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Article de méthode

Saccharomyces cerevisiae Modèles de la maladie d’Alzheimer pour cribler les gènes, les mutations et les produits chimiques affectant la production de bêta-amyloïde par la γ-sécrétase

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DOI :

10.3791/67733

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24 juin 2025

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1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un système de levure reconstituant la γ-sécrétase humaine. Ce système permet d’identifier et d’étudier les mutations affectant l’activité et de cribler les inhibiteurs de la γ-sécrétase (GSI). En utilisant les propriétés de perte de fonction des mutants familiaux de la maladie d’Alzheimer, il est possible de dépister les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM).

Résumé

La γ-sécrétase est un complexe de protéase intégré dans la membrane cellulaire, composé des sous-unités catalytiques de la préséniline (PS1 ou PS2) et de trois cofacteurs supplémentaires : la nicastrine, l’Aph-1 et le Pen2. Il clive les domaines transmembranaires des protéines transmembranaires de type I, telles que la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et Notch. Le clivage de l’APP génère les peptides β amyloïde (Aβ), qui s’accumulent chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Malgré des recherches importantes, le mécanisme exact de cette protéolyse unique, qui se produit dans les bicouches lipidiques, n’est pas encore entièrement compris. Pour étudier les propriétés enzymatiques de la γ-sécrétase, nous avons établi un système rapporteur de levure utilisant des substrats artificiels de γ-sécrétase contenant des fragments APP ou Notch fusionnés à l’activateur transcriptionnel Gal4. L’activité de la γ-sécrétase a été évaluée par l’activation transcriptionnelle des gènes rapporteurs lors de la libération de Gal4 à partir des substrats liés à la membrane, telle qu’évaluée par la croissance de la levure ou l’activité de la β-galactosidase. De plus, nous avons développé un test in vitro pour identifier les différentes formes d’Aβ produites à partir de microsomes de levure. Ces modèles de levure fournissent une plate-forme pour cribler les mutations, les gènes et les composés qui affectent la fonction de la γ-sécrétase. En étudiant la perte de propriétés fonctionnelles des mutants de la maladie d’Alzheimer familiale (FAD) PS1, il est possible de dépister les mutations suppressives de la FAD et les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM), en plus des inhibiteurs de la γ-sécrétase (GSI). Dans ce rapport, nous décrivons les méthodes génétiques et biochimiques utilisées pour étudier l’activité de la γ-sécrétase dans le système de la levure avec les étapes essentielles du protocole de la vidéo.

Introduction

La γ-sécrétase est responsable du clivage intramembranaire de plus de 150 protéines transmembranaires de type I, y compris la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et Notch1. L’importance du clivage intramembranaire comprend non seulement le renouvellement des protéines, mais aussi la transduction du signal à travers les fragments générés. Par exemple, le traitement de l’APP produit de petits peptides de β amyloïde (Aβ). Bien que l’Aβ doive être éliminé en tant que produit de dégradation, dans la maladie d’Alzheimer, il s’accumule dans le cerveau pour former des plaques séniles2. D’autre part, le traitement de Notch est essentiel pour la signalisation NOTCH3, qui est cruciale pour le développement. La γ-sécrétase se compose de quatre protéines transmembranaires : la préséniline (PS1 ou PS2), la nicastrine (NCT), le pharynx-1 antérieur (Aph-1a ou 1b) et l’amplificateur de préséniline 2 (Pen2)4. Ces protéines ont un total de 19 domaines transmembranaires : il y en a neuf dans PS, sept dans Aph1, deux dans Pen2 et un dans NCT. La PS sert de sous-unité catalytique et contient deux résidus d’acide aspartique situés dans les domaines transmembranaires TM6 et TM75. Au cours de la maturation du complexe, le PS subit un clivage endoprotéolytique au sein de sa boucle hydrophile HL6, conduisant à la formation de fragments amino-terminaux et carboxyl-terminaux4. Les mutations associées à la maladie d’Alzheimer familiale (FAD) se retrouvent à la fois dans les gènes APP et PS2. Ces mutations faux-sens pathogènes affectent négativement l’activité de la γ-sécrétase, réduisant sa capacité à traiter efficacement l’APP. Cela conduit à une production accrue des formes Aβ42 sujettes à l’agrégation plutôt que des formes communes Aβ406. Les mécanismes exacts par lesquels ces mutations perturbent le clivage restent incertains. Les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM), qui peuvent modifier le rapport entre Aβ42 et les autres formes d’Aβ, sont prometteurs en tant qu’agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie d’Alzheimer en abaissant les niveaux d’Aβ427.

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a longtemps servi d’organisme modèle pour étudier les fonctions clés des cellules eucaryotes, telles que la division cellulaire, le transport des protéines et l’autophagie. Les chercheurs ont utilisé la complémentation fonctionnelle pour étudier les homologues humains, y compris le cycle de division cellulaire (CDC), la sécrétion (SEC) et les gènes liés à l’autophagie (ATG). La transformation de mutants de levure avec des gènes humains permet aux chercheurs d’analyser les processus cellulaires d’un point de vue fonctionnel. Des cinq familles connues de protéases intramembranaires, la levure n’en possède que trois : la peptide signal peptidase (Ypf1), les rhomboïdes (Pcp1 et Rbd2) et l’enzyme de conversion Ras (Rce1). Cependant, il n’y a pas d’homologues de la γ-sécrétase ou de la protéase du site 2 dans la levure8, ce qui rend l’approche de complémentation inadaptée. Malgré l’absence d’homologues de levure pour ces protéases, S. cerevisiae reste précieux pour l’exploration des protéines humaines. Des techniques telles que les tests de levure à un hybride, à deux hybrides et à trois hybrides, qui utilisent l’activateur transcriptionnel de levure Gal4, sont utilisées pour détecter les interactions entre l’ADN, les facteurs de transcription, les protéines ou l’ARN9. Nous avons modifié le système Gal4 pour surveiller la protéolyse intramembranaire médiée par la γ-sécrétase.

Nous avons réussi à reconstituer la réaction de clivage de la γ-sécrétase chez la levure en introduisant de la γ-sécrétase humaine ainsi que des substrats artificiels fusionnés à Gal4 (Figure 1)10. La réaction de clivage a été suivie par le système rapporteur Gal, soit en surveillant la croissance des levures, soit en mesurant l’activité de la β-galactosidase. De plus, nous avons identifié diverses formes Aβ (Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ43 et Aβ45) libérées dans les microsomes de levure par immunotransfert (Figure 1)11.

Lorsque des mutants PS1 ou APP liés à la FAD ont été introduits dans ce système, des degrés variables d’activité de perte de fonction ont été observés12. Nous avons effectué un criblage basé sur la croissance pour identifier les mutations suppressives qui restaurent la fonction altérée de ces mutants FAD (Figure 2). Ces suppresseurs ont non seulement sauvé le défaut, mais ont également amélioré indépendamment l’activité de parage de la γ-sécrétase. Plus précisément, ils ont réduit les niveaux de formes plus longues d’Aβ, en particulier Aβ42, d’une manière similaire aux modulateurs de la γ-sécrétase (GSM) abaisseurs d’Aβ42. Le système de reconstitution de levure permet de cribler les mutations, les gènes et les composés qui régulent l’activité, y compris l’inhibiteur de la γ-sécrétase (GSI) et le modulateur (GSM)13.

L’objectif de ce protocole est d’atteindre deux objectifs principaux : i) établir un système de criblage de la γ-sécrétase à base de levure et ii) fournir un exemple de techniques de reconstitution pour les réactions enzymatiques humaines chez la levure, en mettant l’accent sur l’essence des méthodes de reconstitution. Nous décrivons les méthodes en trois procédures clés avec les étapes essentielles suivantes : 1) reconstituer la γ-sécrétase dans la levure, 2) effectuer un test in vitro de la γ-sécrétase à l’aide de microsomes de levure, et 3-5) cribler les mutations de la γ-sécrétase et les régulateurs chimiques dans la levure.

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Protocole

1. Mesure de l’activité de la γ-sécrétase à l’aide d’un système rapporteur de levure

  1. Transformer les plasmides (Tableau 1) en souche de levure PJ-69-4A (Tableau 2) en utilisant la méthode standard de l’acétate de lithium pour exprimer la γ-sécrétase et son substrat14. Pour reconstituer la réaction de clivage, transformez trois plasmides : deux pour la γ-sécrétase et un pour le substrat. Sélectionner des transformants sur milieu gélosé SC dépourvu de Leu, Trp et Ura (SC-LWU).
  2. Pour évaluer le clivage du substrat en fonction de la croissance, striez les souches de levure sur un milieu SC-LWU également dépourvu d’histidine et d’adénine (SC-LWHUAde) et incubez à 30 °C pendant 3 jours.
  3. Utilisez la taille de la colonie pour évaluer les niveaux d’expression de HIS3 et ADE2. Évaluez la taille de la colonie comme suit : +++ représente une croissance de type sauvage avec des colonies de plus de 1 mm, - représente aucune croissance, et ++ ou + représente une croissance partielle avec des colonies de plus de 0,5 mm ou de moins de 0,5 mm, respectivement. L’expression de ces gènes est une mesure indirecte de l’activité de la γ-sécrétase (Figure 1).
  4. Pour évaluer le clivage du substrat par l’activité de la β-galactosidase, c’est-à-dire le niveau d’expression de lacZ (Figure 1), cultiver des souches dans un milieu SC-LWU à 30 °C jusqu’à ce que la culture atteigne une concentration de 1 x 107 cellules/mL, ce qui correspond à une DO600 de 0,8-1,0.
    1. Prélever les cellules d’une culture de 1,5 mL par centrifugation dans un tube de 1,5 mL à 21 100 x g pendant 3 min à 4 °C, laver avec 100 μL d’eau glacée et remettre en suspension dans 30 μL de tampon D (20 mM Tris/Cl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 % de glycérol) avec 1 mM de dithiothréitol (DTT) et des cocktails d’inhibiteurs de protéase PIs/eau (solution 1000x : 1 M de p-aminobenzamidine (pABA), 1 mg/mL d’antidouleur, 1 mg/mL d’aprotinine, 1 mg/mL de leupeptine) et PIs/DMSO (solution 1000x : 1 M de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,1 M de N-p-Tosl-L-phénylalanine chlorométhylcétone (TPCK), 1 mg/mL de chymostatine, 1 mg/mL de pepstatine).
    2. Ajoutez une perle de verre lavée à l’acide juste sous la surface de la solution et lysez les cellules en faisant tourbillonner le mélange 10x à vitesse maximale pendant 1 minute tout en le plaçant sur de la glace à 1 minute d’intervalle.
    3. Centrifuger les cellules lysées à 21 100 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant sous forme de lysat brut.
    4. Préparez le mélange réactionnel avec 5 à 10 μL de lysat brut et 0,4 mL de tampon Z (40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4). Commencer la réaction en ajoutant 80 μL de solution d’o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) à 0,4 %, puis incuber à 37 °C jusqu’à ce que la solution devienne jaune pâle en raison de la formation de nitrophénol.
    5. Arrêter la réaction en ajoutant 0,2 mL de solution de 1 M Na2CO3 et mesurer l’absorbance à 420 nm pour calculer l’activité de la β-galactosidase.
    6. Quantifier les concentrations de protéines dans les lysats bruts à l’aide d’un kit de dosage des protéines, basé sur la méthode de Bradford utilisant l’albumine sérique bovine (BSA) comme norme. Préparez le réactif de colorant en diluant 1 partie du colorant avec 4 parties d’eau désionisée doublement distillée (DDI).
    7. Mélangez 1 à 5 μL de solution de lysat ou de BSA avec 100 μL de colorant dilué dans un puits de plaque de microtitration. Incuber à température ambiante pendant 5 min et mesurer l’absorbance à 595 nm. Déterminez la concentration en protéines à partir de la courbe standard BSA.
      unité β-galactosidase = (1 000 x A420) / (t x c x V)
      où t = temps d’incubation, c = concentration en protéines (mg/mL), V = volume de lysat dans l’essai (mL). Une unité de β-galactosidase est définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour hydrolyser 1 μmol d’ONPG afin de produire de l’o-nitrophénol et du D-galactose par minute et par mg de protéines.
  5. Pour confirmer l’expression des sous-unités de la γ-sécrétase et des substrats, cultiver les souches dans un milieu SC-LWU à 30 °C jusqu’à ce que la culture atteigne OD600 0,8-1,0.
    1. Récolter les cellules d’une culture de 10 mL par centrifugation dans un tube de 50 mL à 2 100 x g pendant 10 min à 4 °C, laver avec 1 mL d’eau glacée puis procéder à une centrifugation dans un tube de 1,5 mL à 21 100 x g pendant 3 min à 4 °C, et remettre en suspension dans 100 μL de tampon B88 (20 mM Hepes/KOH (pH 6,8), 250 mM de sorbitol, 150 mM de KOAc, 5 mM de Mg(OAc)2) avec 1 mM de DTT et les cocktails inhibiteurs de protéase, les IPs/eau et les IPs/DMSO.
    2. Ajoutez des billes de verre juste sous la surface de la solution et lysez la cellule en tourbillonnant 10x à vitesse maximale pendant 1 min tout en gardant le mélange sur de la glace pendant 1 min d’intervalle.
    3. Centrifuger les lysats à 845 x g pendant 2 min à 4 °C et recueillir le surnageant sous forme de lysat total qui contient la fraction membranaire.
    4. Mélangez 100 μL de lysat total avec 96 mg d’urée et 40 μL de tampon d’échantillon 6x SDS (0,4 M Tris/Cl (pH 6,8), 12 % SDS, 0,6M DTT, 0,05 % de bleu de bromophénol, 50 % de glycérol) et incubez à 65 °C pendant 10 min. L’ajout d’urée est nécessaire pour empêcher l’agrégation de la préséniline.
    5. Analysez l’expression de la γ-sécrétase et de ses substrats en analysant des échantillons sur des gels de polyacrylamide Tris/Glycine à 12,5 % et en immunobuvardant.
    6. Détecter la γ-sécrétase et ses substrats par des anticorps dirigés contre la préséniline, la nicastrine, Aph1, Gal4, FLAG, HA ou Pgk1 (contrôle de la charge), et l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) contre les IgG de souris (pour FLAG, HA et Pgk1), les IgG de lapin (pour la préséniline, Aph1 et Gal4) ou les IgG de cobaye (pour la nicastrine).
    7. Pour la détection des chimiluminescences, mélanger la solution A (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 1,25 mM de luminol, 0,02 mM d’acide p-coumarique) avec la solution B (50 mM de Tris/Cl (pH 8,5), 0,009 % H2O2) immédiatement avant l’utilisation. Incuber le tampon dans un volume suffisant du mélange pendant 1 min. Le volume requis dépend de la taille du transfert ; pour une tache de 10 cm x 6 cm, 4 mL sont utilisés. Développez le blot et quantifiez l’intensité du signal à l’aide de l’analyseur d’images luminescentes.

2. Mesure de la production d’Aβ par dosage in vitro de microsomes

  1. Transformez les plasmides APP C55, APP C99 ou γ-sécrétase (tableau 1) en souche de levure PJ-69-4A pep4Δ comme décrit à l’étape 1.1. pour exprimer la γ-sécrétase et son substrat séparément (tableau 2 ; souches γ311, γ312 et γ313)14. Sélectionner les souches C55 et C99 sur le milieu gélosé SC-U et la souche γ-sécrétase sur le milieu gélosé SC-LW.
  2. Isolez les microsomes de souches de levure exprimant l’APP C55, l’APP C99 ou la γ-sécrétase selon le protocole standard11. Séparez les microsomes par centrifugation à gradient de densité de saccharose et récupérez-les à l’interface entre 1,2 M et 1,5 M de saccharose à l’aide d’une pipette en plastique jetable. Déterminez la concentration en protéines dans les microsomes en mesurant l’absorbance à 260 nm après les avoir solubilisés dans 0,2 % de SDS.
  3. Préparez le mélange réactionnel avec deux microsomes, c’est-à-dire APPC55 ou γ-sécrétase, contenant chacun 40 μg de protéines et γ-tampon (50 mM PIPES/KOH (pH 7,0), 250 mM de saccharose, 1 mM d’EGTA) dans un volume final de 12,5 μL. Solubiliser en mélangeant avec un volume égal (12,5 μL) de 2 % de CHAPSO dans un tampon γ et incuber dans 1 % de CHAPSO pendant 1 h.
  4. Pour amorcer la réaction, diluer les mélanges quatre fois jusqu’à ce qu’ils atteignent un volume final de 100 μL à l’aide d’un tampon γ contenant 1 mélange d’inhibiteurs de protéase (PI) : 50 μM de diisopropylfluorophosphate (DIFP), 50 μM PMSF, 0,1 μg/mL de N α-p-tosyl-L-lysine chlorométhylcétone (TLCK), 0,1 μg/mL d’antidouleur, 0,1 μg/mL de leupeptine, 0,1 mM d’EGTA, 1 mM de thiolphan et 5 mM de phénanthroline (PNT) à 0,25 % de CHAPSO avec 400 μg/mL de protéines. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 24 h. Si nécessaire, ajoutez 0,1 % de phosphatidylcholine (PC), 10 μM L685,458 ou DAPT (inhibiteurs de la γ-sécrétase).
  5. Arrêtez la réaction en ajoutant 500 μL de chloroforme/méthanol (2:1) et incubez pendant 1 h avec vortex par intermittence. Ajouter 900 μL de méthanol, mélanger et centrifuger à 21 100 x g pendant 15 min pour recueillir les peptides Aβ dans la pastille.
  6. Lavez la pastille avec 500 μL de chloroforme/méthanol/eau (1:2:0,8), laissez-la sécher à l’air, suspendez-la dans 40 μL de tampon d’échantillon SDS et faites bouillir le mélange pendant 10 min. Analysez la production d’Aβ en analysant des échantillons sur un gel de polyacrylamide Tris/Tricine à 16,5 %. Pour identifier les formes Aβ, utilisez un gel de polyacrylamide 10 % Tris/Tricine avec 8 M d’urée (pH 8,45).
  7. Détecter l’Aβ par immunotransfert à l’aide de l’anticorps 82E1 spécifique du site Asp-1 de l’Aβ humain et de l’anticorps secondaire conjugué à la HRP contre les IgG de souris. Pour la détection par chimiluminescence, mélanger des quantités égales de solutions A et B immédiatement avant l’utilisation, comme décrit à l’étape 1.5.7, et incuber le transfert dans un volume suffisant du mélange pendant 1 min. Le volume requis dépend de la taille du transfert ; pour une tache de 10 cm x 6 cm, 4 mL sont utilisés.
  8. Développez le blot et quantifiez l’intensité du signal à l’aide de l’analyseur d’images luminescentes.

3. Dépistage des mutations de la γ-sécrétase ou de l’APP à effet modulateur

  1. Pour générer des mutations aléatoires par PCR sujette aux erreurs, concevez des amorces pour incorporer des régions chevauchantes de 40 pb du gène d’intérêt à l’extrémité 5' de chaque amorce.
  2. Préparez 50 μL de réaction PCR sujette aux erreurs dans 1 tampon Taq avec 50 ng d’ADN matrice, 0,2 mM de dGTP, 1 mM de dATP/dTTP/dCTP, 3 mM de MgCl2, 0,5 mM de MnCl2, 1,25 U Taq polymérase et 400 nM d’amorces. Utilisez le protocole PCR suivant : 94 °C pendant 5 min, suivi de 30 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 120 s, se terminant par 72 °C pendant 10 min. Ce paramètre produit un taux de mutation approximatif de 1,9 mutations par kilobase10.
  3. Transformer les fragments d’ADN mutagénisés (4 μg) avec de l’ADN plasmidique linéarisé (4 μg) en souche de levure PJ69-4A contenant des mutations FAD APP ou PS114. Le chevauchement de 40 pb dans les amorces facilite la recombinaison homologue entre les fragments dans la levure, conduisant à la reconstruction du plasmide. Sélectionnez les transformants sur les plaques SC-LWU comme décrit à l’étape 1.1.
  4. Comptez les transformants sur les plaques SC-LWU et reproduisez-les sur les plaques SC-LWHUAde à l’aide de velours. Pour répliquer, appuyez la plaque transformante sur un bloc cylindrique recouvert de velours, puis appuyez sur le velours avec une nouvelle plaque SC-LWHUAde pour transférer les colonies. Les souches exprimant des mutants FAD APP ou PS1 se développent mal sur SC-LWHUAde, tandis que celles avec des mutations modulatrices présentent une croissance robuste et forment des colonies.
  5. Pour récupérer l’ADN plasmidique des clones positifs, cultivez les souches dans 3 mL de milieu SC-LWU pendant une nuit à 30 °C jusqu’àOD 600 >1,0. Centrifuger les cellules dans un tube de 15 mL à 2 100 x g pendant 10 min à 4 °C, laver avec 0,8 mL d’eau glacée puis procéder à une centrifugation dans un tube de 1,5 mL à 21 100 x g pendant 3 min à 4 °C, puis remettre en suspension dans 0,3 mL de solution de lyse (10 mM Tris/Cl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 % Triton X-100, 1 % SDS).
  6. Lyser les cellules en ajoutant 0,3 mL de phénol :chloroforme-alcool isoamylique (25:24:1) et 0,3 g de billes de verre. Vortex à vitesse maximale pendant 10 min, puis centrifuger à 21 100 x g pendant 10 min à température ambiante.
  7. Après centrifugation, l’échantillon se sépare en une phase aqueuse supérieure et une phase phénolique inférieure. Récupérer la phase aqueuse et mélanger avec 30 μL d’acétate de sodium 3 M et 700 μL d’éthanol à 100 %. Évitez de prendre des matériaux sur l’interphase.
  8. Centrifuger la solution à 21 100 x g pendant 10 min à 4 °C, laver la pastille avec de l’éthanol à 70 %, la faire sécher à l’air libre et la remettre en suspension dans 15 μL de tampon TE.
  9. Étant donné que la concentration d’ADN plasmidique est généralement trop faible pour une analyse plus approfondie, il est nécessaire de l’amplifier chez E. coli. Transformer l’ADN plasmidique en E. coli DH5α par des méthodes de transformation à haute efficacité15 et le purifier pour une analyse plus approfondie. Identifier les mutations par séquençage de l’ADN à l’aide de la méthode de Sanger16.
  10. Cette méthode est applicable aux plasmides mutagénisés préparés par différentes méthodes (comme aux étapes 3.1 et 3.2). Si vous ciblez des régions protéiques spécifiques, concevez des amorces de PCR inverses avec des nucléotides aléatoires. Après PCR et ligature pour circulariser l’ADN plasmidique, une banque de plasmides mutagénisés est obtenue. Introduisez des mutations spécifiques à l’aide du kit de mutagénèse spécifique au site.

4. Dépistage de l’inhibiteur de la γ-sécrétase (GSI) chez la levure

  1. Utilisez le criblage chimique à haut débit de GSI développé sur la base de la croissance de levure ou du dosage de la β-galactosidase, comme décrit ci-dessous.
  2. Effectuer un dépistage GSI avec des souches de levure γ124, γ126 et γ190 (tableau 2). Sélectionner des candidats GSI en tant que composés qui réduisent la croissance ou l’activité de la β-galactosidase de la γ-sécrétase de type sauvage sur APP (γ124) et/ou Notch (γ126) (tableau 3).
  3. Sélectionnez des GSI spécifiques à l’APP ou à l’encoche. Exclure les composés toxiques en contre-criblage avec l’expression soluble de Gal4. Les candidats GSI ne devraient pas affecter la croissance ou l’activité de la β-galactosidase de la souche témoin Gal4 (γ190) (tableau 3).
  4. Pour l’essai de croissance, cultiver des souches dans un milieu SC-LWHUAde contenant des GSI potentiels dans des plaques de 384 puits à partir de DO600 de 0,03. Incuber toute la nuit à 30 °C sans secouer. Surveiller la croissance après 24 h à l’aide d’OD600.
  5. Pour les essais de β-galactosidase dans un format de 384 puits, cultiver des souches à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans un milieu SC-LWU contenant des GSI potentiels. Lyser les cellules à l’aide du système de dosage Beta-Glo et mesurer l’activité de la β-galactosidase en utilisant la 6-o-β-galactopyranosyl-luciférine comme substrat selon le protocole du fabricant.
  6. Pour les candidats GSI, mesurer la production d’Aβ par dosage in vitro de microsomes pour confirmer l’effet inhibiteur.

5. Criblage du modulateur de la γ-sécrétase (GSM) chez la levure

  1. Utilisez le criblage chimique à haut débit du GSM, qui a été mis au point sur la base de la croissance de levure ou du dosage de la β-galactosidase, comme décrit ci-dessous.
  2. Effectuer un criblage GSM avec des souches de levure γ106, γ112 et γ5 (tableau 2). Sélectionner des candidats GSM en tant que composés qui améliorent la croissance ou l’activité de la β-galactosidase des souches mutantes FAD PS1 (γ106 et γ112) ou FAD APP (tableau 4). Exclure les substances chimiques activatrices rapporteures non spécifiques en effectuant un contre-criblage avec la souche sans sous-unité catalytique de γ sécrétase. Les candidats GSM ne devraient pas affecter la croissance ou l’activité de la β-galactosidase de la souche témoin sans PS1 (γ5) (Tableau 4).
  3. Pour l’essai de croissance, cultiver des souches dans un milieu SC-LWHUAde contenant des GSM potentiels dans des plaques à 384 puits à partir deDO 600 de 0,03. Incuber toute la nuit à 30 °C sans secouer. Surveiller la croissance après 48 h par OD600.
  4. Pour les dosages de β-galactosidase dans un format de 384 puits, cultiver des souches à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans un milieu SC-LWU contenant des GSM potentiels. Lyser les cellules à l’aide du système de dosage Beta-Glo et mesurer l’activité de la β-galactosidase en utilisant la 6-o-β-galactopyranosyl-luciférine comme substrat conformément au protocole du fabricant.
  5. Pour les candidats GSM, mesurer la production d’Aβ par dosage in vitro de microsomes pour confirmer l’effet modulateur, c’est-à-dire la réduction des formes toxiques Aβ Aβ42 et Aβ43.

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Résultats

En utilisant les techniques décrites jusqu’à présent, nous avons analysé les gènes, les mutations, les produits chimiques et les peptides en tant que facteurs qui affectent l’activité de la γ-sécrétase 10,11,12,13,17,18,19. Le criblage de gènes et de mutatio...

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Discussion

Étapes critiques du protocole et dépannage
La reconstitution de la γ-sécrétase chez la levure à l’aide de méthodes génétiques et biochimiques est relativement simple, mais il y a quelques étapes essentielles pour assurer le succès.

Au cours de la transformation de la levure (étapes 1.1, 2.1 et 3.3), plusieurs plasmides doivent être introduits : deux pour les composants de la γ-sécrétase et un pour les substrats. Une transformation séquentie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI numéro de subvention 22K06121. Les auteurs souhaitent remercier les membres du Laboratoire d’enzymologie de l’Université de Tohoku pour leur soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< fort>Anticorps
anti-Amylöïde & bêta ; (N) (82E1) anticorpsIBLCat# 10323
anticorps Aph1a, 245-265 (C terminus)BioLegendCat# 823101
Anticorps anti-FLAG (M2)SigmaCat# F3165
Anticorps anti-Gal4SigmaCat# G9293
Anticorps anti-HA (12CA5)SigmaCat# 11 583 816 001
Anticorps anti-NicastrineChemiconCat# AB5890
anticorps anti-PGK1 (22C5D8)AbcamCat# ab197960
anticorps anti-PS1 N-terminus (G1Nr) ou anticorps en boucle (GIL)Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205
anti-lapin  ; IgG, anticorps lié à HRPSignalisation cellulaireCat# 7074
anti-cochon d’Inde IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologieCat# sc-2438
anti-souris IgG, anticorps lié à HRPSignalisation cellulaireCat# 7076
Souches bactériennes et de levures
E. coli DH5 & alpha ;InvitrogenCat# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4AJames P. et al., Génétique 144:1425-1436 (1996)
< fort > Produits chimiques, peptides, protéines recombinantes
(3,5-Difluorophénylacétyl)-Ala-Phg-OBut (DAPT)Institut des PeptidesCat# 3219-v
Protéine amyloïde &bêta (Humain, 1-38)Institut des PeptidesCat# 4484-v
Protéine amyloïde &bêta (Humain, 1-40)Institut des PeptidesCat# 4307-v
Protéine amyloïde &bêta (Humain, 1-42)Institut des PeptidesCat# 4349-v
Protéine amyloïde &bêta (Humain, 1-43)Institut des PeptidesCat# 4370-v
Antidouleur, dihydrochlorureInstitut des PeptidesCat# 4062
aprotinineSigmaCat# A1153
CHAPSODojindoCat# 343-05163
ChymostatineSigmaCat# C7268
Diisopropyl fluorophosphate (DIFP)Wako chimiqueCat# 049-18921
L685 458Institut des PeptidesCat# 4394-v
LeupeptinInstitut des PeptidesCat# 4041
N-p-Tosyl-L-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK)SigmaCat# T4376
N&alpha ; -p-tosyl-L-lysine chlorométhyl cétone (TLCK)SigmaCat# T7254
o-nitrophényl-&bêta ;-D-galactopyranoside (ONPG)SigmaCat# N1127
p-aminobenzamidine (pABA), dihydrochlorureSigmaCat# 857661
Pepstatine ASigmaCat# P5318
Phénanthroline (PNT)SigmaCat# P9375
Phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF)SigmaCat# P7626
phosphatidylcholine (PC), jaune d’œuf, type XVI-ESigmaCat# P3556
ADN polymérase TaqTakaraCat# R001A
ThiolphanSigmaCat# T6031
< Strong > Kits de test commerciaux, autres matériaux et instruments
Système d’analyse bêta-gloPromegaCat# E4720
Kit de test de protéines Bio-RadBio-RadCat# 5000001
Des perles de verre, lavées à l’acide (425-600 & mu ; m)SigmaCat# G8772
ImageQuant LAS4000GE HealthcareImageQuant LAS4000
QuikChange Kit de Mutagenèse Dirigé par le SiteAgilentCat# 200518

Références

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