Article de méthode

Tests de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1

DOI :

10.3791/67745

⸱

28 février 2025

 ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude fournit un protocole pour évaluer l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le capteur microbien SLAMF1. Les tests ont été effectués sur des macrophages dérivés de monocytes humains à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie à fluorescence. Les outils décrits sont pertinents pour étudier les interactions entre les agents pathogènes et les immunorécepteurs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’évaluation de l’interaction directe entre les agents pathogènes et les récepteurs immunitaires fait généralement appel à des techniques sophistiquées ou implique l’utilisation de souches transgéniques et de cellules génétiquement modifiées. Ici, une méthode alternative pour détecter l’interaction biochimique entre le capteur microbien de macrophage SLAMF1 et Mycobacterium tuberculosis est décrite. Deux approches techniques utilisant la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence ont été développées. Des extraits de protéines cellulaires totales de macrophages humains ont été générés, puis incubés avec des cellules entières de M. tuberculosis (WCMtb) ou d’antigènes de M. tuberculosis (Mtb Ags) pendant une nuit à 4 °C et enfin réticulés à l’aide d’un traitement au formaldéhyde/glycine/éthylène glycol bis (succinimidyl succinate). L’interaction de SLAMF1 avec WCMtb par cytométrie en flux a été détectée avec un anticorps anti-SLAMF1 spécifique du PE. L’existence d’une interaction par microscopie à fluorescence a été réalisée en fixant des Mtb Ags colorés à la rhodamine-PE à des lames enrobées de poly-D-lysine, qui ont été incubées avec l’extrait protéique total de macrophages dérivés de monocytes. Après le traitement de réticulation, SLAMF1 a été visualisé à l’aide d’anticorps primaires (anti-SLAMF1) et secondaires (Alexa Fluor 488). Les tests ont fourni un outil biochimique puissant pour mesurer les interactions entre les agents pathogènes et les immunorécepteurs, surmontant les difficultés associées aux lignées cellulaires transgéniques et aux expériences de modulation de l’expression génique des protéines.

Introduction

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Mycobacterium tuberculosis, l’agent pathogène responsable de la tuberculose identifié il y a 142 ans, reste un défi mondial, infectant actuellement au moins un quart de la population mondiale1. Transmise par des gouttelettes en suspension dans l’air provenant de personnes infectées, M. tuberculosis atteint les macrophages alvéolaires dans les poumons où elle peut survivre pendant de longues périodes à l’état latent 2,3. Non seulement la réponse macrophagique locale est activée, mais ces dernières années, il a été décrit que les monocytes périphériques peuvent être recrutés dans les voies respiratoires et se différencier en macrophages alvéolaires, générant une réponse encore plus robuste contre M. tuberculosis que leur homologue d’origine fœtale2,4.

Les macrophages sont des acteurs fondamentaux de l’immunité innée. Lors de l’ingestion de M. tuberculosis, les macrophages présentent de nombreuses fonctions microbicides, telles que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, la fusion du phagolysosome et l’activation d’autres cellules immunitaires afin de tuer M. tuberculosis 2,3. Cependant, la structure architecturale complexe de cet agent pathogène fournit des effecteurs (par exemple, des protéines et des lipides) capables de réguler le métabolisme et les fonctions des macrophages et, par conséquent, le processus inflammatoire3. Cette manipulation des réponses des macrophages, par la sécrétion de facteurs de virulence ou l’exploitation de facteurs de l’hôte, conduit à différentes stratégies d’évasion exercées par M. tuberculosis. Certains mécanismes d’évasion clés comprennent l’induction de cytokines anti-inflammatoires, l’inhibition de la maturation et de l’acidification des phagolysosomes, les altérations du stress oxydatif, la perturbation de l’autophagie et les déficiences lors du traitement et de la présentation de l’antigène 3,5.

Une interaction étroitement régulée entre les macrophages et M. tuberculosis est cruciale pour le développement d’une réponse immunitaire appropriée. Par conséquent, l’étude de ces synapses est essentielle pour identifier les mécanismes immunoprotecteurs ou immunopathogènes induits par la diaphonie hôte-pathogène, ainsi que pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De nombreux récepteurs interviennent dans la reconnaissance et/ou l’internalisation de M. tuberculosis, notamment les TLR 6,7,8, les NLR 7,8, les récepteurs du complément 6,8, les récepteurs de la lectine de type C 6,8 et les récepteurs de piégeage 6,8. L’accumulation de données indique que les PRR liés à la surface et intracellulaires jouent un rôle important pendant l’infection, reconnaissant M. tuberculosis opsonisé et non opsonisé.

Zihad et Sifat et al. ont récemment examiné la participation des PRR dans les réponses induites par M. tuberculosis par les cellules innées9. En particulier, la plupart des membres de la famille TLR ont été impliqués dans l’interaction avec les ligands 6,7 de M. tuberculosis. La surface TLR2 reconnaît les antigènes mycobactériens tels que les lipoprotéines acylées, les lipoprotéines 19 kDa, les lipoprotéines LprA, les lipoprotéines LprG, les antigènes 30 kDa, les antigènes 38 kDa, MymA, la proline-proline-acide glutamique (PPE)-57, LAM, LM, PIM, la protéine de choc thermique 60, la protéine signature Rv1509 et la protéine sécrétée ESAT-67. La membrane TLR4 interagit avec les protéines de choc thermique, l’antigène 38-kDa, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE et HBHA. D’autre part, les ligands des TLR endosomaux (TLR 3, 7, 8 et 9) comprennent l’ARNdb, l’ARNt, l’ARNss, l’ARN phagosomal et l’ADNdb de M. tuberculosis. De plus, TLR2 joue un rôle actif dans l’initiation des réponses immunitaires lorsqu’il agit en conjonction avec TLR1 et TLR6, TLR4 et TLR9 6,7. NOD2 et NLRP3 sont les NLR cytoplasmiques les mieux caractérisés dans la tuberculose. Bien que leurs ligands spécifiques restent à l’étude, ces récepteurs sont activés par le dipeptide muramyle ou ESAT-6, respectivement 7,8. Les récepteurs de lectine de type C sont classiquement impliqués dans l’endocytose de M. tuberculosis. Alors que Dectin-2 agit comme un PRR direct pour ManLAM de la paroi cellulaire de M. tuberculosis, le ligand Dectin-1 n’a pas encore été découvert8. Mincle et MCL reconnaissent tous deux le glycolipide tréhalose-6,6′-dimycolate (TDM), également appelé facteurde cordon 7. Le DCAR interagit avec les glycolipides mycobactériens phosphatidyl-myo-inositol mannosides (PIMs)7. CR3 reconnaît les bactéries mycobactériennes LAM et PIM, DC-SIGN ligère ManLAM, MR reconnaît un certain nombre de composants de M. tuberculosis, y compris ManLAM, PIM, LM, la glycoprotéine 38-kDa, l’antigène 19-kDa et d’autres protéines mannosylées, tandis que le ligand DCIR n’est pas encore identifié.

Les CLR solubles comprennent SP-A, qui reconnaît ManLam, LM, la glycoprotéine 60 kDa et la glycoprotéine Apa ; SP-D interagissant avec LAM, LM et PILAM ; et MBL, qui se spécialise dans la reconnaissance ManLAM 6,7. Les récepteurs piégeurs sont également des PRR phagocytaires. SR-A et MARCO ont TDM comme ligand, SR-B1 reconnaît ESAT-6 et CD36 se lie à ManLAM et LM 7,8. De plus, Dectin-1, Mincle et MARCO peuvent également se combiner avec TLR2 ou TLR4 pour déclencher des signaux après la détection de M. tuberculosis PAMPs 6,7. CD14 est un récepteur de surface qui a la capacité d’internaliser les bactéries non opsonisées et reconnaît également la protéine de choc thermique Chaperonin 60.1. En particulier, CD14 fonctionne comme un corécepteur avec MARCO et TLR26. AIM2 est un récepteur cytosolique qui peut détecter l’ADNsb lorsque M. tuberculosis s’échappe du phagosome8. Enfin, AhR est un facteur de transcription activé par un ligand qui se lie au facteur de virulence pigmenté naphthoquinone phthiocol de M. tuberculosis6.

Bon nombre des interactions décrites ci-dessus ont été postulées et n’ont pas été strictement démontrées. Même les ligands de certains récepteurs restent inconnus, ce qui renforce la nécessité de mieux comprendre le domaine de l’immunoreconnaissance de M. tuberculosis. Dans ce contexte, la molécule de costimulation SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) a récemment été décrite comme un récepteur de M. tuberculosis par Barbero et al.10. En agissant non seulement comme une molécule de signalisation, mais aussi comme un capteur de M. tuberculosis, SLAMF1 joue un rôle particulièrement intriguant dans la tuberculose. SLAMF1 peut induire l’activation des cellules immunitaires en modulant des fonctions protectrices telles que la production d’IFN-γ par les lymphocytes T par phosphorylation Erk/CREB 11,12,13, l’autophagie dans les neutrophiles 14 et la clairance bactérienne dans les macrophages15.

Les interactions récepteurs-ligands ont été étudiées au fil des ans à l’aide de techniques telles que l’ELISA, la résonance plasmonique de surface (SPR), la titration calorimétrique isotherme (ITC), la polarisation de fluorescence (FP), la cristallographie aux rayons X, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la thermophorèse à l’échelle microscopique (MST), la microscopie confocale par transfert d’énergie de résonance (par exemple, BRET ou FRET), la microscopie électronique, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et la microscopie à force atomique (AFM)16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Certaines de ces approches impliquent l’utilisation de gènes rapporteurs, de protéines recombinantes marquées ou de molécules chimériques, de modèles de knock-out, knockdown ou de surexpression. Alternativement, les outils informatiques peuvent prédire les interactions récepteur-ligand et les sites de liaison et sont souvent utilisés en combinaison avec des approches biologiques pour obtenir une compréhension complète des interactions 29,30,31. Ici, deux alternatives pour détecter les interactions biochimiques ainsi qu’une section sur la façon de marquer les bactéries par fluorescence sont décrites. Un protocole permettant d’étudier les interactions récepteur-pathogène in vitro est présenté, évaluant notamment l’engagement de SLAMF1-M. tuberculosis par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence, deux techniques généralement disponibles et couramment utilisées.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des macrophages dérivés de monocytes humains ont été effectuées conformément à la Déclaration d’Helsinki (2013) et en accord avec le Comité d’éthique de l’UNNOBA (COENOBA). Un consentement éclairé écrit a été obtenu avant le prélèvement de l’échantillon. La répartition hommes/femmes était de 13/6 et l’âge médian était de 32 ans, avec un écart interquartile (IQR) de 18 à 75 ans. La présence de pathologies antérieures, de comorbidités ou d’un diagnostic positif de tuberculose ont été définies comme critères d’exclusion. Les détails des réactifs et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture et stimulation de macrophages dérivés de monocytes

  1. Prise de sang
    1. Prélever 60 ml de sang de donneurs sains par ponction veineuse dans une seringue héparinisée.
      REMARQUE : L’extraction de sang doit être effectuée par un biochimiste ou un technicien en phlébotomie.
    2. Jetez l’aiguille dans le contenant d’élimination des objets tranchants et tranchants et tout matériel qui a été en contact avec le sang des donneurs dans le contenant des déchets pathologiques.
  2. Isolement des monocytes et génération de macrophages
    1. Transférez soigneusement le sang dans des tubes de 50 ml et diluez-le de moitié avec une solution saline.
    2. Effectuer une centrifugation sur un milieu à gradient de densité pour obtenir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC).
    3. Récupérez les PBMC du halo blanchâtre.
    4. Effectuez deux lavages avec une solution saline à 400 x g pendant 10 min et un dernier lavage à 200 x g pendant 15 min à 20 °C pour éliminer les plaquettes.
    5. Déterminez le nombre de PBMC dans une chambre de comptage de cellules et effectuez une sélection magnétique positive CD14 avec des billes CD14.
      REMARQUE : Lors de la sélection magnétique, suivez attentivement les instructions du fabricant. De plus, on peut vérifier la pureté des monocytes isolés à l’aide de la cytométrie en flux.
    6. Remettez en suspension les cellules isolées dans RPMI 1640 et déterminez le nombre de monocytes dans une chambre de comptage cellulaire.
    7. Grainez 500 μL de monocytes sélectionnés CD14 positifs de 1 ×10 6/mL par puits dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits en l’absence de sérum pour favoriser l’observance.
    8. Après 2 h, éliminez les cellules non adhérentes en les lavant avec du RPMI 1640 préchauffé.
    9. Pour différencier les macrophages, cultivez les monocytes adhérents pendant 16 à 18 h supplémentaires (toute la nuit) dans 1 mL de milieu complet (milieu RPMI 1640 complété par de la L-glutamine, 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
    10. Le lendemain, changez de milieu de culture. Retirez le milieu, lavez-le avec 1 ml de 1x PBS et ajoutez 1 ml de support complet.
    11. Stimulez les macrophages avec des antigènes sonicés de M. tuberculosis (antigènes de M. tuberculosis (Ags)) pendant 24 h. Utiliser 10 μL d’Ags de M. tuberculosis (10 μL = 1 × 106 bactéries) par 1 × 106 macrophages dérivés de monocytes.
      REMARQUE : 10 μL de M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 bactéries, quantifiées par D.E. 600nm dans le spectrophotomètre en considérant un D.E. de 1 comme 1 x 108 bactéries/mL. Utilisez des enceintes de biosécurité BSL2 et un incubateur à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 pour toutes les étapes de culture.
  3. Corroboration de l’expression de SLAMF1
    1. Collectez les macrophages à partir d’un seul puits. Placez la plaque de culture sur une surface froide. Détachez les cellules en utilisant des mouvements de haut en bas en ajoutant 1 mL de FACS froid (1x PBS + 2 % FBS) deux fois de suite. Utilisez un tube de cytométrie à fond rond pour le prélèvement.
    2. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant en le jetant.
    3. Colorez les cellules avec un anticorps anti-humain SLAMF1 couplé à un fluorophore pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Vortex après avoir ajouté 1,25 μL de l’anticorps.
    4. Lavez les cellules pour éliminer l’excès d’anticorps à l’aide de FACS, remettez la pastille en suspension dans FACS et acquérez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux.
      REMARQUE : 1,25 μL d’anticorps anti-SLAMF1 correspond à 0,0625 μg utilisé pour marquer 0,5 x 106 macrophages. Cependant, le titrage de l’anticorps est fortement recommandé, ainsi que la réalisation de l’isotype correspondant ou du contrôle de la fluorescence moins un (FMO).

2. Préparation de l’extrait de protéines cellulaires totales

  1. Préparation du tampon de lyse
    1. Préparer un tampon RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay) avec du NaCl 150 mM, du Tris 10 mM, de l’EDTA 5 mM, du SDS 1 %, du Triton X-100 1 % et du désoxycholate de sodium 1 %.
    2. Complétez le tampon RIPA avec 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et des inhibiteurs de protéase tels que la pepstatine A et la leupeptine.
  2. Collecte de cellules et isolement de protéines
    1. Jetez l’IPRP complet des puits de plaque à l’aide d’une pipette P1000 et récoltez les macrophages par pipetage ascendant et descendant avec du PBS 1x froid.
    2. Transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Prélever un puits par microtube.
    3. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    4. Ajouter 1 mL de PBS froid et répéter les étapes 2.2.2 et 2.2.3 en recueillant les cellules dans le même tube de microcentrifugation.
    5. Remettre en suspension les granulés de cellules dans 100 μL de 1x PBS et mettre en pool quatre tubes. Répétez l’étape 2.2.3. Chaque tube contiendra 2 x 106 macrophages.
    6. Ajouter 100 μL de tampon RIPA supplémenté et incuber la suspension sur de la glace pendant 1 h, en tourbillonnant toutes les 10 minutes.
    7. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 15 min. Recueillir le surnageant et le conserver jusqu’à ce qu’il soit utilisé à -20 °C.

3. Interaction M. tuberculosis -SLAMF1 par cytométrie en flux

  1. Réticulation protéines-bactéries
    1. Incuber 1 × 106 cellules entières inactivées de M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis inactivées par irradiation gamma) avec un extrait protéique de 1 x 106 macrophages (50 μL) pendant une nuit à 4 °C dans un porte-microtubes rotatif.
      REMARQUE : 10 μL de WCMtb = 1 × 106 bactéries, quantifiées par D.E. 600nm dans le spectrophotomètre en considérant un D.E. de 1 comme 1 x 108 bactéries/mL.
    2. Le lendemain, ajoutez 500 μL de formaldéhyde à 1 % dilué dans 1x PBS. Incuber pendant 15 min sous agitation (agitateur) à température ambiante (RT).
    3. Ajouter 25 μL de glycine 0,125 M diluée dans de l’eau. Incuber pendant 5 min sous agitation (agitateur) à RT.
    4. Laver deux fois avec 1 mL de 1x PBS à 14 000 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant entre les étapes de lavage.
    5. Remettre la pastille en suspension et incuber la suspension dans 500 μL de 2 mM d’éthylène glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS) réticulant dilué dans un mélange 1:1 d’acide acétique glacial :eau pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : La préparation des réactifs au moment de l’utilisation est fortement recommandée. Pour préparer l’EGS, l’acide acétique glacial et l’eau doivent être mélangés dans des proportions égales et chauffés à 70 °C. Si la solution n’est pas chaude, l’EGS n’est pas complètement remis en suspension.
  2. Coloration SLAMF1
    1. Répétez l’étape 3.1.4 en utilisant 500 μL de 1x PBS lors du premier lavage et 1 mL lors du second.
    2. Colorer le complexe protéine-bactérie pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité avec un anticorps anti-humain SLAMF1 (comme à l’étape 1.3.3) en ajoutant l’anticorps dans le microtube et en faisant un vortex. Utilisez la quantité d’anticorps adaptée à 1 x 106 cellules (2,5 μL ou 0,125 μg).
    3. Lavez les cellules pour éliminer l’excès d’anticorps à l’aide de FACS, remettez la pastille en suspension dans FACS et acquérez l’échantillon dans un cytomètre en flux (comme à l’étape 1.3.4).
      REMARQUE : Effectuez la commande d’isotype ou FMO correspondante.

4. Étiquetage des antigènes de M. tuberculosis

  1. Mettre à nouveau en suspension la rhodamine B dans de l’éthanol à une concentration de stock de 5 mg/mL (1000x). Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Ajouter 1 μL de rhodamine B pour 100 μL d’Ags de M. tuberculosis dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  3. Incuber pendant 45 min à RT sous agitation continue (vortex).
  4. Laver au moins 3 fois à 14 000 x g pendant 5 min à 24 °C avec 1 mL de 1x PBS jusqu’à ce que le surnageant soit transparent. Le granulé (Mtb-R Ags) aura l’air rose clair.
  5. Remettre en suspension les Mtb-R Ags dans 100 μL de 1x PBS pour restaurer le volume initial.
    REMARQUE : Travailler dans des conditions stériles est recommandé. Assurez-vous que la coloration est effectuée immédiatement avant d’effectuer les expériences.

5. Interaction M. tuberculosis -SLAMF1 par microscopie à fluorescence

  1. Réticulation bactérie-protéine
    1. Introduire des lamelles rondes de 12 mm dans des plaques de culture à 24 puits (1 lamelle par puits) à l’aide d’une pince à épiler chirurgicale à bec rond.
      REMARQUE : Nettoyez soigneusement les lamelles avec de l’éthanol à 70 %. Si vous le souhaitez, ils peuvent être autoclavés ou stérilisés sous lumière UV pendant 30 min.
    2. Incuber la lamelle avec 400 μL de Poly-D-Lysine à 10 μg/mL pendant une nuit à 4 °C. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière.
    3. Le lendemain, sortez la plaque du réfrigérateur et lavez la lamelle deux fois avec 1 ml d’eau.
    4. Laissez sécher la lamelle.
    5. Diluer 20 μL (2 x 106) de Mtb-R Ags dans 180 μL de 1x PBS. Les 200 μL finaux sont suffisants pour couvrir complètement une lamelle.
    6. Incuber la lamelle avec des Mtb-R Ags pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à cellules.
    7. Jetez le liquide restant et lavez deux fois avec 1 ml de 1x PBS.
      REMARQUE : Dans cette étape, l’adhérence correcte de Mtb-R sur la lamelle de recouvrement peut être vérifiée à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’aide des filtres correspondant au canal rouge.
    8. Ajouter 400 μL de tampon de blocage (10 % FBS dans 1x PBS) pendant 30 min à RT en agitation (agitateur).
    9. Laver deux fois avec 400 μL de tampon de blocage.
    10. Incuber avec 100 μL d’extrait de protéines dilué dans 300 μL de 1x PBS pendant 2 h à RT en agitation (agitateur).
    11. Ajouter 400 μL de formaldéhyde à 1 % dilué dans 1 PBS. Incuber pendant 15 min sous agitation (agitateur) à RT.
    12. Ajouter 500 μL de glycine 0,125 M diluée dans de l’eau. Incuber pendant 5 min sous agitation (agitateur) à RT.
    13. Laver deux fois avec 1 ml de 1x PBS.
    14. Ajouter 400 μL de 2 mM d’EGS pendant 1 h à RT en agitation (agitateur).
    15. Répétez l’étape 5.1.13
      REMARQUE : La préparation des réactifs au moment de l’utilisation est fortement recommandée.
  2. Coloration SLAMF1
    1. Enveloppez le couvercle de la plaque de culture dans un film de paraffine.
    2. Ajouter une goutte de 60 μL d’anticorps primaire anti-SLAMF1 préalablement titré (dilution 1:75) sur le couvercle recouvert d’un film de paraffine.
    3. Retirez délicatement la lamelle de la plaque à l’aide d’une pince à épiler chirurgicale incurvée à pointe fine et d’aiguilles.
      REMARQUE : Pour faciliter le retrait des lamelles, l’aiguille peut être pliée à un angle d’environ 45°.
    4. Retournez la lamelle sur la goutte contenant l’anticorps. Incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
    5. Soulevez la lamelle et lavez-la deux fois avec le tampon de blocage.
    6. Retournez la lamelle sur une nouvelle goutte contenant l’anticorps secondaire (dilution 1:200). Incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
    7. Répétez l’étape 5.2.5.
    8. Retirez l’excès de liquide et montez la lamelle sur une goutte de liquide de montage placée sur une lame de verre.
    9. Observez au microscope à fluorescence à l’aide de filtres adéquats.
      REMARQUE : Travailler dans des conditions stériles est recommandé. Diluez les anticorps dans le tampon de blocage. Manipulez la lamelle avec précaution pour éviter les rayures qui pourraient entraver l’observation au microscope. Un liquide de montage adapté à la fluorescence est fortement recommandé.

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Résultats

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Dans ce travail, un protocole permettant d’évaluer l’interaction de M. tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1 dans les macrophages humains est fourni (Figure 1). À cette fin, du sang périphérique de donneurs sains a été obtenu. Ensuite, les PBMC ont été séparés par centrifugation sur le milieu à gradient de densité, et les monocytes ont été isolés par sélection magnétique positive (pureté de ≥95 %, Figure 2A,B). Les monocytes...

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Discussion

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Cette étude fournit un guide utile pour étudier l’interaction biochimique entre M. tuberculosis et les capteurs microbiens exprimés dans les macrophages humains, un type de cellule clé impliqué dans la réponse de l’hôte pendant la tuberculose. Les protocoles fournis seront pertinents pour décrypter les molécules qui jouent un rôle dans l’entrée de M. tuberculosis dans les phagocytes.

La caractérisation des interactions biomoléculaires, telles...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par l’Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (subventions SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 à V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, subventions PICT-2012-2459 et PICT A 2017-1896 à V.P. et PICT-2021-I-INVI-00584 à A.B.) ; la Fondation Florencio Fiorini ; et Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, numéro de subvention PIO 15720150100010CO à V.P.). Nous remercions Natalia Menite et Gastón Villafañe pour le soutien technique. Nous remercions la Dre Paula Barrionuevo et la Dre Luciana Balboa pour la discussion scientifique qui a donné lieu à la publication et qui a donné lieu au développement des tests présentés dans ce travail. Enfin, nous remercions le Dr Estermann pour ses conseils sur les protocoles de réticulation, Lic. Moroni pour ses conseils sur le travail avec la poly-lysine et la lic. Moriconi pour son aide avec les figures schématiques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps secondaire Alexa Fluor 488InvitrogenN° A21121Pour la microscopie à fluorescence
anticorps anti-SLAMF1 FITC  ;eBiosciences11-1509-42Pour la cytométrie en flux
anticorps anti-SLAMF1 PEBioLégende306308Pour la cytométrie en flux
anticorps primaire anti-SLAMF1  ;BioLégende306302Pour la microscopie à fluorescence
Aqua-Poly/MonturePolysciences18606-20Supports de montage
Microbilles CD14Miltenyi Biotec130-097-052Pour l’isolement des monocytes
Lamelles de recouvrement 12mmHDA-Pour le dosage des interactions par microscopie
EGSThermoFisher Scientific  ;21565Pour le traitement de réticulation
FACSCanto IIBD Biosciences338960Cytomètre en flux avec le logiciel BD FACSDiva
Sérum de Bovin Fœtal  ;Natocor-Inactivé et irradié, pour la culture des macrophages
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144003Pour la séparation des PBMC
Fidji/ImageJLogiciels open source-Pour l’analyse micrographique
FlowJo 7.6.2  ;Étoile d’arbre-Pour l’analyse par cytométrie en flux
FormaldéhydeMerckK47740803613Pour le traitement de réticulation
Glissières en verreVerre Klass-Pour le dosage des interactions par microscopie
GlycineSigmaRéférence G8898Pour le traitement de réticulation
Imageur.A2Carl Zeiss430005-9901-000Microscope à fluorescence avec module d’éclairage Colibri 7
iMarkBIO-RAD1681130Lecteur d’absorbance de microplaques  ;
L-glutamineSigma Aldrich49419Pour la culture des macrophages
M. tuberculosis, souche H37Rv, cellules entières irradiées aux rayons gamma.Ressources BEI, NIAID, NIHNR-14819Pour le test d’interaction
M. tuberculosis, souche H37Rv, lysat à cellules entièresRessources BEI, NIAID, NIHNR-14822Pour la stimulation des macrophages et les essais d’interaction
Neofuge 13RForce de guérisonNeofuge 13RCentrifugeuse réfrigérée à grande vitesse pour l’extraction des protéines
Pénicilline/streptomycineGibco15140122Pour la culture des macrophages
PMSFThermoFisher Scientific36978Pour l’isolement des protéines
Poly-D-lysineSigma AldrichA-003-MPour le traitement des lamelles
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma Aldrich  ;Réf. P8340Pour l’isolement des protéines
Rhodamine B  ;Sigma Aldrich  ;21955Pour la coloration de M. tuberculosis
RPMI 1640Gibco11875093Pour la culture des macrophages
Centrifugeuse Sorvall ST 16/16RThermoFisher Scientific75004240Pour l’isolement des PBMC et des monocytes

Références

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