Méthode à haut débit pour l’observation des phénotypes de motilité chez Pseudomonas aeruginosa

Summary

Ce protocole présente une méthode rapide et efficace pour identifier les facteurs génétiques impliqués dans divers types de motilités chez Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Les comportements de motilité jouent souvent un rôle important dans la capacité d’une bactérie à exploiter les ressources disponibles dans son environnement. Cela est particulièrement vrai pour l’agent pathogène polyvalent Pseudomonas aeruginosa, qui peut présenter divers types de motilités, y compris l’essaimage et les contractions, qui sont des traits pathogènes importants qui contribuent à la colonisation de la surface, à la formation de biofilms et à l’évasion des défenses de l’hôte. Ce manuscrit présente un protocole de motilité à haut débit pour étudier les comportements de motilité de P. aeruginosa. Le protocole permet de tester simultanément plusieurs souches de P. aeruginosa à partir d’une bibliothèque de mutants à l’échelle du génome, par exemple, pour identifier et analyser les facteurs génétiques impliqués dans sa motilité. L’approche offre la possibilité d’étudier la motilité de manière exhaustive et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la motilité de P. aeruginosa . Le protocole décrit ici peut également être modifié pour s’adapter à différents types de tests de motilité ainsi qu’à d’autres espèces bactériennes, fournissant ainsi une plate-forme puissante pour faire progresser la compréhension du comportement bactérien dans divers contextes.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste qui peut coloniser divers environnements en raison de sa remarquable polyvalence métabolique ^1,2. Cette polyvalence est cruciale pour la transition d’un mode de croissance planctonique à des biofilms, ce qui contribue à sa capacité à prospérer dans un large éventail de niches allant de l’eau au corps humain ^3,4,5. La transition entre ces modes de croissance est facilitée par une capacité étendue à se déplacer dans ces environnements en utilisant divers types de motilité, y compris la nage, l’essaimage et les contractions ^1,6. Chaque type de motilité est médié par des mécanismes et des structures cellulaires distincts et permet à P. aeruginosa de répondre aux signaux environnementaux ^7,8. La motilité de nage est entraînée par un seul flagelle polaire et est utilisée pour se déplacer à travers les milieux liquides vers les nutriments, par exemple⁹. La motilité d’essaimage est un mouvement coordonné facilité par la production de flagelles et de biosurfactants et permet aux colonies de se propager sur des surfaces semi-solides^10,11. Enfin, la motilité des contractions est indépendante des flagelles. Au lieu de cela, les contractions sont médiées par les pili de type IV (T4P) et utilisées pour se déplacer sur les surfaces^12,13. La motilité des contractions contribue également aux premières étapes de la formation du biofilm de P. aeruginosa en fournissant une fixation initiale à la surface. Après la fixation initiale, les contractions musculaires permettent aux bactéries de se déplacer sur les surfaces et de créer des microcolonies, qui peuvent ensuite se transformer en biofilms matures ^1,4,13.

Traditionnellement, les tests de motilité bactérienne sont effectués individuellement, une souche à la fois, sur une plaque de gélose molle ou à l’aide de méthodes de microscopie ^6,14,15. Les milieux semi-solides sont utilisés depuis de nombreuses années dans l’étude de la motilité bactérienne. De nos jours, ces techniques sont encore utilisées pour identifier les phénotypes de motilité chez les bactéries. Par exemple, traditionnellement, la motilité de l’essaimage est observée en inoculant 2,5 μL d’une culture de P. aeruginosa au centre d’une boîte de Pétri contenant un milieu M9 à une concentration de gélose^{de 0,5} % à 0,8 % 16. La motilité des contractions est généralement mesurée en examinant la propagation de la bactérie à la surface de l’interface entre la gélose (à 1 %) et la base d’une boîte de Pétri après qu’un coup de couteau ait inoculé P. aeruginosa à travers le milieu de culture. Un grand halo d’expansion interstitielle de la colonie est obtenu après 48 h d’incubation, alors que les souches non saccadées ne produisent pas une telle zone d’expansion de la colonie ^1,17,18.

Plus récemment, des approches de mutagénèse par transposon ont permis de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la motilité ou la formation du biofilm chez P. aeruginosa 19,20,21. Par exemple, de nouveaux gènes impliqués dans la motilité des contractions ont été trouvés à l’aide d’une banque de mutants de transposons à haute densité chez P. aeruginosa¹⁹. Un autre outil utile en génomique fonctionnelle est l’utilisation de collections de mutants ordonnés^22,23. La collection^{Keio 24}, contenant des délétions d’un seul gène pour tous les gènes non essentiels d’Escherichia coli, est probablement la collection de mutants la plus connue et a été utilisée pour définir des gènes affectant divers phénotypes, de la croissance dans différents milieux²⁵ à la morphologie cellulaire²⁶ et plus encore. De telles collections sont également disponibles pour Salmonella enterica sérovar Typhimurium²⁷, Bacillus subtilis²⁸, P. aeruginosa²⁹ ainsi que pour de nombreuses autres espèces. Ces collections sont également bien adaptées à l’étude de la motilité à l’échelle du génome, ce qui a conduit à la mise au point d’une méthode à haut débit pour étudier la motilité de P. aeruginosa. Ici, la méthode a été testée en évaluant la contribution des mutants de P. aeruginosa à la motilité des contractions et de l’essaimage sur des plaques à haute densité. Cette méthode à haut débit peut être utilisée pour divers phénotypes de motilité et convient également à l’étude de la motilité d’autres bactéries.

Protocol

REMARQUE : Le déroulement général de cette procédure est décrit à la figure 1.

Figure 1 : Flux de travail expérimental. (1) Préparez la quantité nécessaire de milieux de motilité en fonction du type de motilité d’intérêt dans les expériences. (2) À l’aide d’un système de réplicateur manuel ou automatisé, préparer les plaques de stock source pour la bibliothèque de mutants d’insertion de transposon de P. aeruginosa de la collection de mutants à la densité appropriée, en mettant l’accent sur la précision et l’inoculation uniforme dans tous les puits des plaques. (3) Transférer les échantillons des plaques sources de la collection de mutants vers les plaques de motilité. (4) Après l’incubation, observer et analyser les phénotypes de motilité et identifier les gènes impliqués dans la motilité d’intérêt à l’aide d’images de haute qualité. (5) Effectuer des tests de motilité traditionnels pour valider les résultats identifiés par des expériences de motilité à haut débit. Créé avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Plaques d’essaimage - M9 media	Plaques de contraction - LB media	Plaques sources - LB media
200 mL d’une solution de sels 5x M9	10 g de NaCl	10 g de NaCl
10 mL de glucose à 20 %	10 g de tryptone	10 g de tryptone
25 mL d’acides aminés	5 g d’extrait de levure	5 g d’extrait de levure
1 mL de 1M de MgSO4	10 g d’agar-agar	15 g d’agar
500 mL de gélose à 1 %	Ajouter du dH2O à 1L	Ajouter du dH2O à 1L
Ajouter du dH2O à 1L		Gentamicine (concentration finale 15 μg/mL)

Tableau 1 : Composition des milieux des différentes plaques utilisées dans l’essai.

1. Préparation des plaques de milieu de culture

REMARQUE : Voir la table des matériaux pour préparer les solutions mères et les conditions de stockage. Les assiettes doivent être remplies sur une surface plane. Lors du séchage, les plaques doivent être plates sur la surface (c’est-à-dire non empilées). Cela garantit que le milieu de culture dans la plaque sèche uniformément. N’importe quelle plaque uniwell avec une empreinte typique peut fonctionner, mais les plaques de plus grandes dimensions internes (sans parois intérieures), telles que les plaques Singer Instruments Plus ou les plaques de culture tissulaire VWR à puits unique non traitées, facilitent le travail avec une densité plus élevée de colonies par plaque.

1. Préparez une quantité appropriée de milieux pour les expériences selon la recette du tableau 1. Maintenez le support à ~45 °C- 50 °C pour éviter que la gélose ne se solidifie.
   1. Pour les plaques sources, préparer des plaques de 59 LB (bouillon de lysogénie) contenant 1,5 % de gélose et 15 μg/mL de gentamycine, ce qui est nécessaire pour reproduire la bibliothèque complète de PA14 - 59 x 25 mL =~ 1500 mL. Préparez 15 autres plaques de gélose LB 1,5 % et 15 μg/mL de gentamycine pour augmenter la bibliothèque au format de densité 384 - 15 x 25 mL = ~400 mL.
   2. Plaques à secousses : Si vous travaillez dans un format de densité de 96, préparez 59 plaques à secousses (LB 1 % de gélose). Préparez 15 plaques à contraction si vous travaillez dans un format de densité 384.
   3. Plaques d’essaimage : Préparez 15 (format de densité 384) ou 59 (format de densité 96) plaques d’essaimage (gélose M9-glucose 0,5 %)
2. Retirer le couvercle d’une assiette et verser 25 ml de média par assiette. Répartissez uniformément le support sur l’assiette en soulevant doucement chaque coin de l’assiette un à la fois. Répétez ce mouvement de mouvement 2x-3x. Remettez le couvercle sur l’assiette.
3. Laissez les plaques se solidifier et sécher à température ambiante (RT) pendant la nuit. Si les plaques ne sont pas utilisées immédiatement, mettez-les dans des sacs hermétiques et rangez-les dans un endroit sec. Ils peuvent être conservés pendant 3 semaines.

2. Préparation des plaques sources de la banque de mutants transposons de P. aeruginosa

REMARQUE : Les plaques sources font référence aux plaques LBA-gentamycine contenant une copie de la bibliothèque PA14 qui sont utilisées ultérieurement pour inoculer les plaques de motilité. La banque de mutants transposons P. aeruginosa (bibliothèque PA14) est un ensemble de 59 plaques congelées à 96 puits²⁹. Les étapes de préparation des plaques sources pour chaque format sont décrites ci-dessous. Ce protocole est adaptable pour les laboratoires qui n’ont pas accès au réplicateur Rotor+. Les chercheurs peuvent effectuer avec succès les mêmes procédures expérimentales à l’aide de réplicateurs manuels, tels que les réplicateurs à ressort à 96 broches utilisés ici pour la réplication des plaques congelées de la bibliothèque PA14 pendant le premier jour (reportez-vous à la table des matériaux) ou tout autre réplicateur à 96 broches. Les réplicateurs manuels doivent être stérilisés et laissés refroidir entre chaque utilisation.

1. Jour 1 : Réplication de la bibliothèque PA14 à partir des 59 plaques congelées à 96 puits sur les plaques sources
   1. Stérilisez un réplicateur à ressort à 96 broches en le plaçant sur une plaque chauffante à température maximale pendant 8 min. Après la stérilisation, laissez le réplicateur refroidir suffisamment (~10 min) pour éviter de tuer les bactéries.
   2. Prenez une plaque source. À l’aide du réplicateur stérile à 96 broches, trempez soigneusement les broches du réplicateur dans une plaque à 96 puits, puis transférez les cellules directement sur la surface de la plaque source. Répétez l’opération jusqu’à ce que les 59 plaques congelées à 96 puits de la bibliothèque PA14 soient répliquées sur les plaques sources.
   3. Incuber les plaques sources de densité 96 à 37 °C pendant 16 à 18 h.
      REMARQUE : Si vous utilisez la méthode avec un format de densité de 96, ces plaques sources peuvent ensuite être utilisées pour inoculer les plaques de motilité.
2. Jour 2 : Passage du format 96 densité au format 384 densité
   REMARQUE : Le jour 2 peut être sauté si vous travaillez à une densité de 96.
   1. Après l’incubation, laissez refroidir les plaques (à plat sur une surface, non empilées) à température ambiante (~1 h). S’il y a de la condensation sur les couvercles, éliminez la condensation à l’aide d’une lingette délicate pour empêcher les gouttelettes d’eau de tomber sur les plaques, ce qui pourrait provoquer une contamination croisée entre les colonies.
   2. Configurez le réplicateur avec les paramètres suivants pour assurer un transfert précis de la colonie. Allumez le réplicateur. Dans la section Sélectionner un mode de fonctionnement, sélectionnez Sélectionner et exécuter les programmes enregistrés.
   3. Dans la section Sélectionner les plaques source, sélectionnez PlusPlate 96 Agar. Dans la section Sélectionner les plaques cibles, sélectionnez PlusPlate 384 Agar. Dans la section Sélectionner les tampons, sélectionnez Broche courte 96.
   4. Dans la section Répliquer les options du programme, sélectionnez Général et cliquez sur Recycler > Aucun.
   5. Dans la section Source, sélectionnez Décalage et cliquez sur Aléatoire > Rayon par défaut. Dans la section Cible, sélectionnez Épinglage et ajustez la pression à 20 %. Laissez tous les autres paramètres par défaut.
   6. Insérez les RePads à goupille courte 96 dans le compartiment approprié.
   7. Positionnez les plaques source et cible sur la plate-forme désignée du réplicateur. Placez les plaques sources de densité 96 (plaques 1, 2, 3 et 4) et la nouvelle plaque source vide (plaques LBA) sur la plate-forme. À l’aide des paramètres sélectionnés, le robot d’épinglage de réseau microbien transférera les colonies des plaques de densité 96 à la nouvelle plaque de densité 384. Appuyez sur Exécuter.
   8. Changez toutes les plaques sur la plate-forme (les quatre prochaines plaques sources de densité 96 et une nouvelle plaque source vide) et répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les plaques aient été mises à l’échelle. Pour le dernier jeu de plaques, utilisez les plaques 57, 58, 59 et 1. Chaque plaque de densité 384 sera composée de colonies alternées à partir de quatre plaques de densité 96 (voir la figure 2). Incuber les plaques LBA de densité 384 à 37 °C pendant 16-18 h.
      REMARQUE : Ces plaques sources de densité 384 peuvent ensuite être utilisées pour inoculer la plaque de motilité afin d’effectuer le protocole à une densité de 384. À n’importe quelle étape après l’incubation, les plaques peuvent être stockées à 4 °C jusqu’à 3 semaines.

Figure 2 : Mise à l’échelle des plaques de densité 96 à 384 densités. Les colonies de quatre plaques sources de densité 96 sont transférées et fusionnées en une seule plaque de densité 384. Chaque quadrant de la plaque de densité 384 correspond à l’une des plaques originales de 96 puits (rouge, bleu, jaune et vert), préservant la position de chaque mutant. Créé avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Expérience de motilité à haut débit

REMARQUE : Le protocole a été réalisé ici au format de densité 384, mais le même protocole peut être adapté à un format de densité 96 en modifiant les paramètres sur le réplicateur pour transférer des plaques sources aux plaques de motilité en utilisant la sélection 96 au lieu de 384.

1. Après l’incubation, laissez refroidir les plaques (à plat sur une surface, non empilées) à température ambiante (~1 h). En cas de condensation sur les couvercles, retirez-la à l’aide d’une lingette délicate pour éviter que des gouttelettes d’eau ne tombent sur les plaques, ce qui pourrait provoquer une contamination croisée entre les colonies.
2. Prenez le nombre approprié de plaques (59 pour un format de densité 96 ou 15 pour un format de densité 384) pour le dosage souhaité : plaques de gélose M9-glucose 0,5 % pour l’essaimage, LB et plaques de gélose 1 % pour les contractions.
3. Configurez le réplicateur avec les paramètres suivants pour assurer un transfert précis de la colonie.
   1. Allumez le réplicateur. Dans la section Sélectionner un mode de fonctionnement, sélectionnez Sélectionner et exécuter les programmes enregistrés. Dans la section Sélection des plaques source, sélectionnez PlusPlate 384 Agar.
   2. Dans la section Sélectionner les plaques cibles, sélectionnez PlusPlate 384 Agar. Dans la section Sélectionner les tampons, sélectionnez Broche courte 384. Dans la section Répliquer les options du programme, sélectionnez Général > Recycler > Aucun.
   3. Dans Programmes Singer, sélectionnez Répliquer plusieurs.
   4. Dans la section Source, sélectionnez Décalage > Aléatoire > Rayon par défaut. Dans la section Cible, sélectionnez Épinglage et ajustez la pression à 2 %. Laissez tous les autres paramètres par défaut.
4. Insérez les RePads à goupille courte 384 dans le compartiment approprié.
5. Positionnez les plaques source et cible sur la plate-forme désignée du réplicateur. Placez les plaques sources de densité 384 et les plaques de motilité vides sur la plate-forme. Appuyez sur Exécuter À l’aide des paramètres sélectionnés, le robot d’épinglage de réseau microbien transférera les colonies des plaques sources de densité 384 aux plaques de motilité. Chaque plaque de densité 384 sera constituée d’une copie d’une plaque source de densité 384.
6. S’assurer que le transfert est uniforme et que toutes les colonies sont correctement épinglées sur la surface de la gélose des plaques de motilité. Mettez les plaques de motilité inoculées dans des sacs en plastique. Placez avec précaution les sacs contenant les plaques dans un incubateur réglé à 37 °C pendant 18 h.
   REMARQUE : Les plaques sont placées dans des sacs pour maintenir l’humidité et éviter un séchage inégal. Placez les plaques dans l’incubateur avec les couvercles vers le haut.
7. Après l’incubation, vérifiez que les plaques de motilité ne se développent pas uniformément et qu’il n’y a pas de contamination.
8. Jour 3 : Imagerie des plaques de motilité
   REMARQUE : Le PhenoBooth de Singer Instruments est utilisé pour capturer des images haute résolution des plaques de motilité. Il utilise un appareil photo de qualité scientifique et produit des images de 23 mégapixels. Il comprend cinq canaux d’éclairage pour capturer des images haute résolution des colonies à partir de boîtes de Pétri et de plaques rectangulaires. D’autres imageurs de haute qualité fonctionnent également.
   1. Après la période d’incubation, les plaques de motilité sont prêtes pour le processus d’imagerie. Allumez le Phenobooth et cliquez sur l’icône correspondant au logiciel Phenobooth.
   2. Une page Sélectionner un projet s’ouvre. cliquez sur Nouveau projet > Comptage des colonies. Choisissez le chemin d’accès au fichier souhaité pour stocker les images dans le champ Emplacement. Dans le champ Résolution, choisissez 5626 x 4220. Cliquez sur OK, l’appareil est maintenant prêt à prendre des photos.
   3. Insérez la plaque dans le lecteur avec le côté moyen vers le haut après avoir retiré le couvercle. Assurez-vous que la plaque est correctement positionnée avant de fermer le lecteur pour éviter de coincer la plaque.
   4. Réglez le paramètre sur la lumière blanche dans l’onglet Eclairage. Cliquez sur Aperçu. Ajustez les paramètres d’exposition dans l’onglet des paramètres de PhenoBooth pour obtenir les paramètres optimaux pour l’observation des phénotypes de motilité.
   5. Cliquez sur Acquérir ; Les images capturées apparaîtront sur le côté gauche de l’écran. Une fois terminé, fermez le logiciel (toutes les images capturées seront enregistrées dans le fichier précédemment choisi dans l’onglet Emplacement).
      REMARQUE : Phenobooth enregistre les images au format JPEG, mais pour les étapes d’analyse en aval, les images peuvent être au format TIFF, JPEG ou PNG.

4. Analyse des phénotypes de motilité

REMARQUE : L’analyse d’image est effectuée comme décrit en détail par French et ^al.30,31. Un script pour effectuer l’analyse des données est disponible à partir de³¹ (ImageJ Macro).

1. Brièvement, les images sont traitées dans ImageJ³², qui génère une valeur pour chaque colonie sur la plaque de motilité. Tout d’abord, convertissez les images au format 8 bits et segmentez les colonies et leurs zones de motilité associées de l’arrière-plan à l’aide de la commande threshold. Dessinez une région d’intérêt (ROI) autour de chaque colonie et mesurez la zone de motilité. Cela génère une table contenant une valeur de densité intégrée pour chaque puits, organisée par lignes. Ce tableau peut être enregistré sous forme de fichier CSV pour une analyse plus approfondie.
   1. Exécutez la macro dans ImageJ et ouvrez le dossier contenant les images.
   2. Lorsque vous y êtes invité, ajustez la rotation de la plaque en modifiant l’angle de la plaque à l’aide de l’option Aperçu afin que la plaque soit droite. Lorsque vous êtes satisfait, cliquez sur le bouton OK .
   3. Ensuite, déplacez le rectangle autour des colonies et utilisez-le pour recadrer la partie de la plaque contenant les colonies. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur le bouton OK .
   4. L’invite suivante définira la grille utilisée pour dessiner le retour d’intérêt autour de chaque colonie et mesurer la zone de motilité. Sélectionnez la densité de colonie appropriée. Ajustez les différents paramètres si nécessaire, de sorte que chaque cercle soit autour d’une colonie. Lorsque vous êtes prêt, activez l’option Okay ? et cliquez sur le bouton OK . Cela permettra de mesurer l’aire de motilité de chaque colonie et d’enregistrer un fichier CSV dans le dossier contenant les données.
2. Combinez ce fichier CSV avec la légende de la plaque, également organisée par rangées, pour identifier chaque zone de motilité avec le mutant correspondant. Des valeurs de densité intégrée plus faibles correspondent aux mutants qui n’étaient pas mobiles ou qui présentaient une motilité réduite.

5. Tests de motilité traditionnels pour la validation des résultats positifs

REMARQUE : Après avoir observé des mutants avec une motilité affectée dans le protocole de motilité à haut débit, il est important de valider les résultats obtenus individuellement. Le protocole de motilité individuel diffère de celui utilisé pour les tests à haut débit, mais les supports utilisés sont les mêmes.

1. Essai de motilité par essaimage
   REMARQUE : La motilité par essaimage est effectuée comme décrit en détail par Ha et ^al.16.
   1. Brièvement, autoclavez une solution de gélose avec de la gélose M9 (0,5 % d’agar), du glucose, des acides aminés et du MgSO₄. Verser la gélose mélangée refroidie dans des plaques de Petri (25 ml par plaque).
   2. Inoculer avec 2,5 μL de culture bactérienne pendant la nuit. Incuber à 37 °C pendant 18 h, les paupières vers le haut pour observer les phénotypes de motilité.
2. Essai de motilité des contractions
   REMARQUE : La motilité des contractions est effectuée comme décrit en détail par Haley et ^al.33,34.
   1. En bref, autoclaver une gélose LB 1 % (voir tableau 1). Verser la gélose LB 1 % refroidie et mélangée dans des plaques de Petri (25 ml par plaque).
   2. Poignarder les bactéries au fond des plaques de contraction (gélose à 1 %). Incuber les plaques à 37 °C pendant 48 h, puis à RT pendant 48 h supplémentaires. Retirez la gélose de la plaque et visualisez la zone de contraction en colorant la boîte de Pétri avec 1 % de violet cristallin.
   3. Photographiez les boîtes de Pétri à l’aide du PhenoBooth avec les mêmes paramètres que ceux décrits à l’étape 3.

Results

Nous avons utilisé ce protocole pour caractériser l’effet de l’inactivation génique sur la motilité de P. aeruginosa à haut débit. Ici, nous avons détaillé son utilisation pour étudier la motilité de l’essaimage et des contractions dans une collection de délétion de P à l’échelle du génome. souche aeruginosa PA14 (bibliothèque PA14). Le protocole offre une grande polyvalence et une grande facilité d’utilisation, permettant de modifier différentes étapes du pro...

Discussion

Le protocole de motilité à haut débit décrit ici nous permet de traiter et d’analyser le phénotype de motilité de nombreuses colonies avec précision et reproductibilité. Par rapport aux méthodes manuelles traditionnelles, cette approche semi-automatisée augmente l’évolutivité et le débit des tests de motilité pour permettre l’évaluation de la motilité bactérienne à l’échelle du génome. Le protocole a été optimisé pour être utilisé avec la banque PA14, mais ce test pourrait être utilisé a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 plaques de puits   ;   ;	Corning  ;   ;	3701  ;
Agar & nbsp ;	Fisher Scientific & nbsp ;   ;	BP1423-2  ;	Concentration finale de 0,5 % pour la motilité en essaim ou 1 % pour la motilité des spasmes respectivement.
Acides de Casamine & nbsp ;   ;	Fisher Scientific & nbsp ;   ;	223050  ;	Préparez un stock d’eau à 20 %. Le filtre stérilise avec un 0,22 & mu ; m filtre et stocke à 4 °C. Concentration finale de 0,5 % dans un milieu minimum M9.   ;
Violet cristal   ;	Bio Basic  ;   ;	CB0331	Préparez une solution à 1 % dans de l’eau.
D-Glucose   ;   ;	Bio Basic  ;   ;	GB0219  ;	Préparez un stock de 20 % (1,1 M) dans de l’eau et stérilisez par autoclavage. Concentration finale de 0,2 % dans le moyen minimum M9.   ;
Filtropur S 0.2  ;	Sarstedt  ;	83.1826.001
Sulfate de gentamycine & nbsp ;   ;	Bio Basic  ;   ;	GB0217  ;	Préparez un bouillon de 30 mg/ml dans de l’eau. Le filtre stérilise avec un 0,22 & mu ; M filtre et stockage à 4 degrés ; C et ndash ; concentration finale dans les plaques 15 & micro ; g/mL..   ;   ;
Inoculation de la boucle et de l’aiguille   ;	Fisher Scientific & nbsp ;	22363597
M9 Sels Minimaux, 5X & nbsp ;	Fisher Scientific & nbsp ;	248510	Préparez un stock de 1M dans de l’eau et stérilisez par autoclave. Concentration finale de 1 mM dans un milieu minimum M9. & nbsp ;   ;
Sulfate de magnésium (MgSO4) & nbsp ;   ;	Fisher Scientific & nbsp ;	M63-500	; Préparez un bouillon de MgSO4 de 1 m dans de l’eau. Le filtre stérilise avec un 0,22 & mu ; Filtre M et conserve à température ambiante. Concentration finale   ;
Bibliothèque de mutants d’insertion de transposons PA14 & nbsp ;   ;		Liberati et al., 2006 (voir référence 29)	59 plaques à 96 puits pour l’ensemble de la collection. Chaque puits contient un seul mutant dans LB avec 25 % de glycérol.
Boîte de Petri 92x16mm   ;	Sarstedt  ;	82.1473.001
PhenoBooth+  ;	Instruments chanteurs & nbsp ;	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/  ;	Dissoudre 11,3 g de la poudre dans 200 mL d’eau purifiée. Autoclave à 121 & degrés C pendant 15 min. & nbsp ;
Seringue en plastique 10 mL  ;	Fisher Scientific & nbsp ;	14955459
Rotor+  ;   ;   ;	Instruments chanteurs & nbsp ;	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/  ;
Densités de RePads à broches courtes 384   ;	Instruments chanteurs & nbsp ;   ;	REP-004  ;
RePads à broches courtes densités 96   ;   ;	Instruments chanteurs & nbsp ;   ;	REP-002  ;
Chlorure de sodium (NaCl)  ;   ;	Fisher Scientific & nbsp ;	BP358-212  ;
Réplicateur à ressort à 96 broches	EnzyScreen  ;   ;	CR1000  ;
Lame chirurgicale en acier inoxydable n° 25  ;	Fisher Scientific & nbsp ;	08-918-5F
Tryptone  ;	Oxoïde & nbsp ;   ;	LP0042B  ;
Plaques Uniwell	Instruments chanteurs & nbsp ;   ;	PlusPlates : PLU-003  ;   ;	Dimension de la plaque : 54 et plus de fois ; 34 et fois ; 38 cm - sans murs intérieurs, ce qui offre des dimensions intérieures plus grandes.
Plaques Uniwell	VWR	Plaques de culture tissulaire à puits unique : 75780-348	Même dimensions que les PlusPlates.
Extrait de levure & nbsp ;	Fisher Scientific & nbsp ;	248510  ;