Méthodologie améliorée pour l’étude de l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse dans un modèle de lésion de la moelle osseuse murine

Résumé

Le modèle de lésion de la moelle osseuse murine est un outil utile pour étudier l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse. Ce protocole chirurgical simplifié décrit la procédure d’ablation de la moelle osseuse pour l’évaluation en aval de la formation de nouveaux os et des réponses cellulaires après une blessure.

Résumé

Les lésions des os longs guérissent par les voies de formation osseuse endochondrale ou intramembraneuse. Contrairement à la voie endochondrale qui nécessite une matrice cartilagineuse, le processus d’ossification intramembraneuse implique la conversion directe des cellules souches et progénitrices squelettiques (SSPC) en ostéoblastes formant l’os. Il existe peu de méthodes chirurgicales pour modéliser ce processus chez les souris expérimentales. Ici, nous avons amélioré un modèle de lésion de la moelle osseuse chez la souris pour faciliter l’étude de la réparation osseuse par ossification intramembraneuse et pour évaluer les régulateurs postnatals de l’ostéogenèse. Cette méthode est hautement reproductible et conviviale, et elle permet d’évaluer temporellement la formation d’un nouvel os dans un court laps de temps (3 à 7 jours après la blessure) à l’aide de la micro-tomodensitométrie (μCT) et de l’histologie en coupe congelée. De plus, les contributions des SSPC et des ostéoblastes matures peuvent être facilement évaluées à l’aide d’une combinaison de souris rapporteures fluorescentes et de ce modèle de lésion intramembraneuse de la moelle osseuse. Dans des contextes cliniques, la formation osseuse intramembraneuse est pertinente pour la guérison des défauts de taille critique, des fractures stabilisées, des défauts corticaux, des traumatismes dus à des résections tumorales et des remplacements articulaires.

Introduction

Les lésions des os longs guérissent par la voie de formation osseuse endochondrale ou intramembraneuse. Contrairement à la voie endochondrale, qui nécessite une étape de précurseur du cartilage, la réparation osseuse par ossification intramembraneuse implique la conversion directe des cellules souches et progénitrices squelettiques (SSPCS) en ostéoblastes formant l’os¹. Cliniquement, ce processus est pertinent pour la cicatrisation osseuse dans une variété de contextes, y compris les défauts de taille critique, les fractures stabilisées, les défauts corticaux, l’ostéogenèse de distraction, les traumatismes dus aux résections tumorales et l’ostéointégration des implants de remplacement articulaire ^2,3. Fait intéressant, dans les études portant sur des patients souffrant de fractures des os longs, 66 % à 82 % avaient des fractures déplacées, ce qui nécessitait des dispositifs de fixation pour stabiliser l’os ^4,5. Ces os stabilisés de manière rigide guérissent principalement par ossification intramembraneuse lorsque les extrémités des os cassés entrent en contact direct les unes avec les autres ^6,7. Pourtant, la régulation mécaniste de la régénération osseuse intramembraneuse reste relativement peu étudiée par rapport à la formation osseuse par les voies endochondrales. Les thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) pour augmenter la cicatrisation osseuse sont entravées par une efficacité clinique limitée et des coûts élevés, et sont associées à des effets indésirables importants⁸.

L’ablation mécanique de la moelle osseuse fournit un modèle précieux pour étudier la formation osseuse intramembraneuse. Ce modèle de blessure simple permet d’étudier la régénération osseuse dans la moelle osseuse sans perturber l’os cortical. Après l’ablation de la BM, le processus de guérison comporte des phases distinctes mais qui se chevauchent. La phase initiale se produit dans les 1 à 5 premiers jours et implique la formation de caillots et l’inflammation, où les cellules inflammatoires et les cytokines initient la guérison. Du 3e au 14e jour, la deuxième phase est caractérisée par une régénération, y compris la néovascularisation, la migration et la prolifération des cellules souches mésenchymateuses (CSM), la différenciation ostéoblastique et la formation d’os tissés. La phase finale de remodelage commence environ 10 jours après l’opération, le tissu osseux subissant une maturation et une restructuration jusqu’à ce que la moelle soit complètement restaurée au jour 56⁹. Cette chronologie de guérison rapide rend le modèle d’ablation de la BM idéal pour étudier les réponses précoces de réparation osseuse, en particulier pendant les périodes critiques de l’inflammation, du recrutement des cellules progénitrices et de la différenciation des ostéoblastes. À l’aide de techniques telles que l’histologie, la cytométrie en flux et l’analyse quantitative μCT, les réponses cellulaires et la formation osseuse aux premiers stades de réparation peuvent être évaluées. En utilisant les techniques susmentionnées, le modèle d’ablation de la BM peut donner un aperçu des mécanismes de régénération osseuse intramembraneuse et aider à identifier des cibles thérapeutiques clés pour améliorer la cicatrisation osseuse.

Protocole

Les procédures suivantes ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre de santé de l’Université du Connecticut (IACUC). Toutes les interventions chirurgicales ont été effectuées dans des conditions stériles, comme le décrivent les directives des National Institutes of Health (NIH). La douleur et le risque d’infections ont été gérés à l’aide d’analgésiques et d’antiseptiques appropriés pour assurer un résultat positif.

1. Préparation de la zone chirurgicale et des instruments

1. Préparez la salle d’intervention chirurgicale en désinfectant les surfaces de travail avec un nettoyant désinfectant de qualité clinique.
   REMARQUE : Le chirurgien doit porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants jetables stériles, un bonnet pour les cheveux, une blouse et un masque.
2. Préparez un coussin chauffant recouvert d’un coussin chirurgical stérile. Rassemblez et rangez tous les instruments et réactifs stériles (table des matériaux) avec un accès pratique.

2. Anesthésie préopératoire

1. Pesez toutes les souris avant la chirurgie. Calculer les volumes d’analgésique à utiliser en fonction de la formulation disponible de buprénorphine.
2. Assemblez une unité d’anesthésie animale dans l’espace de travail stérile, qui comprend une chambre d’induction et un cône nasal. Régler le débit d’oxygène à 2 L ^min-1 et celui de l’isoflurane à 1,5-3 % (v/v) selon l’âge et le poids de la souris.
3. Une fois la souris sous sédation, retirez l’animal de la chambre d’induction et placez-le sur un coussin chirurgical stérile en position couchée. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux. Placez le cône nasal sur la tête. Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant doucement l’orteil. Assurez-vous qu’il n’y a pas de réponse réflexe des membres postérieurs avant de continuer.
4. Avant la chirurgie, retirez brièvement la souris du cône nasal pour injecter la dose totale de buprénorphine à libération prolongée par voie sous-cutanée ; La dose totale est de 3,25 mg/kg.

3. Description de l’intervention chirurgicale

REMARQUE : Cette procédure chirurgicale utilise des souris C57BL / 6 mâles et femelles âgées de 10 semaines à 24 semaines. La procédure peut être effectuée sur des souris aussi jeunes que 6 semaines jusqu’à 33 semaines et sur diverses souches consanguines, comme le montrent d’autres^10,11. Les souris plus jeunes peuvent avoir besoin d’aiguilles plus courtes, tandis que les souris plus âgées ou plus grandes peuvent avoir besoin d’une aiguille plus longue.

1. Remplissez une seringue de 3 mL munie d’une aiguille de 26 g avec une solution saline stérile. Placez-le sur le côté.
2. Retirez la fourrure de la patte arrière sur laquelle la procédure sera effectuée avec une tondeuse électrique ou à piles (lame #40) et retirez toute fourrure lâche du champ opératoire. À l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton, traitez le site chirurgical avec un gommage à base d’iode (10 % de povidone iodée), suivi d’alcool isopropylique à 70 %. Frottez le site chirurgical en commençant par le centre du genou et en effectuant un balayage circulaire vers l’extérieur. Laissez le site sécher. Répétez les étapes de nettoyage 3 fois.
3. Placez la souris sur son dos et fléchissez le genou de la jambe opérationnelle. Tenez la jambe de la souris dans la main non dominante de sorte que le genou soit plié sur le majeur, le deuxième doigt repose sur le fémur et le pouce repose sur le tibia.
4. Faites une petite incision horizontale peu profonde juste en dessous de la rotule à l’aide d’un scalpel.
   REMARQUE : Cette étape améliore la visualisation du site d’insertion. Avec l’expérience, cette étape peut être sautée.
5. Localisez l’espace articulaire en plaçant l’aiguille horizontalement sur le genou plié et en tâtant l’espace entre le fémur et le tibia. En utilisant ce site anatomique pour guider, prenez une aiguille de 25 G et percez manuellement (en tordant l’aiguille et en appliquant simultanément une pression modérée sur l’aiguille) dans le fémur distal du genou vers le côté proximal. Insérez l’aiguille à travers ou autour de la rotule.
6. Radiographie la souris pour s’assurer que l’aiguille a été correctement placée dans la cavité médullaire, aussi près que possible du centre (Figure 1).
7. Retirez l’aiguille de 25 G et insérez immédiatement une aiguille de 26 G dans le même trou à l’intérieur de la cavité de la moelle. Alésez les côtés de la cavité médullaire dans un mouvement circulaire au moins 5 fois jusqu’à ce qu’elle soit lisse. Gardez le nombre de mouvements d’alésage cohérent entre chaque souris.
   REMARQUE : Les étapes 3.5 et 3.7 peuvent causer des blessures par piqûre d’aiguille au chirurgien si elles ne sont pas manipulées avec soin.
8. Retirez l’aiguille 26 G et replacez l’aiguille 26 G reliée à la seringue saline. Rincez la cavité jusqu’à ce que le refoulement soit dégagé. Cela nécessite généralement 1,5 à 2 ml de solution saline. Retirez la seringue et l’aiguille et jetez-les en toute sécurité dans un récipient tranchant.
   REMARQUE : Il ne doit pas y avoir de résistance lors de la poussée du liquide. Si c’est le cas, réinsérez l’aiguille pour vous assurer qu’elle se trouve à l’intérieur de la cavité. Il peut être nécessaire de retirer l’aiguille à mi-chemin.
9. Fermez la plaie cutanée à l’aide d’une suture adhésive topique.

4. Soins postopératoires

1. Immédiatement après la chirurgie, administrer la demi-dose restante de buprénorphine à libération prolongée en utilisant la posologie de l’étape 2.4.
   REMARQUE : La buprénorphine à libération prolongée procure un soulagement de la douleur jusqu’à 72 heures.
2. Surveillez les animaux sur le coussin chauffant pour détecter des signes de respiration normale et non obstruée jusqu’à ce qu’ils se réveillent de la chirurgie. Une fois ambulatoires, ramenez les souris dans leur cage.
3. Continuez à surveiller les souris une fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour vous assurer qu’elles guérissent correctement et qu’elles ont une mobilité complète, en surveillant les signes de douleur.

5. Traitement des os pour la scintigraphie et l’analyse par tomodensitométrie

1. Euthanasier les souris selon la méthode d’euthanasie sans cruauté réglementée et approuvée par l’IACUC ou toute autre politique institutionnelle applicable. Ici, la méthode d’euthanasie primaire d’inhalation de CO₂ a été utilisée, suivie d’une méthode secondaire de luxation cervicale.
2. Récoltez les fémurs en enlevant la peau autour des membres postérieurs et en enlevant tout le membre au niveau de l’articulation de la hanche.
3. Placez chaque membre en sandwich entre deux éponges dans une cassette d’enrobage. Transférez les os dans leurs cassettes dans une solution de formol à 10 % et fixez-les à 4 °C pendant 5 à 7 jours, en tenant compte de l’âge et de la taille de la souris.
   REMARQUE : La surfixation et la sous-fixation entraînent une mauvaise résolution de la moelle.
4. Après la fixation, laver les cassettes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min 3 fois.
5. Retirez les membres des cassettes et coupez les muscles à l’aide d’un scalpel si nécessaire.
   REMARQUE : Selon les applications en aval, une manipulation brutale peut perturber la couche osseuse périostée.
6. Séparez le fémur au niveau du genou en coupant soigneusement les ligaments à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel.
   REMARQUE : Le tibias peut être utilisé pour d’autres applications ou jeté.
7. Transférez les fémurs dans des tubes coniques de 1,7 ml ou 15 ml dans une solution d’éthanol à 70 %. Les os peuvent rester dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la tomodensitométrie.
8. Scanner et évaluer les fémurs à la recherche de paramètres trabéculaires, produisant des données qualitatives et quantitatives.

6. Traitement des os pour la coupe et l’histologie congelées

REMARQUE : Les os peuvent être traités pour la section congelée et l’histologie après avoir subi une tomodensitométrie. Le balayage n’affecte pas le marquage fluorescent ni la coloration ultérieure des anticorps.

1. Transférez les os de l’éthanol à 70 % au PBS et lavez 3 fois, 5 min par lavage.
2. Incuber dans une série de solutions de saccharose de 10 %, 20 % à 30 % dans du PBS à 4 °C pendant la nuit à chaque concentration. Conservez les os dans du saccharose à 30 % jusqu’à 5 jours à 4 °C ou dans cette solution à -20 °C pendant 6 à 12 mois jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être intégrés.
   REMARQUE : L’utilisation d’un gradient de saccharose entraîne une meilleure pénétration des tissus. Après l’étape 6.1, les os peuvent être placés directement dans une solution de saccharose à 30 % pendant la nuit.
3. Encastrez les os dans un composé à température de coupe optimale (OCT) à l’aide de moules de cryoenrobage. Conserver à -80 °C jusqu’au moment de sectionner.
4. Section des os incrustés à l’aide de la méthode de la bande cryofilm avec une température du cryostat réglée entre -24 °C et -26 °C.
5. Collez les sections du cryofilm sur une lame adhésive à l’aide d’un adhésif optique et durcissez-le jusqu’à ce qu’il durcisse à l’aide d’un réticulant ultraviolet (UV).

7. Traitement pour la cytométrie en flux

REMARQUE : Ce protocole est compatible avec une variété d’anticorps. Pour caractériser les cellules souches squelettiques et les cellules progénitrices, il est recommandé de regrouper 3 à 4 os, car il s’agit de populations cellulaires rares dans la moelle osseuse.

1. Préparez un milieu de coloration par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Pour préparer une solution de 1000 mL de FSM, combinez : 100 mL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), 10 mL d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 20 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 870 mL de dd H2O. Faites passer la solution FSM à travers un filtre de 0,2 μm.
2. Avant de prélever les tissus, remplissez des boîtes de Pétri avec 4 à 5 ml de PBS stérile sans calcium ni magnésium.
3. Préparez le milieu de digestion
   1. Pour 4 à 6 fémurs, préparer un mélange de digestion dans 10 mL de PBS contenant 0,005 g de collagénase P et 0,02 g d’hyaluronidase. Mélanger par vortex doux et passer le mélange à travers un filtre de 0,22 μm.
4. Prélever les os le jour 3 post-opératoire comme décrit à l’étape 5.2. Retirez tous les muscles et le tissu conjonctif avec une lame de scalpel.
5. Remplissez une boîte de Pétri avec 5 ml de milieu de digestion. Placez 4 à 6 os dans le milieu de digestion. Hachez finement chaque os, en faisant la première coupe longitudinalement et latéralement.
6. Transférez le tissu dans un tube à fond rond de 14 ml et scellez-le avec un parafilm. Couvrir les tubes en feuille d’aluminium.
7. Agiter à 37 °C pendant 20 min en maintenant le tube horizontalement sur l’agitateur.
8. Retirez le tube de l’agitateur. Les cellules seront regroupées au fond. Récupérez doucement la matière digérée sans déranger les cellules au fond, et faites passer la digestion à travers un filtre de 70 μm. Prélever le filtrat dans un nouveau tube de 50 mL contenant 10 mL de FSM froid et le conserver sur de la glace.
9. Dans les cellules, ajoutez les 5 ml restants du mélange de digestion. Scellez à nouveau avec du parafilm et couvrez de papier d’aluminium. Secouez le tube comme décrit ci-dessus. Répétez les étapes 7.7-7.8.
10. Après l’incubation de 20 minutes à 37 °C, transférez la matière grasse dans le même tube contenant la matière grasse qu’à partir de l’étape 7.8, en passant à travers un filtre de 70 μm avec 10 ml de FSM supplémentaire.
11. Centrifuger la suspension à 274 x g à 4 °C. Aspirez le surnageant et récupérez la pastille cellulaire. Délogez la pastille en tapotant doucement le tube.
    REMARQUE : La force centrifuge (g) est basée sur un rayon de rotor de 170 mm. Veuillez vérifier le rayon du rotor et ajuster la vitesse en conséquence.
12. Pour effectuer la lyse des globules rouges, ajoutez 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium (ACK). Gardez tous les réactifs et les cellules sur la glace.
13. Incuber les cellules en ACK pendant environ 5 minutes à RT. Ne pas dépasser 5 min pour éviter de trop lyser les cellules.
14. Ajouter 9 ml de FSM. Centrifugeuse à 274 x g pendant 5 min à 4 °C.
15. Aspirez le surnageant. Cassez la pastille de cellule en ratissant doucement le tube sur un support de tube.
16. Ajouter 10 ml de FSM (volume pour 4 os, peut être ajusté en fonction du nombre d’os combinés) et remettre en suspension.
17. Prélever une aliquote de chaque échantillon et ajouter de l’iodure de propidium (IP) selon les instructions du fabricant. Comptez les cellules vivantes et totales à l’aide d’un compteur de cellules.
18. Procéder à la coloration par anticorps des échantillons à l’aide des marqueurs souhaités pour l’analyse par cytométrie en flux 12,13,14.

Résultats

Le succès de la procédure d’ablation mécanique de la moelle osseuse (BM) a été validé par l’imagerie par rayons X, tandis que l’aiguille 26G a été insérée dans la cavité médullaire (Figure 2A). Lorsque l’imagerie par rayons X a indiqué que l’aiguille avait été insérée à un angle inapproprié ou qu’elle avait pénétré à travers l’os, l’aiguille a été réinsérée à l’angle approprié et reproduite pour confirmer l’emplacement exact. Lorsqu’il n’a pas été possible d’atteindre une position retenue, l...

Discussion

L’objectif était d’établir une méthode fiable et reproductible pour étudier les processus moléculaires et cellulaires régissant la réparation osseuse, en se concentrant sur la conversion directe des cellules souches et progénitrices squelettiques (SSPC) en ostéoblastes déposant de l’os dans l’espace/la cavité de la moelle osseuse. La méthode d’ablation mécanique de la moelle osseuse décrite ici est un protocole optimisé et validé pour l’ablation de la moelle osseuse par lésion mécanique,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de formol à 10 %  ;	Sigma-Aldrich	HT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Aiguille Hypodermique	Ait Tite/ Fisher Scientific	14-817-239 ; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Aiguilles Hypodermiques Jetables	Exel International/ Fisher Scientific	14-840-83 ; ref #26402	Toutes les aiguilles de 26 G peuvent être substituées, doivent être détachables de la seringue  ;
Seringue stérile de 3 mL	Fisherbrand/ Fisher Scientific  ;	14-955-457
AB Tampon stérile	McKesson/ Fisher Scientific	NC0593755	Alternativement, on peut utiliser des tampons absorbants autoclavables  ;
Acide acétique, glacial	Millipore Sigma	AX0073	Doit être dilué à 1 %
tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium (ACK)	Gibco/ Thermo Fisher Scientific  ;	A1049201	Utilisé pour la lyse des globules rouges en préparation de la cytométrie en flux.
Chambre d’induction d’anesthésie 2 L	VetEquip	941444
solution de bétadine (providone iodée)  ;	Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific	NC0158124
Buprénorphine HCL injectable 0,3 mg/mL  ;	Générique/ Covetrus	59122	Doit obtenir une licence DEA d’État et fédérale pour l’achat de la substance contrôlée
Calcein-AM	Sigma Aldrich	206700-1MG
Collagénase P  ;	Roche	11249002001	Utilisé pour la digestion
des cotons-tiges et applicateurs	d’os Fisherbrand/ Fisher Scientific  ;	22-363-172
Cryofilm de type II C(10), 3,5 cm	Section Lab, Japon	CFS 105
Solution de coloration DAPI  ;	Abcam	ab228549
Balance numérique à grammes	Toprime / Amazon	B06X6LW4V9	Peut utiliser n’importe quelle marque de balance pour peser les souris
Pince à dissectionn°	Fisherbrand/ Fisher Scientific  ;	08-953F ; 08-953F
Ciseaux de dissection.	Fisherbrand/ Fisher Scientific  ;	08-940
Endure Low Profile Cryostat/Microtome Blades	Tanner Scientific	TNR315LP
Ethiqa XR Buprénorphine à libération prolongée 1,3 mg/mL	Ethiqa XR/ Cevetrus	72117	Doit obtenir une licence DEA étatique et fédérale pour l’achat d’une substance contrôlée
Fast Green, 0,2 %	Electron Miscroscopy Sciences EMS	50-319-57
Chaleur sérique fœtale bovine	inactivé Gibco/ Thermo Fisher Scientific  ;	A5256801	Utilisé pour fabriquer des supports de coloration FACS (FSM)
Solution de montage Fluoromount-G  ;	SouthernBiotech  ;	0100-01
GLUSEAL Adhésif topique pour la peau  ;	AD Chirurgicale  ;	GLU-550
Chèvre anti-Lapin Alexa 647	Thermo Fisher	A21244	1:300 dilution
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	14065056	Utilisé pour fabriquer des supports de coloration FACS (FSM)
Coussin chauffant (grand)	Boncare/ Amazon	B0CLHSWXSX	Peut utiliser n’importe quelle marque de coussin chauffant, retirez le couvercle en tissu  ;
Hématoxyline	MilliporeSigma/ Fisher Scientific	M1051740500
Hyaluronidase	MilliporeSigma	HX0514	Utilisé pour la digestion osseuse
Isoflurane Système d’anesthésie animale	VetEquip	901810
KUBTEC Paramètre 2D Système de radiologie	OncoMed Solutions	N/A	Tout système d’imagerie par cabine de radiologie peut être utilisé
Microcentrifugeuse Tubes	Corning/ Thomas Scientific  ;	8600A52
Verre de protection de microscope, 18 mm x 18 mm, # 1 Épaisseur	Globe Scientific	1414-10
N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane acide sulfonique HEPES (1M)  ;	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	156300-80	Utilisé pour fabriquer des supports de coloration FACS (FSM)
Adhésif optique Norland NO61	Edmund Optical	37-322	Utilisé pour coller des sections de cryofilm sur une lame  ;
Anticorps monoclonal Osterix Rabbit	Abcam	ab209484	dilution 1:500
Peroxigard Désinfectant en une étape prêt à l’emploi	Virox Technologies	29101	Peut être remplacé par tout autre désinfectant de qualité clinique/laboratoire
Iodure de propidium (PI)  ;	Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific  ;	P1304MP	Coloration fluorescente nucléaire utilisée pour détecter les cellules mortes pour le comptage de la viabilité
Tondeuse électrique rechargeable	Wahl/ Amazon	B001FWXKUE N’importe	quelle tondeuse peut être utilisée, une tondeuse de plus petite taille facilitera le rasage des petits animaux
Cône de nez de rongeur	VetEquip	921609
Safranin O, pur à 85 %, certifié	Fisher Scientific	AC419211000
Seal’N Freeze Cryotray Moules carrés Electron	Miscroscopy Sciences EMS	62642-01	Utilisé pour l’encastrement, d’autres moules d’enrobage peuvent être utilisés. Ce modèle spécifique dispose d’un moule plus profond, ainsi que d’un couvercle pour sceller le bloc  ;
Nitrate d’argent	Sigma Aldrich	S6506	Nitrate d’argent pour coloration von Kossa
Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	10010023	Alternativement, du PBS fraîchement préparé, filtré et autoclavé peut être utilisé
Scalpels étalons stériles	Integra Miltex/ Fisher Scientific	12-460-455
Scalpels étalons stériles	Integra Miltex/ Fisher Scientific	12-460-455
Poudre de saccharose 1 kg	Thermo Fisher Scientific	036508-A1
Superfrost Plus Lames de miscroscope	Fisherbrand/ Fisher Scientific  ;	1255015	Lames adhésives
Sure-Tek Traitement/Encastrement de tissus Casettes	Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific	22-048-141
Tissue Plus Optimum Cut Temperature O.C.T Compound	Fisher Scientific	23-730-571
Éponges tissulaires	Epredia/ Fisher Scientific	84-53	Les éponges tissulaires protègent les tissus contre le surtraitement  ;
Toluidine Blue	Fisher	Scientific AC348600050