Une opération simplifiée pour le modèle murin de perforation endovasculaire de l’hémorragie sous-arachnoïdienne

Résumé

Nous présentons ici une opération simplifiée pour le modèle murin de perforation endovasculaire de l’hémorragie sous-arachnoïdienne combinée à un scoring neurologique.

Résumé

Le modèle de perforation endovasculaire est couramment utilisé comme méthode pour simuler l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) dans les études expérimentales. Aussi complet et fiable soit-il, il nécessite des techniques compliquées. Ce protocole simplifie le modèle dans les moindres détails, combiné à un scoring neurologique. Nous utilisons une suture en nylon pour boucler et tirer l’artère carotide commune (ACC) afin de bloquer temporairement la circulation sanguine autre que la ligature traditionnelle, qui offre un champ opératoire dégagé. L’utilisation du stylo d’électrocautérisation pour fusionner les vaisseaux sanguins réduit le risque de saignement. De plus, nous utilisons un filament avec une marque noire pour faciliter la détermination de la profondeur de la crevaison.

La progression sans entrave du marqueur noir au-delà de la bifurcation carotidienne, où l’artère carotide commune (ACC) diverge dans l’artère carotide interne (ICA), accompagnée d’une résistance minimale, indique que le filament a réussi à traverser la jonction intracrânienne de l’artère cérébrale antérieure (ACA) et de l’artère cérébrale moyenne (ACA). Ce phénomène signifie le positionnement du filament à un point de convergence cérébrovasculaire critique. Ensuite, le fait d’avancer légèrement le filament vers l’avant pour perforer le vaisseau sanguin permet une opération plus facile de la perforation endovasculaire chez la souris, facilitant ainsi l’application du modèle de perforation endovasculaire chez la souris génétiquement modifiée. Cela peut être très crucial pour la recherche moléculaire et la recherche et le développement pharmaceutiques.

Introduction

L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), un sous-type grave d’accident vasculaire cérébral, est liée à des taux élevés de morbidité et de mortalité, affectant en particulier les personnes dans la mi-cinquantaine. L’HSA spontanée est principalement causée par la rupture d’anévrismes intracrâniens, qui se produit principalement dans le cercle de Willis ^1,2. Cliniquement, les patients présentent souvent des maux de tête en coup de tonnerre, un dysfonctionnement neurologique et un déclin rapide de la conscience³. Malgré les progrès des soins neurocritiques, près de 40 % des patients meurent dans le mois qui suit une hémorragie⁴. Plusieurs complications secondaires peuvent survenir après une HSA anévrismale, ce qui entraîne une détérioration neurologique progressive. Cependant, la physiopathologie et les caractéristiques cliniques de l’HSA sont encore mal comprises.

Ainsi, pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents et améliorer les stratégies thérapeutiques, des modèles complets et fiables chez les petits animaux sont indispensables. À ce jour, de nombreux protocoles ont été mis de l’avant pour établir des modèles de SEP. Par exemple, une approche consiste à injecter du sang autologue dans la citerne magna. Un autre protocole modifié implique deux injections distinctes, l’une dans la citerne magna et l’autre dans la citerne optique du chiasma. L’injection sanguine autologue a été largement adoptée en raison de sa simplicité technique et de son taux de mortalité favorable ^5,6. Pour obtenir la possibilité d’utiliser un animal de laboratoire plus petit et moins coûteux, Barry et al. ont décrit le premier modèle SAH sur des rats en 1979 qui impliquait de perforer l’artère basilaire avec des microélectrodes de tungstène après avoir retiré le crâne⁷.

En 1995, un autre modèle de perforation endovasculaire, une version modifiée du modèle Zea-Longa d’ischémie cérébrale, a été présenté, dont la forme actuelle s’est avérée plus tard être le modèle le plus couramment utilisé pour étudier l’HSA⁸. Des recherches antérieures ont démontré que les souris et les humains possèdent une structure vasculaire intracrânienne similaire, appelée cercle de Willis, où l’anévrisme intracrânien se produit principalement⁹. Cette méthode non craniotomique reproduit les mécanismes de rupture de l’anévrisme humain par une perforation de bifurcation ICA précise¹⁰. De plus, la souris génétiquement modifiée est fréquemment utilisée dans l’étude des mécanismes moléculaires. Cependant, en raison de ses techniques compliquées chez les petits animaux, le modèle de perforation endovasculaire est principalement utilisé chez les rats ou les lapins, tandis que son application chez les souris est comparativement moins courante. Par conséquent, il est d’une grande importance de simplifier le modèle murin de perforation endovasculaire et de réduire son taux de mortalité élevé.

Ici, nous présentons une modification simplifiée du modèle murin de perforation endovasculaire, intégrant une version modifiée de l’échelle d’évaluation neurologique de Garcia¹¹. Notre modification fournit un modèle facile, pratique et fiable pour les futures études expérimentales de l’HSA.

Protocole

Des souris mâles C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines), exemptes d’agents pathogènes spécifiques, ont été maintenues dans une animalerie avec une température et des conditions d’acclimatation régulées, maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les souris ont bénéficié d’un accès illimité à un régime alimentaire standard pour rongeurs et à de l’eau du robinet stérilisée. Une période d’acclimatation de 2 semaines a été autorisée avant le début des expériences. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Longhua et menées conformément aux directives du Comité national des sciences et de la technologie de Chine pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation des animaux

1. Placez la souris sur un coussin chauffant préchauffé à 37 °C et continuez à maintenir cette température jusqu’à ce que l’opération soit terminée.
2. Anesthésier la souris par inhalation de 2 à 2,5 % d’isoflurane. Maintenir avec 1-1,5 % d’isoflurane pendant le fonctionnement à un débit de 0,4-0,6 L/min.
3. Placez la souris sur la table d’opération, stabilisez sa tête, maintenez-la en position couchée et fixez ses membres avec du ruban adhésif.

2. Induction SAH

1. Incisez la peau à l’aide d’une paire de ciseaux le long du milieu de la partie antérieure du cou (figure 1A).
2. Disséquez le tissu conjonctif et exposez l’artère carotide commune gauche (ACC) et ses bifurcations.
   REMARQUE : Protégez le nerf vague et les glandes adjacentes avec précaution (Figure 1B).
3. Enroulez le CCA avec une suture en nylon 6-0 et laissez les deux extrémités libres sans ligature (Figure 1C).
4. Connectez les deux extrémités de la suture au ruban et tirez doucement la suture vers le bas et vers la droite à un angle de 45° par rapport au plan horizontal. Fixez le ruban à la table d’opération pour bloquer temporairement l’ACC (Figure 1D).
   REMARQUE : Lorsque le flux sanguin à l’intérieur du vaisseau occlus devient filiforme, cela indique une occlusion réussie.
5. Lister l’artère carotide externe (ECA) avec une suture en nylon (Figure 1E).
   REMARQUE : Le site de cautérisation doit être aussi proche que possible de l’extrémité supérieure, avec une longueur d’environ 2 mm de la bifurcation carotidienne.
6. Fusionner l’ECA distal au site de ligature à l’aide d’un stylo d’électrocautérisation (Figure 1F).
7. Tirez lentement l’ECA vers le bas jusqu’à ce que l’artère carotide interne (ICA) soit exposée. Alignez l’ECA et l’ICA en ligne droite, en vous assurant de la bonne position pour la procédure suivante (Figure 1G).
8. Affûtez le haut du filament. Un point de repère sur le filament est situé à 8 mm du haut.
9. Faites une petite incision avec des ciseaux pour l’insertion du filament dans l’ECA. Insérez le filament à l’aide d’une pince (Figure 1H).
10. Faites avancer le filament avec précaution avec une pince jusqu’à ce que la marque noire passe complètement à travers la bifurcation de l’ACC et de l’ICA. Avancez légèrement de 2 mm pour percer le vaisseau sanguin (Figure 1I).
    REMARQUE : Une résistance significative est ressentie, ce qui indique que la bifurcation de l’artère cérébrale antérieure (ACA) et de l’artère cérébrale moyenne (MCA) a été atteinte.
11. Rétractez le filament immédiatement après la perforation.
12. Fusionnez l’ECA à l’aide d’un stylo d’électrocautérisation (Figure 1J).
13. Retirez le ruban adhésif et retirez la suture en nylon de l’ACC pour rétablir la circulation sanguine. Observez la pulsation évidente du CCA (Figure 1K).
14. Fermez l’incision du cou avec des sutures résorbables 5-0.

3. Groupe fictif

1. Dans le groupe simulé, effectuer la même opération chirurgicale sauf que le filament est avancé partiellement dans l’ICA et retiré sans perforation¹².

4. Fin de l’expérience

1. Vingt-quatre heures après l’opération, évaluez les performances neurologiques selon la version modifiée du système de notation rapportée par Sugawara et ^al.11 (à partir de l’original Garcia et ^al.13). Effectuez les six évaluations suivantes à l’aveugle : activité spontanée, mouvement de tous les membres, mouvement des membres antérieurs, escalade de la paroi de la cage métallique, réponse au toucher des deux côtés du tronc et réaction à la stimulation des vibrisses. Évaluez la fonction neurologique à l’aide du tableau de notation du comportement (tableau 1).
2. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane inhalé. Placez la souris en position couchée et fixez-la à la table d’opération avec du ruban adhésif, en fixant ses membres. Ensuite, à l’aide de ciseaux, faites une incision le long de la ligne médiane de l’abdomen, coupez la paroi abdominale et exposez la cavité thoracique. Coupez soigneusement le sternum pour exposer le cœur.
3. Insérez soigneusement une aiguille de perfusion dans le ventricule gauche, en vous assurant que l’aiguille est stable et ne pénètre pas dans le cœur.
4. Commencer à perfuser avec du PBS 1x prérefroidi (4 °C) à un débit approprié (environ 10 mL/min) jusqu’à ce que le liquide sortant devienne clair et transparent, indiquant que le sang a été complètement remplacé.
5. Une fois la perfusion terminée, retirez l’aiguille de perfusion et arrêtez la perfusion de liquide. Procédez au prélèvement de tissu cérébral.

5. Prise en charge postopératoire

1. Lors de la fermeture de la peau, administrez une injection intramusculaire de lornoxicam pour soulager la douleur des souris.
2. Pendant la chirurgie, appliquez une pommade oculaire à l’érythromycine sur les deux yeux pour améliorer la sécheresse des yeux.
3. Après la chirurgie, en fonction de la quantité de sang perdue pendant le processus chirurgical, injectez 0,2 à 0,4 ml de solution saline dans la souris par voie intrapéritonéale pour le remplacement du liquide.
4. Injecter par voie intramusculaire de la pénicilline à une dose de 40 000 unités par jour pendant 3 jours consécutifs pour prévenir l’infection.
5. Vérifiez régulièrement la respiration spontanée des animaux pendant les premières heures après l’opération et surveillez-les deux fois par jour pour des critères d’évaluation sans cruauté prédéfinis. Euthanasier immédiatement les souris avec du CO₂ s’il s’avère qu’elles ont des problèmes respiratoires causés par la chirurgie ou qu’elles répondent à l’un des critères d’évaluation, y compris une perte de poids de >20 % par rapport au départ, une incapacité persistante d’accéder à la nourriture ou à l’eau ou de graves déficits neurologiques.
   REMARQUE : L’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir sa position couchée sternale et n’est pas renvoyé en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.

Résultats

Scores neurologiques
Neuf souris de chaque groupe ont été évaluées 24 h après l’opération à l’aide d’une modification du système de notation rapportée par Sugawara et ^coll.11 pour évaluer l’HSA. Le score maximal pouvant être obtenu est de 18. Parmi eux, n = 9 animaux du groupe fictif ont tous obtenu un score de 18. Dans le groupe HSA, le score moyen était de 11 (p < 0,0001) (figure 2).

Changements pathologique...

Discussion

Pour conclure, cette étude présente un modèle murin simplifié et fiable d’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) induite par l’insertion de filaments endovasculaires, offrant une approche pratique et efficace. Par rapport au modèle de perforation endovasculaire existant, ce protocole est le même dans l’étape de perforation : le filament est introduit dans l’artère carotide externe (ECA), avancé à travers l’artère carotide commune (ACC), puis dirigé dans l’artère carotide interne (ICA), où ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6 souris  ;	; Shanghai Jiesjie Laboratory Animal Co., LTD
©c. stylo d’électrocautérisation	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Convient pour une utilisation dans les chirurgies mineures superficielles, la coagulation des tissus et la cautérisation de la végétation.
isoflurance  ;	RWD  ;	L’isoflurane R650-IE	est un anesthésique général inhalé. Il a un faible coefficient de partage sang/gaz. Lorsqu’il est utilisé pour l’anesthésie animale, il peut induire une anesthésie en douceur, rapidement et confortablement, avec une récupération rapide, une bonne relaxation musculaire et aucun effet excitateur sur le système nerveux sympathique. Le taux métabolique de l’isoflurane dans le foie est faible, il a donc peu de toxicité pour le foie, et il n’y a pas d’effets secondaires évidents, même avec une utilisation répétée. Pour éviter les effets néfastes des gaz résiduaires anesthésiques sur l’environnement et le personnel de laboratoire, il est recommandé de l’utiliser avec un système de récupération des gaz.
Filament MACO	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Principalement utilisé pour les souris pesant de 20 à 25 g, l’embout de suture est fondu en une forme hémisphérique, sans revêtement en polylysine ou en silicone, marqué à 9-10 mm de l’embout, désinfecté et peut être utilisé directement. Ce modèle a trois spécifications d’emballage. Il est recommandé de mener une pré-expérience avant l’expérience formelle afin de déterminer le modèle approprié.
microscope	Olympus	BX61VS	Un microscope droit entièrement motorisé équipé du système optique UIS2, conçu pour une imagerie haute résolution et de haute précision. Les caractéristiques comprennent un tourelle, une platine et une mise au point motorisées, ainsi que des capacités de diapositives virtuelles pour créer de grandes images numériques haute résolution d’échantillons. Convient aux applications de recherche avancées en pathologie, biologie cellulaire, neurosciences et science des matériaux.
suture en nylon	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	; J1110	Une suture chirurgicale non résorbable fabriquée à partir de matériaux biocompatibles à haute résistance.