif).
    14. Désinfectez la zone rasée avec trois applications alternées de povidone iodée et d’éthanol à 70 % à l’aide d’un applicateur à embout de coton dans un mouvement circulaire commençant au site d’incision.
    15. Couvrez la souris avec un champ chirurgical stérile.
  2. Injection de RP dans le rein gauche
    1. Pincez la peau avec une pince à tissus et faites une incision d’environ 1 cm à la couche de peau avec des ciseaux chirurgicaux au niveau de l’angle costo-vertébral à l’emplacement du rein gauche.
    2. Après avoir fait une incision cutanée, coupez la couche musculaire à la même longueur.
      REMARQUE : Si la longueur de l’incision est trop courte, le rein ne peut pas être exposé, et au lieu de cela, la rate, qui est de plus petite taille, peut être accidentellement exposée. D’autre part, si la longueur de l’incision est trop longue, le rein ne sera pas maintenu en place par l’incision elle-même et glissera continuellement dans l’abdomen par l’incision.
    3. Appuyez doucement sur l’abdomen avec les doigts, sans toucher directement le rein, de sorte que le rein soit exposé à travers le site d’incision (Figure 1A).
    4. Retirez au minimum la graisse environnante afin que le bassinet du rein soit visible sous la forme d’une petite zone blanche.
    5. Tout d’abord, clampez l’uretère à l’aide d’un clip de micro-vaisseau de type droit, puis l’artère rénale et la veine rénale avec un clip de micro-vaisseau de type incurvé.
      REMARQUE : La couleur du rein devient rouge foncé, confirmant le blocage réussi du flux sanguin à l’intérieur et à l’extérieur du rein (Figure 1B).
    6. Insérez l’aiguille de 30 G reliée au pousse-seringue à environ 3 mm dans la cavité pelvienne à l’aide d’une pince incurvée et commencez une injection de 50 μL de solution de vecteur AAV à l’aide d’une pompe à seringue à perfusion à un débit de 50 μL/min pendant 1 min (Figure 1C).
    7. Maintenez l’aiguille et la pince pendant 5 minutes pour augmenter l’exposition du rein injecté au vecteur AAV.
      REMARQUE : Le temps de logement approprié peut varier et dépendre des capsides AAV. Il a été démontré qu’un temps d’habitation de 5 min est suffisant pour la transduction avec le vecteur AAV-KP1 ou AAV-KP3.
    8. Une fois l’incubation de 5 minutes terminée, retirez les pinces.
      REMARQUE : La couleur du rein passe immédiatement du rouge foncé au rouge sang, confirmant le rétablissement du flux sanguin dans le rein.
    9. Retirez l’aiguille d’injection avec précaution et lentement, en plaçant simultanément un applicateur à bout de coton sur le site d’injection avec une pression. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement au point d’injection. L’application d’un patch hémostatique n’est pas nécessaire.
    10. Replacez doucement le rein dans la cavité péritonéale.
    11. Suturez la couche musculaire avec une suture résorbable 6-0 et la peau avec une suture monofilament 5-0.
    12. Administrer 1 mL de solution saline par voie sous-cutanée dans le dos des souris pour un soutien hydrique.
    13. Remplacez la pointe de l’aiguille de 30 G usagée par une aiguille nouvellement préparée, jetez l’aiguille de 30 G usagée conformément aux lignes directrices de l’établissement pour la gestion des déchets chimiques dangereux et chargez 50 μL de la solution de vecteur AAV à l’aide d’une pompe à seringue à perfusion pour l’administration à la souris suivante.
    14. Répétez les étapes 6.2.12 et 6.2.13 pour toutes les souris du groupe, à l’exception de la dernière, pour laquelle l’étape 6.2.13 n’est pas requise.
    15. Après avoir effectué toutes les injections prévues, jetez les aiguilles et les tubes de polyéthylène contaminés conformément aux lignes directrices de l’établissement sur la gestion des déchets chimiques dangereux.
  3. Suivi et soins postopératoires
    1. Administrer du méloxicam (5 mg/kg) par voie sous-cutanée dans le dos des souris pour l’analgésie postopératoire 24 h et 48 h après l’injection de RP.
    2. Administrer 1 mL de solution saline par voie sous-cutanée dans le dos des souris pour un soutien liquidien 24 h après l’injection de RP.
    3. Surveillez quotidiennement le poids corporel et l’apparence générale des souris injectées pendant 1 semaine postopératoire. En cas de perte de poids corporel de 10 %, administrez 1 ml de solution saline par voie sous-cutanée dans le dos des souris trois fois par semaine pendant une semaine. Si aucune amélioration n’est observée, les souris atteintes sont euthanasiées.

7. Prélèvement de tissus et cryosection

  1. Préparation de la solution de fixation et de cryoprotection.
    1. Tampon phosphate de 0,2 M (total 1 L)
      1. Préparez 800 ml d’eau ultrapure dans un bécher en verre de 1 L.
      2. Ajouter à la solution 6,4 g de phosphate de sodium monobasique (NaH2PO4) et 21,8 g de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4).
      3. Ajustez le pH à 7,4 avec de l’acide chlorhydrique.
      4. Remplissez d’eau ultra-pure jusqu’à 1 L.
      5. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
    2. Solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (40 mL au total)
      1. Mélanger 10 mL de PFA à 16 %, 20 mL de tampon phosphate 0,2M préparé à l’étape 7.1.1 et 10 mL d’eau ultrapure.
      2. Aliquote 10 mL dans un tube de polypropylène de 15 mL.
        REMARQUE : Préparez une solution de PFA à 4 % juste avant l’utilisation pour la fixation de la perfusion.
    3. Solution de saccharose à 30 % (total 40 ml).
      1. Mélangez 30 ml de PBS avec 12 g de saccharose.
      2. Après dissolution complète, remplissez de PBS à 40 ml.
  2. Fixation de la perfusion et prélèvement tissulaire.
    ATTENTION : La fixation de la perfusion doit être effectuée dans une hotte car la solution PFA à 4 % est un produit chimique nocif puissant en cas d’inhalation.
    1. Anesthésisez la souris avec de l’isoflurane, placez-la en position couchée et confirmez l’absence totale de réactivité en pinçant doucement les extrémités.
    2. Une fois la souris anesthésiée, faites une incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux de l’abdomen caudal jusqu’au xiphoïde. Ensuite, faites deux incisions latérales de chaque côté du sternum et rétractez la paroi thoracique vers l’avant pour exposer le cœur et les principaux vaisseaux.
    3. Ouvrez l’oreillette droite par dissection brusque pour décompresser le système circulatoire. Insérez une aiguille papillon de 25 g dans le ventricule gauche et perférez 50 ml de PBS à un débit d’environ 10 ml/min, en dirigeant le flux vers l’aorte ascendante.
      REMARQUE : L’exsanguination est importante pour obtenir des images d’immunofluorescence (FI) de haute qualité, car le sang présente une autofluorescence. Pour assurer l’élimination complète du sang, 50 ml de PBS ont été utilisés dans cette étude, bien que 20 à 30 ml soient couramment utilisés.
    4. Perfuser 20 mL de la solution de PFA à 4 % préparée à l’étape 7.1.2 au même taux, en veillant à ce qu’il n’y ait pas d’introduction d’air pendant le changement de solution.
    5. Prélever les tissus et les conserver à 4 °C pendant la nuit dans un tube en polypropylène de 15 mL rempli d’une solution de PFA à 4 % pour la post-fixation. Lorsque la protéine fluorescente est exprimée dans le tissu collecté, couvrez le tube d’une feuille d’aluminium pour le protéger de la lumière.
  3. Cryoenrobage
    1. Transférez le tissu dans un tube de polypropylène de 15 mL rempli d’une solution de saccharose à 30 % préparée à l’étape 7.1.3 pour la cryoprotection.
    2. Maintenir à 4 °C jusqu’à ce que les mouchoirs coulent complètement au fond des tubes.
    3. Transférez le tissu dans un cryomoule en plastique à l’aide d’une pince à motif standard.
    4. Placez le composé OCT sur le tissu tout en vous assurant que le tissu est correctement orienté et affleurant le fond du cryomoule.
    5. Remplissez le dessus avec de la pâte OCT. Retirez les bulles à l’aide d’une pointe de pipette.
    6. Placez le cryomoule en plastique dans un bain cryogénique contenant du 2-méthylbutane, refroidi avec de la glace carbonique pilée dans un seau à glace, jusqu’à ce que le composé OCT soit complètement congelé (le composé OCT deviendra blanc).
    7. Conservez les blocs de mouchoirs à -80 °C jusqu’à utilisation.
  4. Cryosectionnement
    1. Transférez les blocs de tissus congelés dans un microtome cryostatique à -20 °C avant la section et laissez la température des blocs de tissus congelés s’équilibrer.
    2. Sectionnez chaque bloc de tissu congelé à l’épaisseur souhaitée (généralement 5 μm) à l’aide du microtome du cryostat. Placez les coupes de tissu sur une lame de verre de microscope pour la coloration par immunofluorescence.
    3. Les sections peuvent être stockées à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

8. Coloration par immunofluorescence

  1. Sécher les lames congelées à température ambiante pendant 30 min.
  2. Isolez la section à l’aide d’un stylo bloqueur de liquide et séchez-la à température ambiante pendant 5 min.
  3. Réhydrater les sections avec 150 μL de PBS pendant 10 min.
  4. Placez les lames sur une surface plane et ajoutez 150 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % diluée avec du PBS par section sur les lames. Incuber à température ambiante pendant 45 min pour le blocage.
  5. Ajouter 150 μL de solution primaire d’anticorps (anticorps anti-Wilms Tumor 1 (WT1), dilué à 1:100 avec 1 % de BSA ; anticorps anti-Na-K-2Cl cotransporter 2 (NKCC2), dilué à 1:100 avec 1 % de BSA ; ou anticorps anti-aquaporine 2 (AQP2), dilué à 1:100 avec 1 % de BSA) et incuber à 4 °C pendant la nuit sous une chambre humide.
  6. Lavez les sections avec du PBS à température ambiante pendant 5 min, 3 fois.
  7. Ajouter 150 μL d’anticorps secondaires (anticorps anti-IgG Alexa Fluor 647 de lapin, dilué à 1:500 avec 1 % de BSA) et de lectine de Lotus tetragonolobus (LTL)-fluorescéine (diluée à 1:200 avec 1 % de BSA), et incuber à température ambiante pendant 60 min.
  8. Lavez les sections avec du PBS à température ambiante pendant 5 min.
  9. Placez les lames sur une surface plane et ajoutez 150 μL de Hoechst 33342 (dilué à 1:10 000 avec du PBS) pour la coloration nucléaire. Incuber à température ambiante pendant 10 min, à l’abri de la lumière.
  10. Lavez les sections avec du PBS à température ambiante pendant 5 min.
  11. Montez les lames avec 20 μL de support de montage et une vitre de protection. Gardez les lames dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à ce que l’imagerie soit effectuée.

9. Extraction d’ADN à partir de tissus

  1. Extraction d’ADN à partir de tissus à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    1. Transférez le tissu dans un tube à billes de céramique et ajoutez 400 μL de tampon d’extraction d’ADN (100 mM de NaCl, 20 mM d’EDTA, 1 % de SDS et 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Homogénéiser le tissu à une vitesse de 5 m/s pendant 20 s en 3 cycles à l’aide d’un homogénéisateur.
    3. Centrifuger à 2 000 x g à température ambiante pendant 2 min.
    4. Prélever 200 μL de surnageant à l’aide d’une pipette P200 et ajouter 10 μL de solution de protéinase K (concentration finale de 1 mg/mL).
    5. Mélanger par vortex pendant 15 s et incuber à 55 °C pendant 1 h.
    6. Ajoutez 200 μL de tampon de lyse à partir du kit d’extraction d’ADN.
    7. Mélanger par vortex pendant 15 s et incuber à 55 °C pendant 15 min.
    8. Ajouter 250 μL d’éthanol à 100 %.
    9. Mélanger par vortex pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    10. Appliquez le lysat sur la colonne de spin d’extraction de l’ADN.
    11. Centrifuger à 6 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
    12. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. Ajoutez 500 μL du premier tampon de lavage du kit d’extraction d’ADN.
    13. Centrifuger à 6 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
    14. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte. Ajoutez 500 μL du deuxième tampon de lavage du kit d’extraction d’ADN.
    15. Centrifuger à 6 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
    16. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. Ajouter 500 μL d’éthanol à 100 %.
    17. Centrifuger à 6 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
    18. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 mL et centrifugez à 20 000 x g à température ambiante pendant 3 min.
      REMARQUE : Cette étape assure un séchage complet de la membrane de la colonne de centrifugation, car le transfert d’éthanol dans l’éluat peut interférer avec les applications en aval.
    19. Placez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajoutez 35 μL de tampon d’élution du kit d’extraction d’ADN à la colonne de spin.
      REMARQUE : Le volume d’éluat récupéré est généralement inférieur d’environ 5 μL au volume de tampon d’élution initialement appliqué à la colonne.
    20. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    21. Centrifugeuse à 20 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
    22. Mesurez la concentration d’ADN.
  2. Quantification du nombre de copies du génome du vecteur par PCR quantitative (qPCR)
    1. Diluer l’ADN extrait préparé à l’étape 9.1 à une concentration de 25 ng/μL avec de l’eau de qualité moléculaire.
    2. Concevoir une paire d’amorces qPCR pour la quantification du génome du vecteur (tdTomato a été utilisé dans cette étude) et une paire d’amorces qPCR pour le gène de référence de la souris qui sera utilisée pour quantifier les génomes diploïdes dans les échantillons d’ADN extraits (le gène agouti de la souris a été utilisé dans cette étude).
      REMARQUE : Les séquences d’amorces utilisées dans cette étude sont les suivantes :
      tdTomato vers l’avant : 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      TDCompe de tomate : 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      agouti de souris vers l’avant : 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      Agouti de souris inversé : 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Pour une réaction qPCR de 25 μL, mélanger 4 μL d’échantillon d’ADN dilué à l’étape 9.2.1 (un total de 100 ng d’ADN dans un mélange réactionnel de 25 μL), 12,5 μL de tampon de réaction qPCR 2x, 0,5 μL d’amorces directes et inverses de 20 μM préparées à l’étape 9.2.2 (concentration finale de 400 nM de chaque amorce), et 7,5 μL d’eau de qualité moléculaire.
    4. Mesurer quatre fois la concentration d’ADN des étalons plasmidiques pour la qPCR et déterminer la valeur moyenne de la concentration d’ADN.
      REMARQUE : Le plasmide circulaire super-enroulé pAAV-CAG-tdTomato et un plasmide circulaire superenroulé contenant la séquence cible de la PCR dérivée du gène agouti de souris ont été utilisés pour la quantification et la normalisation du génome du vecteur, respectivement, dans cette étude.
    5. Préparez une série de dilutions en série 1:10 d’étalons d’ADN plasmidique couvrant une plage dynamique de 106.
      REMARQUE : Chaque échantillon et étalon doit être analysé au moins en double.
    6. Effectuez la qPCR en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes : une étape initiale d’activation thermique à 95 °C pendant 10 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s et d’un recuit/extension à 60 °C pendant 30 s.
    7. Après avoir terminé la réaction qPCR et obtenu les valeurs du nombre de copies double brin (ds) des génomes du vecteur et du gène de référence de la souris dans les échantillons, déterminez le nombre de copies du génome du vecteur ds par équivalent génomique diploïde (ds-vg/dge) en normalisant le nombre de copies du génome du vecteur ds ds au nombre de copies du gène de référence dans chaque échantillon sur la base de courbes standard générées à partir de concentrations connues du génome du vecteur et du gène de référence.
      REMARQUE : Ds-vg/dge peut être déterminé sur la base de l’approximation suivante selon laquelle 100 ng d’ADN génomique de souris représentent 16 900 cellules de souris diploïdes (2N) (c’est-à-dire 5,92 pg d’ADN par cellule de souris diploïde).

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Résultats

Une étude récente a identifié un petit sous-ensemble de capsides AAV qui présente une amélioration remarquable de la transduction rénale par rapport à l’AAV9 après l’injection de RP38. Le sous-ensemble identifié comprend AAV-KP3, une capside AAV chimérique générée par brassage d’ADN41. Par conséquent, l’AAV-KP3 a été choisi pour l’injection de RP dans cette étude, ainsi que l’AAV9 comme référence. Le vecteur AAV9-CAG-tdTomato (AAV9) et le v...

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Discussion

Ce rapport a détaillé l’injection RP rétrograde lente de vecteurs AAV comme méthode d’administration locale pour l’administration de gènes dans le rein de souris. Une étape critique pour effectuer en toute sécurité l’injection de RP est l’ajustement du taux d’injection des vecteurs AAV afin d’éviter des lésions parenchymateuses aux reins injectés. Dans un rapport précédent sur l’injection hydrodynamique du bassinet du rein, 100 μL de solution d’ADN plasmidique ont été injectés dans le re...

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Déclarations de divulgation

H.N. reçoit une redevance sur les technologies liées aux AAV sous licence de Takara Bio Inc. et de Capsigen Inc., agit à titre de consultant pour des sociétés de biotechnologie, est cofondateur de Capsigen Inc. et détient des actions de Capsigen Inc. et de Sphere Gene Therapeutics.

Remerciements

Nous remercions Guangping Gao et James M. Wilson de nous avoir fourni le plasmide d’assistance d’AAV9 et Katja Pekrun et Mark A. Kay pour le plasmide d’aide d’AAV-KP3.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0.28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 800

Références

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