Article de méthode

Etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses

DOI :

10.3791/67780

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27 décembre 2024

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1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous démontrons comment les cellules épithéliales cultivées avec des fibroblastes dans le système à deux couches basé sur une membrane nanofibreuse peuvent adhérer de manière stable et se développer sur la membrane.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les obstacles techniques dans une culture de cellules épithéliales comprennent la dédifférenciation et la perte de fonction. Les méthodes de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) biomimétique peuvent améliorer l’efficacité de la culture cellulaire. Cette étude présente un système de culture avancé à deux couches destiné à cultiver des cellules épithéliales sous forme de couches tissulaires avec la culture de fibroblastes dans un environnement 3D. Des membranes nanofibreuses (NM) d’alcool polyvinylique (PVA) et de poly(ε-caprolactone) (PCL) ont été fabriquées par électrofilage et utilisées comme matrice extracellulaire physiologiquement pertinente pour la culture de cellules épithéliales et de fibroblastes, respectivement. Dans les puits d’insertion supérieurs, les cellules épithéliales pulmonaires ont été cultivées sur le NM PVA, et dans les chambres inférieures, les fibroblastes ont été cultivés sur le NM PCL. Cette configuration élimine le contact direct entre les cellules et facilite l’examen de la signalisation paracrine médiée par des facteurs solubles. La microscopie confocale a été utilisée pour analyser la distribution, le modèle de croissance et l’expression des protéines intracellulaires, y compris la zone occluse dans les cellules épithéliales. Les techniques d’empilement en Z ont permis des reconstructions 3D détaillées, fournissant des informations précises sur l’intégrité des jonctions serrées et l’organisation spatiale au sein de la couche épithéliale. La microscopie électronique à balayage (MEB) a évalué les caractéristiques morphologiques des types de cellules sur les membranes nanofibreuses. L’imagerie MEB a révélé des structures complexes à la surface des cellules et des interactions avec les nanofibres, offrant une perspective complète sur l’architecture cellulaire et l’interaction cellulaire avec la structure nanofibreuse. Le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est une méthode simple pour mesurer les taux de croissance des cellules épithéliales et des fibroblastes au fil du temps. Il fournit les comportements prolifératifs et les effets synergiques potentiels de la culture de ces cellules. Ces résultats mettent en évidence l’efficacité d’un système de co-culture simple pour la culture simultanée de fibroblastes et de cellules épithéliales, ce qui est crucial dans divers contextes physiologiques et pharmacologiques, y compris la régénération du tissu épithélial, le microenvironnement tumoral avec des cellules endothéliales, immunitaires et autres cellules stroma, le test de toxicité et le test d’activité médicamenteuse.

Introduction

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Au fil des décennies, la culture monocouche bidimensionnelle (2D) classique a été essentielle pour comprendre les infections, la pharmacologie et la toxicologie 1,2. Cependant, il est important de tenir compte de la complexité, des interactions dynamiques entre les multi-compositions et de l’architecture tridimensionnelle (3D) du microenvironnement tissulaire. Ainsi, la culture cellulaire 2D a des limites pour imiter les structures tissulaires 3,4. Par exemple, il y a un manque de signalisation de cellule à cellule et de matrice cellulaire à extracellulaire (ECM), qui est essentielle à la différenciation, à la prolifération et aux fonctions cellulaires dans le microenvironnement vivo. Pour ces raisons, les systèmes de cultures cellulaires 3D ont été développés5. Les cellules en culture 3D se développent et interagissent avec la matrice extracellulaire environnante en trois dimensions. De plus, une approche de coculture 3D, composée de plus d’un type de cellule, a été développée pour combler le fossé entre les modèles simplistes de type unicellulaire in vitro et les interactions cellulaires dynamiques qui se produisent in vivo6. Les systèmes de coculture 3D ont gagné en popularité dans l’étude de la communication cellule-cellule et des interactions cellule-matrice extracellulaire (ECM) 7,8,9,10. Les systèmes de coculture 3D actuels ont plusieurs formes et peuvent être séparés en coculture directe et indirecte 8,9. Dans la coculture directe, diverses fonctions cellulaires dans les cellules cultivées peuvent être principalement affectées par le contact direct plutôt que par des effets paracrines. En comparaison, la coculture indirecte présente un plus grand avantage pour étudier l’interaction paracrine en utilisant des barrières ou des couches pour séparer différents types de cellules.

Divers matériaux et méthodes sont utilisés pour fabriquer des échafaudages biomimétiques imitant l’ECM à l’aide de substances biocompatibles et biodégradables10. La structure d’échafaudage nanofibreuse imite la configuration de l’ECM native dans les tissus biologiques, fournissant une architecture 3D pour la culture cellulaire11,12. Les membranes nanofibreuses (NM) électrofilées ont été utilisées dans la coculture directe et indirecte de différents types de cellules 13,14,15.

Les cellules épithéliales forment une barrière physique des principaux organes, tandis que les fibroblastes sont des cellules de stroma prédominantes qui médient le remodelage de l’ECM et régulent l’épithélium voisin 6,16,17. Les cellules épithéliales et les fibroblastes interagissent avec la laminine dans la membrane basale et la fibronectine dans la matrice interstitielle, respectivement, par le biais des récepteurs de l’intégrine à la surface cellulaire18. Lorsque les cellules épithéliales sont cultivées sur des NM poly(alcool vinylique) (PVA) d’un diamètre de 150 à 250 nm et de micropores, elles forment des couches multiples au lieu d’agrégats cellulaires et de sphéroïdes, et leurs schémas de croissance sont similaires à ceux des cellules du tissu épithélial19. En comparaison, les NM poly(caprolactone) (PCL) avec des diamètres de 400 à 1 500 nm et des micropores de 10 à 50 μm offrent une dimensionnalité spatiale similaire à la matrice interstitielle pour la croissance des fibroblastes en culture13,14. En raison de leur biocompatibilité, les membranes PVA et PCL sont des polymères couramment utilisés dans l’ingénierie tissulaire20,21.

Cette étude présente un système de culture avancé à deux couches utilisant des NM électrofilés poreux pour cultiver des cellules épithéliales sous forme de couches de type tissulaire et de fibroblastes au sein d’une structure 3D. Le protocole peut être divisé en cinq étapes clés : la fabrication des nanofibres, la post-réticulation et l’évaluation de la qualité des fibres, la préparation du puits de culture membranaire, l’ensemencement cellulaire et la coculture 3D, et les tests de cellules cultivées en 3D.

Protocole

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1. Fabrication de nanofibres PVA stables à l’eau

  1. Pesez 0,02 g de poly(acide acrylique) (PAA) et 1 g de PVA, puis ajoutez-les dans une bouteille en verre propre contenant une barre magnétique. Ajoutez 7,8 ml d’eau distillée dans la bouteille, placez la bouteille sur un agitateur à plaque et réglez la température à 84 °C, la vitesse à 500 tr/min et le temps à 12 h.
  2. Laissez refroidir la bouteille à température ambiante avant d’ajouter 0,2 ml de glutaraldéhyde (GA). Placez la bouteille sur l’agitateur à plaque et réglez la vitesse sur 500 tr/min, le temps sur 30 min et la température à température ambiante.
  3. Utilisez une seringue de 5 ml pour l’électrofilage, séparez les pistons des barils et nettoyez les petits débris de plastique à l’intérieur des barils et de l’extrémité des pistons.
  4. Utilisez des aiguilles pour bloquer l’écoulement du liquide, puis versez la solution de PVA dans chaque baril (volume : 2,5 à 3 ml chacun). Assemblez les pistons, puis retirez les aiguilles.
    REMARQUE : Il se peut qu’il y ait une bulle dans la solution, alors attendez que la bulle disparaisse. Cela prend 10 à 30 min.
  5. Assemblez une nouvelle aiguille métallique de 27 G, puis placez-la dans la machine d’électrofilage.
  6. Enveloppez bien le collecteur avec du papier d’aluminium.
  7. Laissez le panneau d’injecteur revenir à sa position d’origine. Utilisez les réglages suivants pour la machine : (chaque pompe) volume d’injection : 2 mL, débit d’injection : 6 μL/min, vitesse du rouleau : 100 tr/min, distance entre l’embout et le collecteur : 14 cm. Vérifiez le débit de liquide pour chaque pompe.
  8. Faites fonctionner la machine avec un potentiel électrique d’environ 12 kV.
  9. Assurez-vous que l’humidité est de 40 à 50 % au début et de 25 à 30 % à la fin du processus. Utilisez un humidificateur lorsque l’humidité diminue et placez des plats contenant de l’eau distillée à l’intérieur de la machine la veille de l’électrofilage pour augmenter l’humidité.
    REMARQUE : Il s’agit d’un facteur critique dans la fabrication réussie de nanofibres PVA.
  10. Vérifiez régulièrement le débit. Si l’aiguille est bloquée, arrêtez temporairement la machine. Utilisez une lingette de laboratoire pour retirer la goutte et attendez que la nouvelle goutte apparaisse. Si ce n’est pas le cas, changez l’aiguille, puis continuez à faire fonctionner la machine.
  11. Le processus de fabrication de nanofibres PVA prend ~6 h. Une fois le processus d’électrofilage terminé, détachez la feuille contenant le tapis de fibres du collecteur et stockez le tapis de nanofibres dans un dessiccant sous vide.

2. Traitement d’une membrane nanofibreuse PVA avec de la vapeur d’acide chlorhydrique (HCl) et évaluation de la qualité de la fibre

REMARQUE : La stabilité de l’eau des NM PVA est bien préservée après la réaction de post-réticulation par la vapeur de HCl. Ce processus est optimisé pour l’épaisseur, la taille des pores et la rugosité des NM. Le PVA est un polymère très hydrophile, et les nanofibres de PVA électrofilées sont instables au contact de l’eau et dans des conditions humides. Les NM PVA doivent être traités avec de la vapeur de HCl juste après la fabrication du polymère PVA.

  1. Coupez un tapis en nanofibres en morceaux de la taille souhaitée pour l’insert trans-well.
  2. Préparez un petit plat contenant 1,5 mL de HCl pur. Placez le plat contenant du HCl et les morceaux de nanofibres à l’intérieur d’une chambre à vide et fermez le couvercle.
    REMARQUE : La vapeur HCl est utilisée comme agent de post-réticulation pour rendre la nanofibre stable à l’eau.
  3. Ouvrez la vanne connectée à la pompe à vide, attendez 10 s jusqu’à ce que la fumée HCl monte, puis fermez la vanne. Traitez les membranes avec des fumées de HCl pendant 2 min.
  4. Après le traitement à la vapeur HCl, ajoutez quelques gouttes d’eau distillée (DW) aux membranes, placez-les sur une lame de verre et retirez la membrane de la feuille. Après un séchage à l’air libre de 20 min, les membranes adhèrent naturellement à la lame.
  5. Enduire les membranes sur du ruban de carbone d’une fine couche d’or à l’aide d’une coucheuse à pulvérisation automatique. Obtenez des images au microscope électronique à balayage (MEB).
  6. Après avoir réticulé les NM PVA avec du HCl, lavez-les 3 fois avec 1 PBS et vérifiez le pH après les avoir trempés dans un milieu de culture pour confirmer l’absence de HCl résiduel.

3. Fabrication de nanofibres PCL et évaluation de la qualité des nanofibres

  1. Pesez 1,5 g de PCL et ajoutez-le dans une bouteille en verre propre. Ajouter 8,5 mL de chloroforme dans la bouteille, placer la bouteille sur un agitateur à plaque et dissoudre la PCL dans le chloroforme pendant 12 h à température ambiante.
  2. Répétez les étapes 1.3 à 1.9, à l’exception des étapes 1.7 et 1.8, réglez le taux d’injection à 8 μL/min et la tension à 17,5 kV.
    REMARQUE : La fabrication du PCL prend ~3,5 h pour être terminée.
  3. Coupez un petit morceau de la membrane et enrobez les morceaux par pulvérisation automatique pendant 5 min. Obtenez des images MEB.

4. Assemblage de deux couches de membranes dans un trans-puits

REMARQUE : Dans ce protocole, nous utilisons une plaque de 24 puits et son puits d’insertion respectif. Le PVA NM est fixé au puits d’insertion, tandis que le PCL NM est fixé au puits inférieur.

  1. Coupez un tapis en nanofibres en morceaux ronds, d’un diamètre de 10 mm et 13 mm pour les NM PVA et PCL, respectivement.
  2. Utilisez le polydiméthylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 comme agent adhésif pour fixer les membranes à l’insert et au puits de la chambre. Avant utilisation, mélangez la base Sylgard 184 (partie A) et l’agent de durcissement (partie B) dans un gobelet en plastique dans un rapport massique de 10:1. À l’aide d’une lame de verre propre, mélangez vigoureusement la solution PDMS pendant 2 à 3 minutes jusqu’à ce que tout le mélange soit rempli de bulles. Laissez la bulle se former et disparaître pendant 10 min avant de l’utiliser ; Pendant ce temps, laissez la diapositive chauffer à 100 °C.
  3. Étalez le PDMS sur une lame de verre et trempez légèrement le bord inférieur de l’insert dans le PDMS. Gardez l’insert bien à l’envers sur le chauffe-lames pour que le PDMS durcisse (~10-15 min). Vérifiez soigneusement avec un embout de 200 μL pour vous assurer que le PDMS n’est pas collant.
  4. Traitez les morceaux de PVA NM comme décrit aux étapes 2.2 à 2.4.
  5. Appuyez doucement sur le puits d’insertion sur la pièce PVA NM de sorte que le bas du puits d’insertion fasse face au côté nanofibre de la pièce de membrane. Ajoutez une goutte d’eau distillée au centre du puits et utilisez une pince pour retirer la feuille. Mettez bien l’insert dans une nouvelle plaque à 24 puits et laissez sécher la membrane.
  6. Lorsque vous fixez bien la pièce PCL NM au fond, assurez-vous de tremper la pointe de 200 μL dans le mélange PDMS et de la pointer précisément aux quatre coins et au centre.
  7. Placez la plaque sur le chauffe-lames et laissez le PDMS durcir pendant 5 à 7 minutes pour assurer la qualité de l’assemblage.
  8. Placez la pièce PCL NM dans le puits contenant le PDMS, avec le côté nanofibre de la membrane fixé au PDMS. À l’aide d’une petite brosse propre, appuyez légèrement sur le côté feuille de la membrane pour une fixation complète. Ajoutez 0,2 ml d’éthanol à 70 % dans le puits pour retirer facilement le papier d’aluminium.
  9. Stérilisez l’insert et le puits inférieur dans la configuration trans-puits sous la lumière UV pendant la nuit.
    REMARQUE : Le PDMS mixte peut être stocké à -20 °C pour une utilisation ultérieure. ATTENTION : La plaque fixée à la membrane nanofibreuse PCL peut être stockée au sec mais doit être mouillée avec de l’éthanol à 70 % avant utilisation.
  10. Le lendemain, lavez bien l’insert et le fond en ajoutant 200 μL et 500 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), respectivement, pendant 3 x 10 min. L’insert et le puits inférieur sont prêts à l’emploi.

5. Ensemencement cellulaire et assemblage de deux couches pour le modèle de coculture

REMARQUE : Les cellules MLE-12 ont été cultivées dans 1 milieu DMEM (DMEM)/F12 modifié de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % d’antibiotique pénicilline/streptomycine. Les cellules NIH3T3 ont été cultivées dans 1x DMEM à haute teneur en glucose avec 10 % de FBS et 1 % d’antibiotique pénicilline/streptomycine.

  1. Conservez les cellules dans une boîte de culture de 150 mm. Lorsqu’elles sont confluentes à 70-80 %, lavez les cellules avec 10 mL de 1x PBS et trypsinisez avec 2 mL de solution préchauffée de trypsine/EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C.
  2. Tapotez doucement la boîte pour déloger les cellules par le bas, puis ajoutez 8 ml de milieu de culture complet à chaque type de cellule pour neutraliser l’enzyme trypsine. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 mL, centrifuger à 400 × g pendant 5 minutes et jeter le surnageant. Colorez les cellules avec Cell-Tracker pour observer la distribution des cellules ensemencées sur NM (voir rubrique 6 pour plus de détails).
  3. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu DMEM/F12 complet. Déterminez le numéro de cellule et ajustez à 6 × 106 cellules MLE-12/ml et à 8 × 105 cellules NIH3T3/ml.
    REMARQUE : Un milieu DMEM/F12 complet est utilisé pour la coculture avec des cellules MLE-12 et NIH3T3.
  4. Remplissez le puits inférieur avec 500 μL de média DMEM/F12 complet (le puits sans PCL). Transférez l’insert fixé à la membrane nanofibreuse PVA dans le puits de transfusion et ajoutez 50 μL de suspension de cellules MLE-12. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2.
  5. Simultanément, remplissez le puits inférieur fixé à la membrane nanofibreuse PCL avec 500 μL de suspension de cellules NIH3T3 et incubez les cellules à 37 °C et 5 % de CO2.
  6. Après 2 h, assemblez l’insert contenant la cellule MLE-12 et le puits inférieur contenant la cellule NIH3T3 dans la configuration trans-well. Il s’agit du modèle de coculture avec des cellules MLE-12 comme couche supérieure et des cellules NIH3T3 comme couche inférieure. Cocultivez les cellules dans les membranes à deux couches pendant le temps souhaité.

6. Essai de distribution cellulaire

  1. Préparez 5 μM de solution rouge et verte Cell-Tracker dans un volume total de 2 mL de milieu DMEM/F12 complet.
  2. Après la trypsinisation, mélangez les cellules MLE-12 avec la solution rouge Cell-Tracker préalablement préparée et NIH3T3 avec la solution verte Cell-Tracker. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min pour assurer un marquage optimal des cellules. Ajouter 8 mL de milieu DMEM/F12 complet aux échantillons et centrifuger à 400 × g pendant 5 min.
    REMARQUE : Cell Tracker ne peut pas affecter la viabilité et la prolifération cellulaires. Par conséquent, les cellules colorées par Cell-Tracker peuvent être cultivées jusqu’à la confluence. L’intensité de la fluorescence dans les cellules colorées peut diminuer 4 à 5 jours après la culture.
  3. Répétez les étapes 5.3 à 5.6.
  4. Pendant l’observation au microscope confocal, transférez le puits d’insertion de la plaque de 24 puits à une plaque de 12 puits.
    REMARQUE : Cela minimise la distance entre la lentille de l’objectif et les cellules, ce qui permet d’observer la morphologie cellulaire.

7. Observations confocales de cellules cocultivées en 3D

REMARQUE : La fixation des cellules épithéliales à un NM PVA est faible par rapport à celle des fibroblastes à un NM PCL. Jetez manuellement les anciens fluides par aspiration à la pipette et ajoutez doucement le nouveau support ou la solution sur la paroi des puits. Pendant le processus de coloration, essayez de ne pas laisser sécher les membranes.

REMARQUE : La fixation des cellules peut être améliorée en enrobant la laminine ou en incorporant des peptides de motifs de liaison à l’intégrine dans les nanofibres PVA19.

  1. Transférez l’insert sur une nouvelle plaque à 24 puits. Jeter l’ancien média et ajouter 150 μL d’une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Incuber 15 min à température ambiante.
  2. Retirez la solution de PFA à 4 % et lavez les cellules collées avec 150 μL de 1x PBS.
  3. Pour le blocage et la perméabilisation, ajoutez 150 μL de sérum de chèvre normal à 5 % et 0,2 % de Triton X-100 dilué dans 1 PBS et incubez pendant 30 min à température ambiante.
  4. Préparez l’anti-zona occludens Ab (1:400) et la Phalloidin-iFlour 488 (1:1 000) conjugués à Alexa Fluor 594 en les diluant dans un réactif de diluant d’anticorps. Retirer la solution de blocage, ajouter 150 μL de solution de fluorophore par puits et incuber pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Préparez les solutions d’anticorps avec la plus grande précision, car cela aura un impact direct sur la qualité des résultats. Évitez l’exposition à la lumière.
  5. Jetez la solution d’anticorps et lavez les cellules avec 150 μL de 1x PBS pendant 10 min.
  6. Ajouter 150 μL de Hoechst 33342 dilué dans 1x PBS (1:1 000) et incuber pendant 10 min ; Évitez l’exposition à la lumière.
  7. Retirer la solution Hoechst 33342 et laver les cellules collées avec 150 μL de 1x PBS pendant 10 min.
  8. Préparez une lame de verre propre et ajoutez une quantité précise de gel de montage aqueux. À l’aide d’une pince à pointes pointues, détacher délicatement les membranes du bord environnant. Placez les membranes sur le gel de montage, en vous assurant que le côté contenant les cellules est orienté vers le haut. Ajoutez une quantité précise de gel de montage et recouvrez avec une glissière de couverture. Scellez les lames avec du vernis à ongles, assurant une étanchéité précise et complète.
  9. Observez les cellules sous un microscope confocal à l’aide des paramètres d’imagerie suivants : Laser Contrôle de la puissance : 405 Intensité 10 ; Contrôle de la puissance laser : 488 Intensité 10 ; Contrôle de la puissance laser : 561 Intensité 10 ; Sensibilité du détecteur : 420LP (valeur 600) ; Sensibilité du détecteur : 525/50 (valeur 700) ; Sensibilité du détecteur : 561LP (valeur 750).

8. Dosage de l’attachement cellulaire aux nanofibres

  1. Jetez l’ancien support et lavez les cellules avec 150 μL de 1x PBS.
  2. Fixez les cellules avec 150 μL de 3 % de GA dilué dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.
  3. Lavez les cellules avec 150 μL de 1x PBS en 10 min.
  4. Fixez les cellules secondairement en ajoutant 150 μL de tétroxyde d’osmium à 1 % (OsO4) dilué dans 1x PBS pendant 1 h.
    ATTENTION : OsO4 et sa vapeur sont nocifs. Il doit être utilisé dans une hotte.
  5. Jeter la solution et laver les cellules avec 300 μL de 1x PBS pendant 2 x 10 min.
  6. Déshydratez les cellules avec de l’éthanol gradué de 50 %, 70 %, 90 % et 95 % à 100 %, pendant 10 minutes à chaque étape. Effectuez la dernière étape de déshydratation en ajoutant de l’éthanol frais à 100 % pendant 10 min.
  7. Séchez complètement les cellules et les membranes à l’air libre. À l’aide d’une pince à pointes pointues, détachez les membranes et placez les membranes sur le porte-échantillon à l’aide d’un tapotement bilatéral. Effectuez une pulvérisation ionique pendant 5 minutes avant d’observer les cellules sous MEB à un grossissement de 2 000x.

9. Essai de croissance cellulaire

REMARQUE : Dans ce protocole, le test CCK-8 est utilisé pour quantifier le taux de croissance cellulaire en suivant les instructions du fabricant.

  1. Préparez le mélange CCK-8 en mélangeant 9 parties de DMEM/F12 préchauffé (en volume) avec 1 partie du réactif CCK-8. Après avoir retiré l’ancien milieu de culture, ajoutez 150 μL du mélange CCK-8 dans le puits contenant la cellule.
  2. Transférez l’insert sur la nouvelle plaque à 24 puits pour le séparer du puits inférieur contenant les cellules. Incuber les cellules pendant 45 min à 37 °C et 5 % de CO2.
  3. Prélever le surnageant et le transférer dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger à 1 800 × g pendant 3 min.
  4. Ajouter 100 μL du surnageant du tube de microcentrifugation à la plaque à 96 puits. Densité optique de lecture (OD) à 450 nm.

Résultats

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Ce protocole décrit les étapes critiques de la coculture des cellules épithéliales pulmonaires MLE-12 et des fibroblastes NIH3T3 en construisant un modèle à deux couches basé sur une membrane nanofibreuse (Figure 1). Ce modèle convient à l’imagerie de cellules vivantes, à l’immunohistochimie et à l’analyse quantitative des paramètres d’évaluation des cellules co-cultivées. D’autres types de cellules peuvent également être utilisés en optimisant la densité cellulaire et les conditions de croissance.

Le MEB montre la distribution uniforme des nanofibres de PVA fabriquées sans formation de billes (Figure 2A). Le diamètre des nanofibres PVA variait de 150 nm à 230 nm (180 ± 25 nm, moyenne ±écart-type (ET)). Les nanofibres des NM PCL électrofilées étaient orientées de manière aléatoire et ressemblaient structurellement au collagène (Figure 2B). La plupart des fibres des NM PCL avaient un diamètre compris entre 300 nm et 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Ainsi, la membrane nanofibreuse PVA avait des pores plus petits que la membrane nanofibreuse PCL.

Avant l’ensemencement, les cellules MLE-12 et NIH3T3 ont été colorées avec Cell-Tracker rouge et vert, respectivement, et ont été surveillées tout au long du processus de coculture. Comme le montre la figure 3, la distribution spatiale des cellules MLE-12 dans la chambre d’insertion et des cellules NIH3T3 dans la chambre inférieure a pu être observée distinctement. L’analyse de l’empilement de focales a révélé que les cellules NIH3T3 étaient dispersées et détectées à différentes profondeurs (102 ± 20 μm), tandis que les cellules MLE-12 formaient des couches d’une épaisseur de 80 ± 10 μm. Les cellules NIH3T3 infiltrent la membrane nanofibreuse PCL et s’étendent le long des axes des nanofibres, tandis que les cellules MLE-12 adhèrent à la surface de la membrane nanofibreuse PVA et présentent une agrégation (Figure 4). Ensuite, nous avons examiné l’organisation cytosquelettique des cellules NIH3T3 et des cellules MLE-12 par coloration à l’actine. Les cellules NIH3T3 cultivées sur une membrane nanofibreuse PCL montrent une distribution en projectile de filaments d’actine ressemblant à des cellules dans les tissus, et la coloration de l’actine dans les cellules MLE-12 cultivées sur une membrane nanofibreuse PVA montre des agrégats ronds sans étalement cellulaire (Figure 5).

La distribution et le modèle de croissance des cellules MLE-12 en monoculture et en coculture ont été comparés. Les cellules colorées en rouge de Cell-Tracker en monoculture sur les NM PVA ont formé des agrégats, mais les cellules en coculture ont maintenu une distribution uniforme sur la membrane (Figure 6A). Dans une analyse 3D d’images de microscopie confocale, le profil de croissance des cellules MLE-12 cocultivées sur les NM PVA montre une adhésion en couches des cellules cultivées à la membrane avec une densité cellulaire plus confluente, par rapport aux cellules cultivées en l’absence de fibroblastes (Figure 6B). De plus, l’adhésion de cellule à cellule et l’expression de l’occludine zonale (ZO)-1 à la surface des cellules (flèche indiquée), mais pas des agrégats cellulaires, étaient plus évidentes dans la condition de coculture que dans la culture sans fibroblastes (Figure 6C).

La prolifération des cellules sur les membranes a été mesurée à l’aide du test CCK-8. La prolifération des cellules NIH3T3 et MLE-12 a augmenté avec le temps (Figure 7). Cependant, des taux de croissance plus faibles des cellules ont été observés sur les membranes que sur une plaque de culture (données non présentées). Les cellules NIH3T3 et MLE-12 cocultivées sur des NM présentent un taux de croissance stable par rapport aux cellules monocultivées dans une plaque de culture.

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Figure 1 : Schéma illustrant la méthode de co-culture de fibroblastes NIH3T3 et de cellules épithéliales MLE-12 dans le système à deux couches basé sur un échafaudage. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Structure des nanofibres de PVA et PCL. (A) Les membranes nanofibreuses de PVA et (B) de PCL ont été produites par électrofilage. La structure et le diamètre des nanofibres sont mesurés par MEB des surfaces de la membrane. Barres d’échelle = 1 μm (A), 10 μm (B). Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Dans un système de coculture, la distribution spatiale des cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et des cellules MLE-12 sur la membrane nanofibreuse PVA. Les cellules NIH3T3 (4 × 105) ont été colorées avec Cell-Tracker Green, et les cellules MLE-12 (3 × 105) ont été colorées avec Cell-Tracker Red. Les cellules ensemencées ont été cultivées pendant 24 h et observées à l’aide d’une image d’empilement Z d’un microscope confocal. Les chiffres sont indiqués en μm ; Les flèches indiquent les dimensions avec x (largeur), y (longueur), z (profondeur). Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Adhésion et morphologie des cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et des cellules MLE-12 sur membrane nanofibreuse PVA. Les cellules ont été cultivées sur les membranes pendant 24 h et observées à l’aide d’un MEB à un grossissement de 2 000x. Barres d’échelle = 15 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Fibres de stress d’actine dans les cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et les cellules MLE-12 sur la membrane nanofibreuse PVA. Les cellules NIH3T3 (4 × 105) et les cellules MLE-12 (3 × 105 cellules) ont été ensemencées sur les membranes nanofibreuses PCL et PVA, respectivement. Après 48 h de culture, les cellules ont été colorées avec de la phalloïdine-iFlour 488 et observées par microscopie confocale. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone) ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Schéma de croissance de cellules MLE-12 co-cultivées sur une membrane nanofibreuse PVA. (A) Des cellules MLE-12 colorées en rouge Cell-Tracker (3 × 105 cellules) ont été ensemencées sur la membrane nanofibreuse PVA et cultivées seules (cellules -NIH3T3) et avec des cellules NIH3T3 dans un système à deux couches (+cellules NIH3T3) pendant 48 h. (B) Des cellules MLE-12 monocultivées et co-cultivées pendant 48 h ont été colorées avec Hoechst 33342 (bleu) et Phalloidin-iFlour 488 et observées à l’aide d’un microscope confocal. Les images 3D sont affichées à l’aide de la fonction de surface du logiciel Imaris. (C) Les cellules MLE-12 ont été cultivées pendant 48 h et marquées par fluorescence avec de la phalloïdine-iFlour 488 et un anticorps anti-ZO-1 (rouge). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Taux de croissance des cellules dans un système de coculture à deux couches. Les cellules NIH3T3 (4 × 10,5) et MLE-12 (3 × 10,5) sont co-cultivées pendant la durée indiquée. La croissance cellulaire dans l’insert et le puits de fond est mesurée à l’aide du test CCK-8. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Le passage de la culture 2D aux modèles de culture 3D représente une avancée significative dans le développement de modèles de coculture in vitro . Un modèle de culture 3D doit imiter le microenvironnement tissulaire dans lequel les cellules peuvent proliférer, s’agréger et se différencier22. L’utilisation de modèles de coculture 3D basés sur des échafaudages améliore la réplication de l’architecture tissulaire. Dans cette étude, un système trans-puits basé sur NM permet une coculture 3D indirecte de deux types de cellules. Le PCL NM avec de grands pores dans la chambre inférieure permet l’infiltration cellulaire et imite la matrice interstitielle. Cet échafaudage soutient la croissance et l’organisation spatiale des fibroblastes. L’utilisation d’une membrane nanofibreuse PVA dans la chambre supérieure permet la formation de cellules épithéliales MLE-12 dans la couche. Le diamètre et la taille des pores de la membrane nanofibreuse PVA en font un substrat idéal pour soutenir l’adhésion et la croissance des cellules épithéliales, qui imitent les cellules épithéliales de la membrane basale dans les tissus épithéliaux19.

Les protéines adhésives cellulaires telles que la fibronectine et la laminine sont des protéines clés de l’ECM, qui relient les cellules aux fibrilles de collagène23. Les cellules épithéliales interagissent avec la laminine par l’intermédiaire des récepteurs de l’intégrine à leur surface18. Les cellules MLE-12 ensemencées sur les NM PVA ont adhéré et se sont développées en trois dimensions sur la membrane. Cependant, la liaison des cellules épithéliales au PVA NM poreux était faible, ce qui entraînait une agrégation parce qu’elles n’avaient pas de motifs biologiques spécifiques interagissant avec les cellules cultivées. Dans notre système de coculture, le contact direct entre les cellules NIH3T3 et MLE-12 est absent, et la communication se fait exclusivement par le biais de la signalisation paracrine. La présence de cellules NIH3T3 cocultivées peut stabiliser l’attachement des cellules MLE-12 à la membrane tout au long de la période de culture. Cette stabilisation peut être attribuée à la sécrétion de facteurs solubles par les fibroblastes, notamment le collagène, la fibronectine, la laminine et divers facteurs de croissance24. En comparaison, dans un modèle tumoral avec coculture directe de fibroblastes et de cellules cancéreuses dans un échafaudage nanofibreux PCL, les fibroblastes modifient les propriétés de l’ECM par remodelage matriciel25.

Les cellules épithéliales reposent sur une membrane basale qui agit comme un support de croissance et une couche sélectivement perméable. Plusieurs stratégies technologiques, dont la technologie des organoïdes, sont actuellement en cours de développement pour créer des modèles complexes en 3D de tissus épithéliaux26. Cependant, la structure organoïde entrave l’utilisation des dosages conventionnels27. De plus, la microscopie conventionnelle pour la collecte de données expérimentales est compliquée par le fait que les organoïdes sont cultivés tout en étant intégrés dans une matrice d’hydrogel3D 27. Dans cette étude, la chambre d’insertion a été séparée de la chambre basse pour faciliter l’observation précise des cellules épithéliales cultivées sur PVA NM. De plus, les organoïdes 3D sont produits par la différenciation des cellules souches. Ainsi, la culture de cellules souches prend beaucoup de temps et constitue une procédure complexe par rapport à un système de coculture, et l’hétérogénéité des organoïdes est rapportée28.

Par rapport à la monoculture, la coculture des cellules épithéliales et des fibroblastes améliore l’adhésion à l’échafaudage et maintient la croissance et la fonction stables des cellules épithéliales cultivées. De plus, les matériaux supplémentaires, y compris les facteurs de croissance et les cytokines, ne sont pas nécessaires dans le milieu de culture en raison des facteurs solubles sécrétés par les fibroblastes co-cultivés. Malgré les avantages de l’utilisation d’échafaudages nanofibreux dans la coculture cellulaire en fournissant un support structurel, ils ne peuvent pas fournir d’ECM entourant la culture des cellules par rapport aux hydrogels biocompatibles29. Ainsi, cette limitation peut être obtenue en utilisant des cellules sur NM avec des hydrogels surstratifiés.

En conclusion, un système simple de co-culture d’inserts pour la culture simultanée de fibroblastes et de cellules épithéliales est crucial dans divers contextes physiologiques et pharmacologiques, y compris la régénération du tissu épithélial, le microenvironnement tumoral, le test de toxicité et le test d’activité du médicament. Un système de coculture 3D à base de membrane nanofibreuse sera instrumenté et conçu pour des études de dépistage de l’absorption et du transport de médicaments à haut débit.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention du Projet coréen de recherche et développement en technologie de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être social de la République de Corée (HR16C0001) ; le projet de renforcement des capacités de recherche en sciences fondamentales par le biais de la subvention de l’Institut coréen des sciences fondamentales (Centre national des installations et équipements de recherche) financée par le ministère de l’Éducation (2019R1A6C1010003) ; et les subventions de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) financées par le gouvernement coréen (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine/EDTAWelgeneLS015-01
100x Péniciline/StreptomycineGibco10378016
20x PBSSolution LPSCBP007A
4 % ParaformaldéhydeBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 Anticorps ZO-1 conjuguéInvitrogen339194
Diluant d’anticorps OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 kit de dosageDonginbioCCK-3000
Boîte de culture cellulaire (150x20)SPL20151
CellTracker Vert CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Rouge CMTPXInvitrogenC34552
ChloroformeSamchunC0584
Tube coniqueSPL50050
Verre de couvertureCorningCLS2980245
DMEM haute teneur en glucoseWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Bases de dessiccateur avec bride plane, filetageDWK Life Sciences  ;7.022 260
DURAN Couvercle de dessiccateur en verre & Robinetd’arrêt Daihan ScienceSM.2444061
DURAN Robinet d’arrêt, avec broche en PTFEDWK Life Sciences  ;
Machine d’électrofilageNanoNCESR200RD
Alcool éthylique, PureSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR  ;
Laser à fluorescence Module de scanner confocal K1-fluoSystèmes de nanoscope
Gel/montureBiomeda  ;Corp.M01
Glutaraldéhyde solutionSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Buse métallique 27GNanoNC
Vernis à onglesNature republic
Sérum de chèvre normalVector Laboratories Vector LaboratoriesS-1000
Tétroxyde d’osmiumSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Serrure Syringe_Lure en plastique (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poly(acide acrylique)Sigma Aldrich323667
Poly(alcool vinylique)Sigma Aldrich341584
PolycaprolactoneSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Microscopie électronique à balayageSECSNE-4500M
Verre à lamesMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscience OMNISCIENCEOMNI.05255
Synergy H1 Lecteur multimodeBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Références

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Electrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

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