Méthode optimisée de culture et de bioaugmentation microbienne de Typha latifolia (quenouille)

Summary

Le Typha latifolia, qui se propage principalement de manière asexuée par le biais de rhizomes, pose des défis de collecte en raison de son vaste système racinaire. Cet article présente une méthode de culture de T. latifolia à partir de graines, facilitant la culture en laboratoire et offrant le potentiel d’une croissance végétale stérile et d’une bioaugmentation microbienne précoce.

Abstract

Le Typha latifolia, plus connu sous le nom de quenouille à feuilles larges ou de scirpe commun, a une aire de répartition mondiale et domine les écosystèmes des milieux humides d’Amérique du Nord. Alors que différentes espèces de quenouilles sont souvent considérées comme envahissantes en Amérique du Nord, T. latifolia est considéré comme l’espèce indigène de la région et se trouve sur tout le continent comme l’espèce dominante de Typha . Historiquement, le Typha a rempli diverses fonctions, des sources de nourriture aux matériaux de construction. Plus récemment, T. latifolia est devenu une espèce importante pour aider les efforts de biorestauration. Compte tenu de l’intérêt croissant pour la mise au point de systèmes de traitement des milieux humides artificiels pour l’assainissement des contaminants, il est nécessaire de mettre en place des techniques reproductibles pour cultiver la quenouille en laboratoire. Les travaux présentés ici ont examiné et testé divers paramètres de croissance pour la culture réussie de T. latifolia à partir de graines. La germination réussie des espèces de Typha implique une scarification (rupture du tégument), qui a été obtenue à l’aide de techniques mécaniques pour une production à grande échelle. Il a été démontré que l’établissement précoce des graines favorise des conditions de croissance faibles en éléments nutritifs pendant la première semaine, suivi de l’introduction d’engrais dans les semaines suivantes pour améliorer la survie après le repiquage. Pour la bioaugmentation microbienne du système végétal, les résultats ont montré que le trempage des graines dans l’inoculum conduit à une colonisation plus étendue du tissu racinaire et à une persistance bactérienne à long terme. Une technique optimisée de stérilisation des semences utilisant une combinaison d’eau de Javel et de détergent a été utilisée pour améliorer le succès de la colonisation des micro-organismes. Les vaisseaux de croissance, stériles et non stériles, conçus dans cette étude soutiennent la croissance à long terme de T. latifolia dans diverses conditions.

Introduction

En tant que technologie économique et économe en énergie, les systèmes de traitement des milieux humides construits ont gagné en popularité pour l’assainissement des contaminants environnementaux ^1,2,3. Le CWTS utilise des processus physiques, chimiques et biologiques pour éliminer, transformer ou stabiliser les contaminants. Bien que les processus physiques et chimiques impliqués dans le renouvellement chimique aient été bien caractérisés depuis la genèse du CWTS, l’impact de la végétation est resté largement énigmatique². Au cours des dernières années, on s’est davantage concentré sur la compréhension des mécanismes par lesquels les plantes transforment les contaminants organiques et inorganiques potentiellement préoccupants dans les eaux usées ^2,4,5. Cependant, les études mécanistes comme celles-ci reposent sur la capacité de cultiver un grand nombre de macrophytes et favorisent la croissance à partir de graines pour s’assurer que chaque plante est au même stade de croissance et de développement.

En Amérique du Nord, les CWT sont fréquemment établis à l’aide de la végétation indigène des zones humides naturelles de la région, comme les espèces Typha, Scirpus, Juncus et Phragmites ^6,7. Le choix de la végétation dépend également de la zone humide artificielle utilisée, qui peut varier en profondeur, en débit d’eau, en approvisionnement en substrat et en approvisionnement en eau (avec ou sans recirculation)². Enfin, le climat influence également la végétation des zones humides, les climats plus frais favorisant les plantes submergées en raison de leur capacité d’adaptation accrue⁸. Les espèces de Typha sont particulièrement intéressantes dans les zones humides profondes construites par écoulement de surface en raison de leur capacité à coloniser rapidement un environnement et à s’adapter à diverses conditions environnementales ^9,10.

Un examen récent des résultats a révélé que, sur 87 essais de phytotoxicité utilisant des espèces de Typha , seulement 15 études ont commencé les plantes d’essai à partir de graines, et parmi celles-ci, une seule étude a examiné la croissance chez des plantes matures¹¹. Cette sous-représentation de l’expérimentation de quenouilles à partir de graines indique une lacune dans la littérature concernant les protocoles visant à décrire la culture de la quenouille pour des études en laboratoire. Les protocoles décrits ici visent à combler cette lacune en présentant un protocole approfondi pour la croissance de Typha latifolia de la graine à la plante mature dans des conditions stériles et non stériles. De plus, cet article traite d’une technique de bioaugmentation bactérienne des espèces de quenouilles au stade de la graine où l’inoculation précoce peut aider à maintenir la persistance à long terme des microbes rhizo- et endophytiques introduits.

Protocol

1. Scarification des graines

1. Les graines de quenouilles proviennent d’une zone humide à Calgary, en Alberta, au Canada, à l’automne 2023 (51,11312° N, 114,39381° O). Récoltez l’inflorescence de quenouilles à l’automne et conservez-la dans un sac en papier à l’obscurité jusqu’à utilisation. S’il est encore sur la tige, récoltez l’inflorescence au printemps, mais la récupération des graines sera diminuée.
2. À l’aide de ciseaux de jardin, coupez la tige de la plante à ~2 cm de la base de l’inflorescence. Retirez les graines de l’inflorescence et placez-les dans un mélangeur de laboratoire jusqu’à ce que le volume du mélangeur soit rempli aux quarts. Il s’agit d’environ 250 mL de graines non compactées.
3. Remplissez le mélangeur avec 500 ml d’eau du robinet. Maintenez un espace libre de 10 cm dans le mixeur. Mélanger à vitesse moyenne-basse pendant 20 s et transférer immédiatement dans un grand bécher de 1 L. La solution résultante doit être visqueuse.
4. Transférez environ 100 ml de cette boue d’eau de semence dans le mélangeur et remplissez le mélangeur avec 400 à 600 ml d’eau fraîche du robinet. Mélanger à vitesse moyenne-élevée pendant 20 s et transférer immédiatement dans un bécher frais de 1 L.
5. Remplissez le bécher avec de l’eau du robinet jusqu’à 800 ml et laissez-le reposer pendant au moins 60 s. Les graines de quenouilles scarifiées et viables couleront au fond du bécher, et le panache et le bec (voir la figure 1 pour une description de la structure des graines de quenouilles) flotteront vers le haut. Prélevez la boue en haut du bécher et versez lentement l’eau du bécher sans déranger les graines au fond. Transférez les graines dans un bécher de 100 ml.
6. Répétez le processus de mélange sur le reste de la boue de quenouille de l’étape 1.5.
7. Placez le bécher contenant les graines sur une plaque d’agitation et faites tourner à vitesse moyenne pendant 1 h. Après 1 h, retirez toute matière végétale flottant au sommet du bécher.
8. Versez les graines dans un entonnoir Büchner avec du papier filtre attaché à un aspirateur pour sécher les graines pendant la nuit. Les graines sèches peuvent être conservées à -20 °C dans des tubes coniques en polypropylène de 15 ml.

2. Germination par technique non stérile

1. Préparez des plaques de milieu Murashige et Skoog (MS) demi-résistantes avec 1 % de phytoagar¹².
2. Placez environ 1 mL de graines sèches dans un tube conique en polypropylène de 15 mL et remplissez-le de 10 mL d’eau du robinet. Tourner sur un agitateur orbital à basse vitesse pendant 24 h pour induire la germination.
3. Retirez l’excès d’eau de sorte qu’il reste 3 ml dans le tube conique en polypropylène de 15 ml.
4. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette en plastique de 1000 μL pour augmenter la taille de l’alésage et pipetez vigoureusement la solution de graines pour suspendre les graines à l’intérieur de la pointe de la pipette.
5. Placez les graines et l’eau sur les plaques de gélose MS demi-fortes. Faites tourner l’assiette pour répartir uniformément les graines.
6. Enveloppez les plaques dans un film d’étanchéité de laboratoire et placez-les dans une chambre de croissance avec un cycle lumière-obscurité de 16 h/8 h à 23 °C et 70 % d’humidité. Incuber les plaques pendant 1 semaine (jusqu’à 2 semaines) pour induire la germination des graines.

3. Germination par technique stérile

REMARQUE : Différents protocoles de stérilisation des semences ont été testés et comparés. La technique qui a produit les taux de germination les plus élevés tout en produisant des graines entièrement stérilisées a été modifiée à partir d’un protocole précédent¹³ et est décrite ici.

1. Préparez des plaques de milieu MS demi-résistantes avec 1 % de phytoagar¹².
2. Placez un volume d’environ 1 mL de graines dans un tube conique en polypropylène de 15 mL et remplissez-le de 10 mL de ddH₂O. Placez sur un agitateur orbital à vitesse moyenne-élevée pendant 10 min.
3. Retirer l’eau et ajouter 5 ml d’une solution de polysorbate 20 à 0,1 % (préparée dans du ddH₂O stérile) dans le tube conique en polypropylène de 15 ml. Placer sur un agitateur orbital à vitesse moyenne-élevée pendant 10 min.
4. Retirer la solution et ajouter 5 ml d’une solution d’eau de Javel commerciale à 30 % et de Polysorbate 20 à 0,025 % (préparée dans du ddH₂O stérile) dans le tube conique en polypropylène de 15 ml. Agiter à vitesse moyenne-élevée pendant 30 min.
5. Retirer la solution et la remplacer par du ddH₂O. Agiter à vitesse moyenne-élevée pendant 5 min. Répétez l’opération pour un total de 3 rinçages à l’eau.
6. Remplissez le tube conique en polypropylène de 15 mL avec du ddH₂O stérile et tournez-le à basse vitesse pendant 24 h pour induire la germination. Après 24 h, retirez l’excès d’eau pour qu’il reste 3 mL dans le tube de plastique.
7. Coupez aseptiquement l’extrémité d’une pointe de pipette en plastique de 1000 μL et pipetez vigoureusement pour suspendre les graines à l’intérieur de la pointe.
8. Plaquez les graines et le liquide sur des plaques de gélose MS demi-fortes. Tournez l’assiette pour répartir uniformément les graines.
9. Enveloppez les plaques dans un film d’étanchéité de laboratoire et placez-les dans une chambre de croissance avec un cycle lumière-obscurité de 16 h/8 h à 23 °C et 70 % d’humidité. Laissez les plaques pendant 1 semaine (jusqu’à 2 semaines) pour permettre la germination.

4. Inoculation de semences avec des bactéries sélectionnées

1. Pour inoculer des graines de quenouilles, suivez d’abord le protocole de germination des graines stériles ci-dessus jusqu’à l’étape 3.6 pour produire des graines stériles. Retirez le dernier rinçage à l’eau du tube conique en polypropylène de 15 mL comme décrit à l’étape 3.6 ci-dessus.
2. À l’aide de cultures microbiennes cultivées pendant la nuit et inoculées à partir d’un seul isolat ou d’une seule communauté, mesurez la DO 600 et normalisez-la à une valeur d’absorbance de 1,0 en diluant dans un milieu de culture. Incuber les cultures pendant une période plus longue si une DO 600 de 1,0 n’est pas atteinte.
   REMARQUE : Ici, des cultures ont été établies à partir d’une espèce de Luteimonas isolée dans des racines de plantes dans le nord de l’Alberta et conjuguées pour exprimer une protéine fluorescente DsRed à des fins de visualisation microscopique.
3. Essorer 1 mL de culture à 9300 x g pendant 2 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline tamponnée 1x phosphate. Essorage à 9300 x g pendant 2 min.
4. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 1 mL de ddH2O stérile.
5. Dans un tube conique en polypropylène de 15 ml, agiter environ 1 mL de graines à basse vitesse pendant 24 h dans 10 mL d’une dilution de 1:10 de l’inoculum préparé avec un tensioactif organosilicone à 0,025 %.
6. Suivez le reste du protocole de germination des graines stériles à partir de l’étape 3.8.

5. Croissance non stérile des quenouilles sur le sol

1. Remplissez les pots avec de la terre à faible teneur en matière organique de votre choix, en laissant 1 cm d’espace à partir du haut du pot. Préhumidifiez le sol avec de l’eau du robinet et percez des trous de 1 cm dans le sol.
2. À l’aide d’une pince à épiler, retirez délicatement les semis germés pendant 1 semaine des plaques de gélose MS cultivées comme décrit à l’étape 3 ci-dessus, en prenant soin de ne pas endommager les racines. Placez doucement un semis dans chaque trou du sol et couvrez-le de terre.
3. Placez les pots dans un bac et remplissez-les d’eau du robinet jusqu’au niveau du sol. Pour 10 pots, ajoutez 100 ml d’engrais NPK 0,5 % 20/20/20.
4. À chaque ensemble de dix pots, ajoutez de l’engrais comme suit : semaine 2 - 100 ml d’engrais à 0,5 %, semaine 3 - 100 ml d’engrais à 1,0 %, semaine 4 - 100 ml d’engrais à 1,0 %.
5. Après 4 semaines, arrêtez la fertilisation hebdomadaire et ne fertilisez qu’une fois par mois avec 100 ml de solution d’engrais à 1,0 %. À 4 semaines, repiquez dans des pots plus grands, si nécessaire. Les plantes sont moins sensibles au type de sol à ce stade, alors utilisez n’importe quel mélange.
6. Continuez à transplanter les quenouilles à mesure qu’elles deviennent trop grandes pour leur contenant. Enlevez le feuillage mort à l’aide d’un sécateur. Fertilisez les quenouilles une fois par mois.
7. Pour les expériences, transplantez les semis dans un petit pot qui, lorsqu’il est placé au fond d’une boîte vide à pointe de pipette, est ancré sur les côtés de la boîte. Cela permet une bonne inondation du sol, imitant ainsi les conditions des zones humides. Si vous effectuez des expériences sur des quenouilles plus anciennes, modifiez-les de la même manière afin que le pot puisse être presque entièrement immergé dans l’eau.

6. Croissance stérile des semis

1. Conception de la chambre de croissance des semis
   REMARQUE : L’assemblage de chaque unité de chambre de croissance des plantules nécessite deux boîtes de culture, une seringue avec un embout Luer Lock, un filtre stérile jetable de 0,2 μm et du silicone résistant à la chaleur. Voir la figure 2 pour une représentation visuelle de la configuration de la chambre.
   1. Retirez les couvercles des boîtes de culture et utilisez une perceuse à main pour créer des trous de 3,5 cm de diamètre au centre des couvercles. Utilisez du silicone résistant à la chaleur pour coller le haut des deux couvercles ensemble.
   2. Percez un trou de la taille de l’embout de la seringue (~ 1 cm de diamètre) dans le coin inférieur de l’une des boîtes de culture. Coupez l’extrémité d’une seringue et jetez le corps de la seringue.
   3. Utilisez du silicone résistant à la chaleur pour fixer l’embout de la seringue dans la boîte de culture avec le fil Luer lock à l’extérieur de la boîte.
   4. Laisser durcir le silicone au moins 24 h avant utilisation.
2. Croissance stérile dans le sol
   1. Suivez le protocole de germination des graines stériles décrit à l’étape 3 pour obtenir des graines stériles.
   2. Remplissez l’unité de la chambre de croissance stérile avec la terre de votre choix, humidifiée avec de l’eau du robinet.
   3. Autoclave sur un cycle liquide de 20 minutes, en recouvrant la pointe du leurre avec une feuille d’aluminium. Après 24 h, autoclavez à nouveau le système sur un cycle liquide de 20 minutes. Effectuez toutes les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire.
   4. Fixez une unité de filtration de 0,2 μm à l’accessoire Luer lock sur la chambre de croissance (Figure 2). Ouvrez la chambre de culture et ajoutez 500 μL d’engrais 1 % 20/20/20 stérilisé par filtre au sol. Mélangez le sol avec une spatule stérile. Tout en mélangeant le sol, ajoutez du ddH₂O stérile pour vous assurer qu’il est suffisamment hydraté sans sursaturation.
   5. À l’aide d’une lame de rasoir stérile, coupez en quartiers la gélose MS des plaques contenant des plants âgés de 1 semaine. À l’aide d’une spatule stérile, posez le morceau de gélose sur le sol.
   6. Placez l’unité de chambre de croissance dans un incubateur de croissance des plantes selon un cycle jour-nuit de 16 h/8 h à 23 °C et 70 % d’humidité.
3. Croissance stérile en solution hydroponique
   1. Suivez le protocole de germination stérile décrit à l’étape 3 pour obtenir des graines stériles.
   2. Autoclavez une boîte d’embout de pipette et une gélose MS demi-forte sur un cycle liquide de 20 min. Dans une hotte à flux laminaire, enveloppez le bas de l’insert de pointe avec un film d’étanchéité de laboratoire stérile. Remplissez chaque ouverture de l’extrémité de la pipette avec de la gélose presque vers le haut.
   3. Rajoutez l’insert de pointe dans la boîte de pointe, en remplissant le fond de la boîte avec la solution de croissance hydroponique de Hoagland à demi-concentration (0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 0,023 mM H₃BO₃, 0,005 mM MnCl₂·4H₂O, 0,0004 mM ZnSO₄·7H₂O, 0,0002 mM CuSO₄·5H₂O, 0,00007 mM H₂MoO₄·1H₂O, et 0,045 mM FeSO₄·7H₂O, ajustés à pH 7,0).
   4. Retirez soigneusement les plantules des plaques de gélose MS et placez-les sur la gélose MS au-dessus de la gélose dans l’ouverture de la pipette dans l’insert de la boîte de pointe.
   5. Fermez le couvercle de la boîte à pointes et placez-le dans une chambre de croissance selon un cycle jour-nuit de 16 h/8 h à 23 °C et 70 % d’humidité.
   6. Lorsque les plantes sont trop grandes pour la boîte de pointe, transplantez-les dans la chambre de croissance de culture décrite à l’étape 5.1. Pour le transfert, retirez tout le bouchon de gélose avec la plante et déplacez-le dans un bouchon en mousse avec une coupe radiale. Le bouchon en mousse peut être placé entre les deux boîtes de culture, et la boîte de culture inférieure peut être remplie de Hoagland’s demi-résistance.

Results

La figure 1 montre une représentation d’une graine de Typha qui a subi le processus de scarification, ainsi qu’une graine incomplètement scarifiée avec le bec enlevé et une graine non scarifiée. S’assurer que le temps de mélange est suffisant pour produire principalement des graines entièrement scarifiées.

Après la scarification et le séchage des graines, la viabilité des graines doit être testée à l’aide de la technique de germination non stérile. Au bou...

Discussion

Le protocole présenté ici fournit un guide détaillé pour la croissance d’espèces de quenouilles à partir de graines pour des applications en laboratoire. Bien que la quenouille puisse être facilement propagée à partir de boutures de rhizome, le démarrage des plantes à partir de graines permet une variation génétique au sein d’un ensemble d’échantillons, garantit que les plantes sont à des stades de croissance égaux et offre la possibilité d’une colonisation précoce pour des expériences d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 & micro ; Filtre stérile M	VWR	514-4126
3&prime ;,5&prime ;-Dimethoxy-4&prime ;-hydroxyacétophénone	Laboratoires PhytoTech	S7777
Boîtes de culture avec couvercles (77 mm et temps 77 mm et temps 97 mm)	Millipore Sigma & nbsp ;	V8505
Silicone scellant résistant à la chaleur haute température	Groupe Impérial de Fabrication	KK0205
Film d’étanchéité de laboratoire	Millipore Sigma & nbsp ;	P7793
Murashige et Skoog médias  ;	Laboratoires PhytoTech	M401
Tensioactif organosiliconé	Laboratoires PhytoTech	S7777
Phytoagar & nbsp ;	GoldBiotechnologie	P1003  ;
Polysorbate 20	Roche	11332465001