Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Méthode QuEChERS-HPLC modifiée pour la détection d’hydrocarbures aromatiques polycycliques dans des embryons de poisson-zèbre exposés à des particules fines

1K vues

⸱

DOI :

10.3791/67757

⸱

13 juin 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé une méthode QuEChERS-HPLC modifiée pour évaluer les niveaux internes de 16 HAP dans les embryons de poisson-zèbre.

Résumé

L’exposition maternelle à des particules fines (PM2,5), d’un diamètre aérodynamique de 2,5 m ou moins, a été associée à des avortements spontanés et à diverses maladies congénitales chez l’homme. Cependant, les mécanismes sous-jacents restent flous. Les embryons de poisson-zèbre sont largement utilisés pour étudier la toxicité des PM2,5 pour le développement, mais la mesure des niveaux internes d’hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les principaux constituants toxiques des PM2,5, pose un défi. Dans cette étude, nous avons développé une méthode de chromatographie liquide à haute performance rapide, facile, bon marché, efficace, robuste et sûre (QuEChERS-HPLC) pour évaluer les niveaux internes des 16 HAP répertoriés dans la liste des polluants prioritaires de l’Agence de protection de l’environnement (EPA) des États-Unis. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec de la matière organique extractible (MOE) à partir de PM2,5 pendant 2 à 72 heures après la fécondation (hpf). La méthode QuEChERS a été utilisée pour la préparation des échantillons, et la méthode HPLC-FLD/DAD (HPLC avec détecteur à fluorescence et détecteur à barrettes de diodes) a été utilisée pour les analyses qualitatives et quantitatives des HAP. Nous avons réussi à détecter six HAP (phénanthrène, anthracène, fluorène, acénaphtène, fluoranthène et pyrène) chez des embryons de poisson-zèbre exposés aux PM2,5. Cette méthode est cruciale pour étudier les mécanismes de toxicité pour le développement induite par les PM2,5.

Introduction

Particules fines (PM2,5), d’un diamètre aérodynamique de 2,5 μm ou moins. est un facteur de risque environnemental majeur. En raison de leur petite taille, les PM2,5 sont capables de pénétrer dans le système circulatoire et de pénétrer la barrière materno-fœtale. Des études épidémiologiques ont établi un lien entre l’exposition maternelle aux PM2,5 et l’avortement spontané et diverses maladies congénitales 1,2,3,4. Cependant, les mécanismes sous-jacents de la toxicité embryonnaire des PM2,5 ne sont pas bien compris. Les HAP, principal composant toxique des PM2,5, sont très toxiques pour l’homme en raison de leurs propriétés mutagènes et cancérigènes 5,6. Parmi les centaines de HAP, 16 ont été classés comme polluants hautement prioritaires par l’Agence américaine de protection de l’environnement (EPA).

Le poisson-zèbre, Danio rerio, est un puissant organisme modèle de vertébré en raison de sa similitude génétique avec les humains, de son développement rapide, de son taux de reproduction élevé et de sa facilité d’entretien. La transparence des embryons de poisson-zèbre permet une observation directe de l’ensemble du corps au microscope, ce qui permet des études détaillées. Les HAP dissous peuvent pénétrer dans les embryons de poisson-zèbre par diffusion7. De nombreuses études ont utilisé des embryons de poisson-zèbre pour explorer les effets toxiques et les mécanismes de la matière organique extractible (MOE) des PM2,5, 8,9, 10, 11. Cependant, la plupart de ces études n’ont caractérisé que les 16 HAP prioritaires dans la MOE, sans détecter les niveaux internes de HAP dans les embryons de poisson-zèbre12. Ce défi peut être dû à la petite taille des embryons de poisson-zèbre et à la complexité de la matrice embryonnaire.

La méthode QuEChERS (Rapide, facile, bon marché, efficace, robuste et sûre) est une technique innovante de préparation d’échantillons utilisée pour l’analyse des résidus de pesticides, des médicaments vétérinaires et d’autres contaminants dans les échantillons alimentaires et environnementaux13,14. Couplée à la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), cette méthode a été utilisée pour détecter les pesticides chez le poisson-zèbre15. Les HAP, qui contiennent deux cycles benzéniques ou plus, ont de fortes propriétés de fluorescence, ce qui les rend particulièrement adaptés à la détection à l’aide de détecteurs de fluorescence. Dans cette étude, nous avons développé une méthode QuEChERS-HPLC modifiée pour évaluer les niveaux de 16 HAP dans des embryons de poisson-zèbre exposés à la MOE.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Traitement de l’échantillon

  1. Collecte des PM2,5
    1. Collectez les PM2,5 sur des filtres à membrane en quartz de 47 mm.
      REMARQUE : Des particules2,5 ont été recueillies dans la région urbaine de Suzhou, en Chine.
  2. Extraction EOM
    1. Coupez le filtre en morceaux et placez-le dans une fiole conique en verre avec 150 ml d’acétonitrile.
    2. Éthésoniser le ballon à 35 °C pendant 1 h et transférer l’extrait dans quatre tubes de 50 mL.
    3. Centrifuger à 7 000 × g pendant 20 min, puis transférer le surnageant dans un évaporateur rotatif et le concentrer à environ 5 ml.
    4. S’évaporer à sec sous l’effet d’un écoulement d’azote dans un bain d’eau à 35 °C et dissoudre le résidu dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
  3. Traitement de l’embryon de poisson-zèbre
    1. Maintenir le poisson-zèbre dans un système d’eau à recirculation sur un cycle de lumière de 14 h et d’obscurité de 10 h à 28 °C16.
    2. Prélever les ovules fécondés (200 embryons par groupe) et les transférer dans des boîtes de Pétri en verre (verre sodocalcique, 80 x 15 mm) avec 30 ml d’eau du système de recirculation.
    3. Ajouter 30 μL de MOE (10 mg/mL) dans une boîte de Pétri en verre contenant 200 embryons 2 h après la fécondation (hpf). Les groupes non traités servent de contrôles vides.
      REMARQUE : La concentration finale de MOE est de 10 mg/L, d’après le taux de malformations cardiaques (figure supplémentaire S1).
    4. Mettez les plats dans un incubateur à 28 °C.

2. Préparation des échantillons QuEChERS

  1. Retirez les plats contenant des embryons à 72 hpf de l’incubateur. Lavez les embryons 3 fois à l’eau pure.
  2. Transférez les embryons dans des tubes de 1,5 mL (selon les différents groupes) et retirez l’excès d’eau.
  3. Placez les tubes dans un congélateur à -80 °C pendant 30 min pour lyophiliser les embyros17 et les lyophiliser. Ensuite, broyez les embryons à l’aide d’une tige de verre.
  4. Ajouter 25 μL d’une solution étalon mixte de 16 HAP (2,0 μg/mL) dans le groupe témoin de DMSO pour tester la récupération des pointes.
  5. Ajouter 1 mL de n-hexane et agiter pendant 30 s, puis ultrasoniser à 35 °C pendant 30 min.
  6. Centrifuger à 7 000 × g pendant 5 min et transférer le surnageant dans un tube frais.
  7. Répétez les étapes 2.5 et 2.6.
  8. Évaporer les surnageants collectés jusqu’à ce qu’ils soient secs sous un flux d’azote dans un bain d’eau à 35 °C.
  9. Ajouter 1 mL d’acétonitrile et agiter pendant 30 s.
  10. Ajouter 10 mg d’amine primaire secondaire (PSA), 45 mg de sulfate de magnésium et 15 mg de compresse en C18, puis agiter pendant 30 s.
  11. Centrifuger à 7 000 × g pendant 5 min et transférer le surnageant dans un tube frais.
  12. Répétez l’étape 2.9 et centrifugez à 7 000 × g pendant 5 min. Transférez le surnageant dans un tube frais.
  13. Évaporer le surnageant à 0,5 mL sous azote.
  14. Filtrer à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm.

3. Détermination des HAP à l’aide de la CLHP

  1. Préparez une série de solutions de travail (allant de 1 à 500 ng/mL) pour l’étalon mixte de 16 HAP avec de l’acétonitrile et injectez-les dans un chromatographe liquide en utilisant l’acétonitrile/l’eau comme phase mobile.
    1. Injecter 20 μL et utiliser la procédure d’élution suivante : 0-18,5 min, 40 % d’acétonitrile à 100 % d’acétonitrile ; 18,5 à 28 min, 100 % acétonitrile ; 28-29,5 min, 100 % à 40 % acétonitrile ; temps d’arrêt : 32 min ; température de la colonne : 25 °C ; débit : 1,8 mL/min. Tracer une courbe standard avec les concentrations massiques des solutions de travail standard sur l’axe des x et les aires de pics correspondantes sur l’axe des y, couvrant une plage de 5 ng/mL à 500 ng/mL.
      REMARQUE : Les longueurs d’onde d’excitation/émission des HAP se trouvent dans le tableau supplémentaire S1.
  2. Injecter l’échantillon purifié (à partir de l’étape 2.14) dans le chromatographe liquide à l’aide d’un détecteur à fluorescence (FLD) et d’un détecteur à barrettes de diodes (DAD).
  3. Identifiez la présence de HAP en comparant les temps de rétention et mesurez les zones de pics associées.
    REMARQUE : Les concentrations massiques des HAP ont été déterminées à l’aide de la courbe standard générée précédemment à l’étape 3.1.1.
  4. Calculer les concentrations internes des 16 HAP à partir des concentrations massiques mesurées des échantillons.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L’ensemble de la procédure d’exposition EOM, de préparation des échantillons et de détection des HAP est illustré à la figure 1. Pour la HPLC-FLU/DAD, un rapport signal/bruit de 3:1, avec une plage de détection de 0,3 à 5,0 ng/mL, a été jugé acceptable. Les limites de détection de la méthode variaient de 3,0 × 10-4 à 5,0 × 10-3 ng/organisme. Toutes les courbes d’étalonnage présentaient une linéarité élevée (r2 > 0,999). Les valeurs de précision déterminées...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les embryons de poisson-zèbre constituent un modèle de vertébré puissant pour les études de toxicité pour le développement, mais leur petite taille complique la détection des composés organiques semi-volatils (COSV) tels que les HAP. Lors de la préparation des échantillons, il est crucial d’éviter la contamination des embryons de poisson-zèbre. Un bon nettoyage des échantillons est une étape clé pour éviter le transfert de composés du milieu d’exposition dans l’extrait de l’échantillon. ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention : 81972999) et le Plan de développement scientifique et technologique de Suzhou (recherche fondamentale sur les applications médicales, SKY2023036 et SKY2023115).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
16 solutions étalons mixtes de HAP.o2si Smart Solutions (Caroline du Sud, États-Unis)110124-0616 Solutions étalons mixtes de HAP  ; comprend le naphtalène (Nap), l’acénaphtylène (Acy), l’acé-naphtène (Ace), le fluorène (Flo), le phénanthrène (Phe), l’anthracène (Ant), le fluoranthène (Flu), le pyrène (Pyr), le benzo [a] anthracène (BaA), le chrysène (Chr), le benzo [b] fluoranthène (BbF), le benzo [k] fluoranthène (BkF),benzo [a] pyrène (BaP), le pyrène indéno [1,2,3-cd] pyrène (IcdP), le dibenz [a, h]anthracène (DahA), benzo [g,h,i] pérylène (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, États-Unis)FLD(G1321A) ; DAD SL (G1315C)
AcétonitrileScharlab (Barcelone, Espagne)AC03661000solvant
CNWBOND HC-C18 SPE  ;ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINE)SBEQ-CA0801L’emballage C18 est un emballage en phase inverse avec un bon équilibre entre hydrophile et hydrophobe, qui peut adsorber et bien séparer les composés organiques polaires et non polaires.
Terre de diatoméesAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, États-Unis)12214013Pour la séparation, la purification et l’élimination des impuretés organiques&zwnj ;
Dispersif SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056Filtre de purification d’échantillons
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)SCAA-104Filtre à aiguilles en phase organique (nylon), 0.22µ ; m
HexaneScharlab (Barcelone, Espagne)HE02481000solvant
MilliporeMerck (New Jersey, États-Unis)Préparation d’eau ultrapure
Organomation - N-EVAP Évaporateurs d’azoteOrganomation (Massachusetts, États-Unis)Évaporation des solvants
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, États-Unis)centrifugation
  ; Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York, États-Unis)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, États-Unis)959990-918Cette colonne est couramment utilisée dans les systèmes HPLC pour réaliser une analyse précise et fiable des HAP.

Références

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Détection des HAPpréparation d'échantillonsdétecteur de fluorescencedétecteur à barrette de diodesmatière organique extractibletoxicité développementale
Méthode QuEChERS-HPLC modifiée pour la détection d’hydrocarbures aromatiques polycycliques dans des embryons de poisson-zèbre exposés à des particules fines
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.