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Article de méthode

Conception et validation d’une bio-imprimante à extrusion volumétrique pour la bio-impression d’extrait soluble de membrane basale pour la recherche translationnelle

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DOI :

10.3791/67788

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28 mars 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Biological Structure Mechanics (LaBS), Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

Dans cet article

Résumé

Les extraits solubles de membrane basale sont les matrices biologiques les plus largement utilisées dans la recherche sur le cancer, mais leur comportement rhéologique complexe rend leur bio-impression difficile avec les systèmes de bio-impression disponibles dans le commerce. Ce travail présente une stratégie de bio-impression personnalisée pour produire des constructions matricielles pures avec une bonne fidélité de forme en couches simples et multiples.

Résumé

Dans la recherche translationnelle, les modèles 3D in vitro sont essentiels pour faire progresser la compréhension scientifique et le développement thérapeutique. À cette fin, les extraits solubles de membrane basale (SBMes), dérivés de cellules de sarcome de souris, jouent un rôle clé dans la réplication des caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement in vivo . Ils sont particulièrement précieux dans une variété de domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments. En particulier, elles sont devenues fondamentales dans la recherche sur le cancer car les cultures cellulaires 2D traditionnelles, largement utilisées dans le domaine, peuvent fournir des informations trompeuses car elles ne capturent pas la structure tridimensionnelle (3D) et le microenvironnement tumoral.

Dans la recherche sur le cancer, des modèles 3D in vitro efficaces sont essentiels pour mieux comprendre l’évolution du cancer et anticiper les défis, tels que les mécanismes de résistance aux médicaments. Les organoïdes sont devenus des modèles 3D in vitro prometteurs, offrant une représentation plus précise de la biologie tumorale. Ils se développent dans les SBM car ils créent un environnement où les cellules peuvent se développer et s’auto-organiser en structures 3D. Cependant, le SBMe présente des défis importants, notamment de faibles propriétés mécaniques et un comportement rhéologique complexe, empêchant son utilisation avec les systèmes de bio-impression par extrusion pneumatique disponibles dans le commerce.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un système de bio-impression à faible coût, contrôlé par volume, ainsi qu’un protocole spécifique pour l’impression de structures avec SBMe. Ce système est basé sur une extrudeuse volumétrique et surmonte les limites des approches pneumatiques traditionnelles. Une fois assemblé et programmé avec un code g spécifique, le système peut bio-imprimer des SBMe purs et dilués pour obtenir des constructions monocouches et multicouches. Cette approche offre une méthode plus fiable et plus évolutive pour produire des modèles de culture cellulaire 3D, ouvrant la voie à une recherche plus efficace sur de nouveaux traitements et des tests de médicaments.

Introduction

Dans la recherche translationnelle, la création de modèles 3D in vitro qui reproduisent fidèlement l’environnement in vivo est essentielle pour faire progresser la compréhension scientifique et le développement thérapeutique1. Un élément clé de leur construction est l’utilisation d’analogues de matrice extracellulaire (ECM), tels que les extraits solubles de membrane basale (SBMes), qui reflètent mieux les complexités des tissus naturels. Les SBM sont particulièrement précieux dans divers domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments 2,3. En particulier, ils sont devenus fondamentaux dans la recherche sur le cancer, car ils reproduisent les caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement tumoral, permettant le développement de modèles qui reflètent mieux la croissance tumorale, les métastases et les réponses au traitement.

En effet, malgré des progrès considérables au cours des dernières décennies, de nombreuses thérapies continuent d’échouer, entraînant de fréquents échecs thérapeutiques en milieu clinique. Cet échec est souvent attribué à des mécanismes de résistance aux médicaments causés par des niveaux élevés d’hétérogénéité cellulaire 4,5. Des modèles in vitro efficaces, capables de récapituler avec précision les complexités des tumeurs humaines, sont cruciaux pour mieux comprendre l’évolution du cancer et anticiper ce phénomène.

Les cultures cellulaires 2D traditionnelles ont été fondamentales dans la recherche sur le cancer, mais peuvent conduire à des informations trompeuses sur l’efficacité des médicaments et le comportement tumorale, car elles ne parviennent pas à capturer la structure 3D et le microenvironnement des tumeurs réelles 6,7,8. En revanche, les modèles 3D in vitro sont apparus comme des alternatives prometteuses, offrant une représentation plus précise du microenvironnement tumoral et du comportement biologique en imitant la complexité 3D 9,10.

Dans la recherche sur le cancer, les organoïdes sont largement utilisés comme modèles 3D pour étudier les maladies et l’efficacité des médicaments, car ils fournissent des modèles plus précis et pertinents de tissus et d’organes humains. L’utilisation de SBMe, dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm, a joué un rôle essentiel dans l’avancement de la recherche sur le cancer11,12. Il fournit un substrat semblable à un gel dans lequel les cellules peuvent croître, proliférer et s’auto-organiser en structures organoïdes, assurant ainsi un développement et une croissance corrects13,14.

Cependant, SBMe pose un certain nombre de défis en raison de ses caractéristiques uniques et complexes. En tant que fluide non newtonien, le SBMe présente des propriétés d’amincissement par cisaillement, ce qui signifie que sa viscosité diminue avec l’augmentation de la contrainte de cisaillement, ce qui rend sa manipulation et son application incohérentes sous des forces variables. De plus, son comportement thixotrope ajoute à la complexité, car il peut récupérer sa viscosité au fil du temps lorsque la contrainte de cisaillement est supprimée15,16. Ces propriétés, associées à une faible résistance mécanique (avec des valeurs de module de stockage allant de 10 Pa à 5 000 Pa selon la concentration en protéines) et à un comportement thermosensible, aggravent ces défis, nécessitant un contrôle méticuleux lors de la préparation et de l’utilisation ainsi que la bio-impression pure.

Les systèmes de bio-impression pneumatiques standard ne parviennent pas à contrôler correctement la distribution de SBMe, car l’application de la pression provoque un comportement incontrôlable après son éjection de la seringue. Il est affecté par un phénomène similaire à l’effet « spurt » décrit pour les fusions polymères, dans lequel le débit augmente brusquement au-dessus d’une certaine valeur de pression critique 17,18,19. Comme indiqué dans nos travaux précédents16, la stratégie de distribution par contrôle volumétrique permet de découpler l’extrusion SBMe de la pression générée dans le distributeur, qui dépend des propriétés rhéologiques de la matrice, des conditions de travail et de la géométrie de la buse. Ces dernières années, plusieurs tentatives ont été faites sur le marché pour exploiter le même principe, avec le Matribot de Corning en tête. Il permet la manipulation et le dépôt de SBMe et d’autres bio-encres sensibles à la température grâce à des conditions de température contrôlées. Cependant, cela peut être coûteux, limitant l’accessibilité pour les petits laboratoires.

Dans notre article précédent, nous avons présenté une alternative personnalisée à faible coût, un système de bio-impression volumétrique16. Cette version était basée sur une imprimante 3D d’entrée de gamme modifiée avec une extrudeuse imprimée en 3D personnalisée. Malgré son efficacité dans la bio-impression, il présentait certaines limites dans la répétabilité de l’impression. Étant dérivé d’une imprimante 3D d’entrée de gamme, il avait quelques problèmes avec les mouvements Z et l’auto-homing. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé une version avancée de notre système de distribution volumétrique personnalisé à faible coût et un protocole spécifique pour les structures de bio-impression à l’aide de SBMe.

Ici, nous fournissons des protocoles pour la construction et l’utilisation de ce système. Il est composé d’une extrudeuse volumétrique personnalisée, basée sur notre étude précédente16, d’un boîtier de bio-imprimante et d’un système de contrôle. La production et l’assemblage sont effectués pour chaque module. Lorsqu’il est assemblé et programmé avec un fichier gcode spécifique, conformément à la description du protocole pour la manipulation des matrices, le système est capable de bio-imprimer des constructions pures ou diluées à l’aide du SBMe avec une bonne fidélité de forme en couches simples et multiples.

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Protocole

1. 3D impression et assemblage de bio-imprimante volumétrique

  1. Préparez et imprimez en 3D les composants de la bio-imprimante.
    1. Téléchargez le fichier *. Fichiers de conception STL du Fichier supplémentaire 1.
    2. Charger*. STL dans le logiciel de tranchage propriétaire pour définir l’orientation des pièces sur la plaque d’impression et toutes les options requises pour l’imprimante 3D. Imprimez les pièces à l’aide d’acide polylactique (PLA) avec des options de qualité moyenne (taille de buse de 0,4 mm, diamètre de filament de 1,75 mm, température de l’extrudeuse de 220 °C, température de la plaque de lit d’impression de 50 °C, hauteur de couche de 0,2 mm, vitesse d’impression de 300 mm/s).
      REMARQUE : Les options de qualité moyenne peuvent différer selon l’imprimante utilisée pour imprimer les pièces.
    3. Détachez les pièces imprimées du lit de l’imprimante 3D. Retirez les structures de support imprimées, le cas échéant, et polissez les surfaces si nécessaire.
  2. Assemblez l’extrudeuse (Figure 1).
    1. Insérez deux roulements à billes linéaires (LM4UU) dans les trous verticaux du bloc poussoir. Insérez également un écrou de vis-mère T8 dans le trou central arrière et fixez-le avec quatre vis (M3x10).
    2. Fixez un accouplement d’arbre rigide au moteur pas à pas, puis fixez-le au boîtier du moteur de l’extrudeuse à l’aide de quatre vis (M3x6).
      REMARQUE : Orientez le moteur pas à pas en fonction de la rainure dans le boîtier du moteur de l’extrudeuse pour permettre un positionnement correct de la prise pour les câbles.
    3. Fixez le moteur pas à pas, assemblé à l’étape 1.2.2, à une vis mère T8 (150 mm) à l’aide de l’accouplement à arbre rigide préalablement inséré. Assurez-vous que chaque bloc est correctement fixé avec les vis de réglage.
    4. Fixez un palier à bride auto-alignant (diamètre intérieur de 8 mm) au bas de la base de l’extrudeuse à l’aide de deux vis (M4x8).
    5. Insérez deux roulements à billes (4 x 9 x 4 mm) dans les trous spécifiques situés sur le dessus de la base de l’extrudeuse et les deux autres dans les trous de la partie inférieure.
    6. Insérez la pièce assemblée (étape 1.2.1) dans la base de l’extrudeuse à travers la cavité située dans la partie supérieure de la structure. Connectez les quatre roulements à billes (étape 1.2.5) avec deux tiges de 4 mm, une de chaque côté. Laissez passer les tiges à travers les deux roulements à billes linéaires de la pièce assemblée à l’étape 1.2.1.
      REMARQUE : Il est également possible d’insérer d’abord les barres sur les deux roulements à billes supérieurs, puis de les placer dans la base de l’extrudeuse jusqu’à ce qu’elles atteignent le roulement à billes inférieur et que tout soit sécurisé dans les fentes définies.
    7. Insérez la pièce assemblée à l’étape 1.2.3 dans le trou central de la base de l’extrudeuse. Tournez la vis-mère pour passer l’écrou de la vis-mère et atteindre le palier de bride à alignement automatique. Utilisez les vis de réglage du composant pour verrouiller la vis mère et deux vis (M3x8) pour fixer le boîtier du moteur de l’extrudeuse sur le dessus de la base de l’extrudeuse.
    8. Utilisez deux autres vis (M3x40) et des écrous M3 pour fixer le dispositif de retenue de la bride du corps de la seringue à la partie inférieure de la base de l’extrudeuse, pour verrouiller la bride du corps de la seringue (insérer le sens de haut en bas). Utilisez deux autres vis (M3x30) et des écrous M3 pour fixer le dispositif de retenue du piston de la seringue aux trous supérieurs du bloc poussoir (insérer le sens de bas en haut) afin de verrouiller la bride du piston.
    9. Insérez deux vis (M4x80) dans deux ressorts et laissez-les passer à travers les trous présents dans la partie inférieure de la base de l’extrudeuse et le bloc de seringue. Vissez les écrous en laissant l’espace pour la seringue afin d’éviter que le bloc de seringue ne glisse.
      REMARQUE : Les vis doivent aller de l’arrière vers l’avant.
  3. Assemblez l’axe X (Figure 2).
    1. Insérez quatre roulements à billes linéaires (LM8UU x 24 mm) dans le X_Left_Block et X_Right_Block pièces dans les trous supérieur et inférieur, deux pour chacun. Fixez également deux blocs de ceinture sur les blocs X droit et X gauche avec des vis (M2x10) en laissant de l’espace pour la ceinture.
    2. Insérez deux roulements à billes (5 x 16 x 5 mm) dans les trous centraux de X_Right_Block, un de chaque côté. Placez une poulie (alésage de 5 mm) dans la cavité intérieure de X_Right_Block et reliez les deux roulements à billes avec une tige de 5 mm (longueur 35 mm), en la laissant passer à travers la poulie.
      REMARQUE : Utilisez une tige plus longue pour l’assemblage afin d’avoir une meilleure manipulation. Après avoir positionné les pièces en place, coupez la tige de la longueur souhaitée.
    3. Fixez un interrupteur de fin de course au X_motor_housing à l’aide de deux vis (M3x8). Insérez le moteur NEMA 17 dans le carter du moteur et utilisez quatre vis (M3x8) pour fixer le couvercle du X_block_1 au carter du moteur et au moteur.
    4. Fixez une poulie (alésage 5 mm) au moteur et verrouillez-la avec des vis de réglage, puis vissez ensemble la pièce assemblée à l’étape 1.3.3 pour X_block_1 avec quatre vis (M5x8). Fixez également un interrupteur de fin de course au bas de X_Left_Block avec deux vis (M3x8).
      REMARQUE : Le diamètre extérieur des poulies des étapes 1.3.2 et 1.3.4 doit être le même.
    5. Placez deux roulements à billes linéaires (LM8UU x 45 mm) dans les trous en haut et en bas du X_slider.
    6. Connectez les pièces assemblées aux étapes 1.3.2 et 1.3.4 à l’aide de deux tiges de 8 mm (longueur 200 mm) et laissez-les passer à travers la pièce assemblée à l’étape 1.3.5.
      REMARQUE : Coupez les tiges de la longueur souhaitée avant de les assembler.
    7. Verrouillez une extrémité de la courroie à la X_slider_belt_connection à l’aide du bloc de courroie et de deux vis (M2x8). Faites passer la courroie autour de la poulie dans la pièce assemblée 1.3.4, puis autour de la poulie dans la pièce assemblée 1.3.2 et fixez l’autre extrémité de la courroie à la connexion X_slider_belt à l’aide du deuxième bloc de courroie et de deux autres vis (M2x8). Assurez-vous que la ceinture est correctement serrée pour obtenir le bon mouvement.
      REMARQUE : Au cours de cette étape, le X_slider doit être déplacé vers une extrémité de la structure de l’axe X pour éviter les interférences.
    8. Vissez le X_slider_belt_connection au X_slider à l’aide d’une vis (M6x20).
    9. Connectez l’extrudeur à la X_slider et fixez-le à l’aide de quatre vis (M5x10).
  4. Assemblez l’axe Y (Figure 3).
    1. Placez le support de fixation sur la partie arrière de la bio-imprimante à l’aide de quatre vis (M3x10) et de quatre écrous.
      REMARQUE : La position du support de fixation peut être adaptée pour obtenir la bonne tension de la courroie et permettre l’insertion du moteur pas à pas.
    2. Insérez le moteur pas à pas dans le support de fixation et vissez-le à l’aide de quatre vis (M3x8). Ensuite, placez une poulie (alésage 5 mm) sur le vilebrequin et fixez-la avec des vis de réglage.
      REMARQUE : La poulie peut être fixée au vilebrequin avant de mettre le moteur dans le support de fixation pour éviter certaines interférences entre les composants.
    3. Localisez deux poulies (8 mm de diamètre intérieur) sur la tige avant de 8 mm et verrouillez-les sur les deux tiges (à 2,5 cm de l’extrémité). Répétez cette opération pour la tige arrière et ajoutez une autre poulie, à 5 cm de l’extrémité droite.
    4. Fixez 12 paliers à bride auto-alignants (8 mm de diamètre) aux parties supérieures intérieures de la bio-imprimante.
    5. Connectez les deux pièces de la bio-imprimante à l’avant et les deux pièces de la bio-imprimante à l’arrière (direction gauche/droite) à l’aide des tiges assemblées à l’étape 1.4.3 et verrouillez-les sur les roulements à bride à alignement automatique (8 mm de diamètre). Fixez les deux pièces assemblées à toutes les jonctions avec des vis (M3x8).
      REMARQUE : Lors du positionnement de la tige arrière, placez une courroie fermée qui relie la poulie sur le moteur pas à pas avec la poulie intérieure sur la tige.
      REMARQUE : Fixez le moteur pas à pas en serrant les écrous pour assurer l’absence de mouvement du moteur et une tension correcte de la courroie.
    6. Connectez les deux pièces assemblées à l’étape 1.4.5 à l’aide de quatre tiges de 8 mm. Laissez passer les tiges à travers les roulements à billes linéaires présents dans la pièce assemblée 1.3 et verrouillez-les sur les roulements à bride auto-alignants (8 mm de diamètre). Fixez les deux pièces assemblées à toutes les jonctions avec des vis (M3x8).
    7. Fixez une extrémité de courroie ouverte sur la partie supérieure du X_block_1 à l’aide du bloc de courroie et répétez cette opération pour le X_block_2. Faites passer la courroie autour des poulies arrière sur la gauche, puis autour de la poulie avant, et fixez à nouveau l’autre extrémité de la courroie au X_block_1 avec un autre bloc de courroie. Répétez cette opération pour la deuxième bande.
      REMARQUE : Les courroies doivent être correctement serrées pour obtenir le mouvement correct et de la même longueur pour éviter la flexion ou l’interférence dans les mouvements en Y.
  5. Assemblez l’axe Z (Figure 4).
    1. Vissez ensemble les pièces inférieures du boîtier de la bio-imprimante (M4x8).
    2. Fixez un palier à bride auto-alignant (8 mm de diamètre) au sol du bas de la pièce assemblée à l’étape 1.5.2.
    3. Fixez deux roulements à billes linéaires à brides (LMH8UU) aux trous extérieurs présents dans le Z_slider et un écrou de vis-mère dans le trou central avec des vis (M3x8).
    4. Fixez un interrupteur de fin de course sur le côté Z_plane gauche à l’aide de deux vis (M3x8).
    5. Fixez le moteur pas à pas à un accouplement à arbre rigide. Fixez un moteur pas à pas à la Z_block à l’aide de quatre vis (M3x20) et d’une tige filetée à l’accouplement à arbre rigide. Assurez-vous que chaque bloc est correctement fixé avec les vis de réglage.
    6. Connectez la pièce assemblée à l’étape 1.5.5 à la base de la bio-imprimante à l’aide de deux tiges de 8 mm. Laissez-les passer à travers la pièce assemblée à l’étape 1.5.3.
    7. Fixez le Z_block au panneau arrière à l’aide de deux vis (M5x8).
    8. Connectez Z_plane à Z_slider à l’aide de quatre vis (M3x25). Insérez-les dans les trous de Z_plane de haut en bas, passez le ressort entre Z_plane et Z_slider et fixez-les avec des écrous. Ajustez la tension du ressort pour niveler le rabot.
    9. Fixez quatre pieds réglables sous la structure de la bio-imprimante dans la cavité spécifique. Mettez la bio-imprimante à niveau en ajustant les pieds.
    10. Connectez la pièce assemblée à la pièce assemblée à l’étape 1.4.6 à l’aide de huit vis (M4x12).
    11. Fixez deux charnières à l’avant de la structure aux endroits spécifiques et un aimant sur la partie droite à l’endroit correspondant avec des vis (M2x8). Vissez l’ensemble de la structure sur des plaques de plexiglas transparentes de 2 mm pour fermer les ouvertures.
      REMARQUE : Vissez le panneau avant en plexiglas aux charnières et mettez une autre vis en correspondance avec l’aimant pour obtenir une porte avant.
  6. Affichez l’ensemble (Figure 5A).
    1. Laissez passer les fils, connectés à l’écran, par le trou inférieur et fixez l’écran au boîtier de l’écran à l’aide de quatre vis (M3x3).
      REMARQUE : Ce passage doit être effectué sans le couvercle du bouton LCD. Il peut être situé sur le bouton préinstallé après la fixation au boîtier de l’écran.
    2. Fermez le boîtier avec le couvercle à l’aide de quatre vis (M2x6).
    3. Insérez la carte SD dans l’emplacement gauche.
    4. Laissez passer les fils à travers le trou situé sur le dessus de la structure. Vissez la pièce assemblée en haut de la bio-imprimante à l’aide de deux vis (M3x8).
      REMARQUE : Tous les fils (moteurs, interrupteurs de fin de course et écran) passeront près du mur et sortiront du trou inférieur gauche. Ils sont fixés à l’aide de serre-câbles pour éviter les interférences avec les pièces mécaniques.
  7. Assemblage électronique (Figure 5B)
    1. Fixez la douille à la partie extérieure du boîtier électronique à l’aide de deux vis (M3x10).
    2. Fixez la carte mère à la partie intérieure du boîtier électronique à l’aide de quatre vis (M3x10).
    3. Fixez la partie inférieure de l’alimentation à la partie intérieure du boîtier électronique à l’aide de quatre vis (M3x8).
    4. Passez les fils dans le trou circulaire du couvercle et connectez-les à la carte mère. Fermez le boîtier électronique avec son couvercle à l’aide de quatre vis (M3x10).
      REMARQUE : Il est possible de connecter le boîtier électronique à la structure de la bio-imprimante ou de le laisser sur le bureau en cas de petits espaces de travail.
      La figure 6 montre toutes les connexions de câbles électroniques. Ils peuvent être légèrement différents en fonction de la carte mère de l’imprimante 3D utilisée.

2. Paramétrage du logiciel et processus de génération de gcode

  1. Préparation des paramètres du logiciel de découpage
    1. Ouvrez le logiciel de découpage.
      REMARQUE : Les instructions peuvent différer selon le logiciel utilisé ou la version.
    2. Connectez-vous à la plateforme.
    3. Allez dans les options Paramètres . Sélectionnez l’imprimante, puis Ajouter une imprimante non connectée. Sélectionnez Imprimante FFF personnalisée et, dans la zone Nom de l’imprimante, tapez le nom de l’imprimante. Cliquez sur Ajouter.
      REMARQUE : S’il s’agit de la première installation logicielle, le panneau Ajouter une imprimante s’ouvrira automatiquement après la connexion.
    4. Dans la fenêtre Paramètres de la machine, modifiez les paramètres par défaut x, y, z en 176, 120, 45 mm.
    5. Désélectionnez l’option Lit chauffant si elle n’est pas déjà désélectionnée.
    6. Insérez dans les panneaux G-code de début et Fin du g-code les lignes de texte indiquées dans les fichiers intitulés 'JoVE_Starting_G-code.txt' et 'JoVE_Ending_G-code.txt' dans le fichier supplémentaire 2.
      1. Modifiez la valeur 150 de la ligne 'M92 E150' dans le fichier de g-code de départ en fonction du débit à appliquer. Estimez la valeur correcte à l’aide de la formule suivante :
        figure-protocol-1
        Où Q est le débit souhaité [μL/min].
        REMARQUE : Cette formule a été obtenue expérimentalement avec le système décrit. Il peut en être autrement s’il y a des modifications au niveau des composants mécaniques ou électriques. Une alternative possible pourrait être de fixer la valeur en fonction du système utilisé et de créer un code MATLAB personnalisé pour générer le fichier gcode souhaité.
    7. Changez la valeur du diamètre du matériau compatible dans le panneau de l’extrudeuse 1 sur 1,75 , puis fermez.
    8. Allez sur Marketplace, sélectionnez le plugin Z Offset Setting et installez-le. À la fin du processus, redémarrez le logiciel pour finaliser. Une fois qu’il s’ouvre à nouveau, sélectionnez Paramètres | Imprimante | Gérer les imprimantes dans la barre d’outils. Dans la fenêtre Préférences , cliquez sur Paramètres et activez toutes les options en sélectionnant Cocher toutes les options et fermez-la.
    9. Configurez la configuration en cliquant sur Paramètres d’impression (troisième bouton) dans le menu de l’étape , qui contient le panneau de configuration . Entrez le pourcentage de remplissage dans le profil d’impression actuel dans le panneau de configuration . Sélectionnez le bouton Personnalisé pour modifier les paramètres d’impression actuels et le profil Fine dans le menu déroulant. Réglez la vitesse d’impression sur 10 mm/s.
  2. Préparation gcode
    1. Téléchargez le fichier *. Dossier de conception STL, intitulé « JoVE_Square », tiré du Dossier supplémentaire 2 de cet article.
    2. Charger. STL dans le logiciel de découpage.
    3. Localisez la pièce sur la surface plane et déplacez-la aux coordonnées 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Créez deux copies en cliquant sur le . STL dans la liste des objets et en sélectionnant l’option multiplier la sélection. Déplacez-les aux coordonnées suivantes : 16, 42,5, 0 mm et -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      REMARQUE : Il n’est pas possible de définir automatiquement l’ordre d’impression à moins d’être modifié manuellement directement dans le fichier gcode final. Les coordonnées sont définies pour une plaque à 6 multipuits.
    4. Allez dans les paramètres d’impression dans le menu de l’étape . Dans la section Murs , mettez 0 comme Nombre de lignes de mur. Mettez 0 comme valeur d’épaisseur Haut/Bas dans la section Haut/Bas . Dans le panneau Remplissage , insérez les valeurs suivantes : Motif de remplissage : Grille, Distance de la ligne de remplissage : 5 mm, Directions de la ligne de remplissage : [0].
      REMARQUE : Il est possible de réduire la vitesse de déplacement dans la section Vitesse d’impression pour améliorer la précision de l’axe X.
    5. Désactivez la rétraction dans la section Voyage et le refroidissement de l’impression dans la section Refroidissement .
    6. Dans la section Adhérence de la plaque de fabrication , sélectionnez Aucun comme type d’adhérence de la plaque de fabrication, tandis que dans la section Modes spéciaux , sélectionnez l’option Un à la fois comme Séquence d’impression.
    7. Cliquez sur le bouton Slice pour générer le g-code.
    8. Ouvrez le fichier g-code avec l’application Bloc-notes et supprimez les lignes « M104 S200 », « M105 » et « M109 S200 » à la ligne 12 après la phrase « ; Généré avec Cura_SteamEngine 4.9.0".
    9. Ajouter « G1 Z25 » avant la ligne suivante « ; MAILLE : JoVE_Square_rev. STL(6)" et scindions le suivant en deux : (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 et (2) G1 Z0.3.
      REMARQUE : Les coordonnées X et Y ne sont que des exemples.
    10. Modifiez la valeur Z à Z25 dans chaque ligne présente après " ; TIME_ELAPSED" commentent chaque instruction de chaque couche.
      REMARQUE : Pour l’impression d’une seule pièce, l’étape 2.3.10 n’est pas nécessaire.

3. Test de gonflement/dégradation

  1. Étapes préparatoires
    1. Prenez une seringue en verre stérile de 1 mL (terminal TLL) et une buse conique stérile de 25 G. Assemblez-les et mettez la seringue assemblée au réfrigérateur.
    2. Mettez les pointes de pipette et le flacon de matrice SBMe au réfrigérateur pendant la nuit la veille de l’expérience.
    3. Imprimez trois grilles PLA (Φ = 20 mm) avec des pores circulaires de 1 mm x 1 mm et un pilier vertical latéral pour les saisir.
  2. Constructions d’impression
    1. Sortez la seringue assemblée et le flacon de matrice SBMe du réfrigérateur. Aspirez 500 μL de la matrice SBMe et mettez-la dans l’incubateur pendant 15 min pour permettre la gélification.
    2. Sortez la seringue de l’incubateur et placez-la dans la tête d’impression de la bio-imprimante. Assurez-vous que le piston de la seringue est correctement en contact avec le bloc poussoir.
    3. Fixez le piston de fixation de la seringue et la bride du corps de la seringue avec les dispositifs de retenue du piston de la seringue et le corps de la seringue avec la pince de seringue.
    4. Calibrez le système à l’aide du paramètre Auto-home dans le menu de la bio-imprimante pour détecter automatiquement l’origine des axes.
    5. Déplacez l’extrudeur à l’aide de la commande Déplacer les axes jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille touche la grille PLA pour définir manuellement Z0.
    6. Lancez l’impression en sélectionnant le fichier g-code à imprimer dans le menu de la bio-imprimante.
    7. Mettez la plaque multipuits dans l’incubateur pendant 2 min pour permettre au SBMe de se stabiliser après l’extrusion.
    8. Prenez la plaque multipuits et mettez 2 ml de milieu de culture cellulaire dans les trois puits contenant les grilles bio-imprimées. Placez la plaque multipuits dans l’incubateur.
    9. À chaque point temporel (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 et 14 jours), prenez chaque grille de la plaque et séchez-la avec du papier propre pour enlever l’excès de support et de poids sur une balance. Remettez la grille dans la plaque puis dans l’incubateur pour continuer l’expérience. Estimez le taux de gonflement et le taux de dégradation à l’aide des formules suivantes :
      figure-protocol-2
      Où Wt est le poids des constructions à chaque point temporel et Wt0 le poids des constructions séchées.
      figure-protocol-3
      Où Wi est le poids à la fin de l’essai de gonflement.

4. Bio-impression des constructions SBMe

  1. Étapes préparatoires
    1. Prenez une seringue en verre stérile de 1 mL (borne TLL) et une buse conique stérile de 25 G et assemblez-les sous l’enceinte de sécurité biologique. Mettez-les dans une boîte stérile au réfrigérateur.
    2. Mettez les pointes de pipette et le flacon de matrice SBMe au réfrigérateur pendant la nuit (4 °C sur glace) la veille de l’expérience.
    3. Ajouter 20 μL de bleu trypan dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
    4. Réglez la centrifugeuse à 345 × g, 4 °C et laissez-la refroidir (~3-4 h).
    5. Prenez 5 ml d’eau dans un tube de centrifugation de 15 ml comme balance pour la centrifugeuse.
    6. Solution tampon de phosphate chaude (PBS) et milieu dans un bain-marie.
      REMARQUE : Le milieu de culture cellulaire est composé d’un milieu d’aigle modifié Dulbecco complet (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la pénicilline-streptomycine et de la L-glutamine.
    7. Placez la bio-imprimante sous l’enceinte de sécurité biologique. Stériliser à la lumière UV pendant 20 min.
      REMARQUE : Pour assurer le bon fonctionnement de la bio-imprimante, exécutez la fonction Auto-home et vérifiez les mouvements corrects de chaque axe et le fonctionnement des interrupteurs de fin de course.
  2. Préparation de la bioencre
    1. Prenez le flacon dans l’incubateur contenant des cellules cancéreuses de la prostate murines commerciales et placez-le sous l’enceinte de biosécurité.
    2. Retirer le milieu de culture cellulaire de la fiole.
      REMARQUE : Les volumes indiqués dans ce protocole s’appliquent aux flacons de culture cellulaire T25.
    3. Lavez une fois les cellules avec 2 ml de PBS, puis aspirez-les.
    4. Ajouter 500 μL de trypsine et mettre le ballon dans l’incubateur pendant 5 min pour permettre le détachement cellulaire de la plaque.
    5. Vérifiez que les cellules ne sont pas trypsinisées et, si nécessaire, tapotez doucement le fond du ballon.
    6. Ajouter 4,5 ml de produit moyen dans la fiole. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules détachées flottent dans le milieu de culture cellulaire.
    7. Aspirez le milieu et ajoutez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    8. Prenez une aliquote de 20 μL et mélangez-la avec l’aliquote de bleu de trypan. Ensuite, mettez 10 μL de ce mélange dans la chambre de comptage des cellules pour compter les cellules vivantes à l’aide de la formule suivante :
      figure-protocol-4
      où f est le facteur de dilution de la suspension de bleu de trypan (rapport 1:1) ; V est le volume de suspension cellulaire [mL].
    9. Centrifuger la suspension cellulaire restante pendant 5 minutes (345 × g, 4 °C).
    10. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans la matrice SBMe froide à la densité cellulaire souhaitée (10,6 cellules/mL)
    11. Aspirer 800 μL de la suspension matricielle contenant des cellules avec la seringue froide.
    12. Retirez les bulles d’air qui pourraient être piégées dans la seringue et mettez-la dans une boîte stérile. Ensuite, placez-le dans l’incubateur pendant 15 min pour permettre la gélification.
  3. Procédé de bio-impression
    1. Prenez la seringue de l’incubateur et placez-la dans la tête d’impression de la bio-imprimante. Assurez-vous que le piston de la seringue est correctement en contact avec le bloc poussoir.
      REMARQUE : Le modèle et le volume doivent être les mêmes que ceux de la seringue utilisée pour l’expérience.
    2. Fixez le piston de fixation de la seringue et la bride du corps de la seringue avec les dispositifs de retenue du piston de la seringue et le corps de la seringue avec la pince de seringue.
    3. Utilisez des écrous M4 dans la partie inférieure de l’extrudeuse pour ajuster la pression du ressort et verrouiller la seringue en place.
      REMARQUE : Les étapes 4.3.1 à 4.3.4 sont illustrées à la figure 7.
    4. Calibrez le système à l’aide du paramètre Auto-home dans le menu de la bio-imprimante pour détecter automatiquement l’origine des axes.
      REMARQUE : Ce passage assure toujours les bons réglages initiaux, indépendamment du type de support que nous utilisons pour l’impression.
    5. Placez une plaque à 6 puits multiples sur le plan d’impression.
    6. Déplacez l’extrudeur à l’aide de la commande Déplacer les axes jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille touche le fond du puits pour définir manuellement Z0.
    7. Sélectionnez le fichier gcode dans l’option de menu du menu de la bio-imprimante et lancez l’impression. Une grille carrée à six couches (2,6 cm de côté) sera imprimée dans chaque puits.
    8. Après le processus de bio-impression, utilisez un microscope inversé pour vous assurer que le processus d’impression a réussi et placez la plaque multipuits dans l’incubateur pendant 2 minutes pour permettre au SBMe de se stabiliser après l’extrusion.
    9. Mettez 2 ml de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.
      REMARQUE : Le volume doit couvrir entièrement les constructions.

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Résultats

Dans cet article, nous présentons un protocole pour les constructions de bio-impression en SBMe à l’aide d’une bio-imprimante volumétrique peu coûteuse et personnalisée. Nous fournissons une description détaillée et une impression 3D*. STL pour construire le système et nous démontrons son utilisation potentielle dans la recherche sur le cancer en imprimant des structures monocouches et multicouches. Chaque composant imprimé en 3D a été correctement nettoyé de la structure de support ou des résidus d’impression indésirabl...

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Discussion

Dans la recherche translationnelle, les SBM sont particulièrement précieux dans divers domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments 2,3. En particulier, ils sont devenus fondamentaux dans la recherche sur le cancer, car ils reproduisent les caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement tumoral, permettant le développement de modèles qui reflètent mieux la croissance tumorale, les ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par l’Accelerator Award n° A26815 intitulé : « Single-cell cancer evolution in the clinic » financé grâce à un partenariat entre Cancer Research UK et Fondazione AIRC (n° 22790) et par l’Union européenne - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque multipuits 12Sigma-AldrichCLS351143
Imprimante 3D FDMFlashforgeAdventurer 5M Pro
Carte mèreGEETECHGT2560 REV A+
6 Plaque multipuitsSigma-AldrichM8687
Prise secteurHiLetgohttps://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket
-Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1 ?__
mk_it_IT= %C3%85M %C3%85 %C5 %BD %C3 %
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I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml
BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1
AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM
kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy
_1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa
ok-zdQJlobGxJaMKg7WbV352
hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM
Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk& dib_
tag=se& mots-clés=AC+socket+HiLetgo& nsdOpt
OutParam=true& qid=1734702097& sprefix=ac+
socket+hiletgo %2Caps %2C173& sr=8-1		15 A 250 V
Pieds réglablesEXIN DEHCENhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Hauteur 27-40 mm
Roulement à billes 4 mmQUARKZMAN684ZZDimensions 4 x 9 x 4 mm
Roulement à billes 5 mmXiKe625-2RSDimensions 5 x 16 x 5 mm
Ceinture ferméeTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Largeur 6 mm
Ceinture ouverteFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& th=1		Largeur 6 mm
Buse de bio-impressionFisher Scientific17780789Corning  ; Buses de bio-impression coniques standard
Bü ; Chambre de comptage cellulaireGLASWARENFABRIK KARL HECHT
CentrifugeuseEppendorf5702 R
Tube à centrifugerSigma-AldrichCLS43147015 mL
Tube à centrifugerSigma-AldrichEP00301200861,5 mL
PrésentoirSigma-AldrichBR718905
DMEM  ;Gibco Thermofisher11965092
FBSSigma-AldrichF7524
Roulement linéaire à billes à brideCarte d’approvisionnementhttps://www.amazon.it/gp/product/
B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		LMF8UU
Seringue en verreFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (borne TLL)
CharnièresYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1
IncubateurFisher Scientific15481374Eppendorf  ; Galaxy 48 R CO2  ; Incubateur, 48 L, Acier inoxydable
Microscope inverséNikonEclipse Ti2-U
Jumper wiresIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
-54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/
B07Q12B6K5/ref=_ci_mcx_mh_
mcx_views_0_image ?_rd_w=cb2r
J& content-id=amzn1.sym.57a351cf-
ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3
aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e-
86d7-c161ca33337b& pf_rd_p=57A3
51CF-BA07-47E8-B302-AA2AA1A3F209
& pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX
D& _rd_wg = 7 semainesXB& _rd_r=8239
66CB-4977-48CE-B095-0DCEDF8C372F&
_rd_i=B07Q12B6K5& th=1
Unité LCDParadisetronic.comhttps://www.amazon.it/Display-controller
-conduttori-adattatore-stampante/dp/B01
DUR4064/ref=sr_1_9 ?__mk_it_IT= %C3
%85M %C3%85 %C5 %BD %C3%95 %C3
%91& crid=1OAHVIIRA16X3& dib=eyJ2Ij
oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4
8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ
maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf
GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF-
Hss d2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y
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w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_
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RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ
ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97
yxgnw& dib_tag=se& keywords=display %
2B3D %2Bprinter %2Bprusa %2Bi3& nsdO
ptOutParam=true& qid=1734714093& s=
industriel& sprefix=affichage %2B3d %2B
imprimante %2Bprusa %2Bi3%2Cindustrial %
2C143& sr=1-9& th=1		Unité LCD Old Prusa i3. Lien vers l’alternative disponible dans le commerce
Vis mère M8RS PRO280-408
Écrou de vis mère M8Comiokehttps://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4 ?
ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title& th=1		Écrou pour vis M8
Écrou de vis mère T8Aipaidehttps://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Écrou pour vis T8
Vis mère T8VBESTLIFEhttps://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title ?ie=UTF8& th=1		Longueur 15 mm
L-GlutammineSigma-AldrichG7513
Interrupteur de fin de courseCESFONJERhttps://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1
Roulement linéaire à billes (LM4UU)A ABSOPROhttps://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Roulement à billes linéaire (LM8LUU)Fdithttps://www.amazon.it/LM8LUU-Linear
-Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N
58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa ?__mk_it_IT
= %C3%85M %C3%85 %C5 %BD %C3 %
95 %C3%91& crid=33VNCCCSIFJRP&
dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX
8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku
zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui
at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR
4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_
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UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc
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64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35
_zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax
mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG
CPY& dib_tag=se& keywords=LM8LUU+
Fdit& nsdOptOutParam=true& qid=17347
04494& s=industriel& sprefix=lm8luu+fdit+
%2Cindustrial %2C136& sr=1-1-spons& sp
_csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1		Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Roulement à billes linéaire (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Dimensions 8 x 15 x 24 mm
AimantsOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& th=1		8 x 3 mm
MatrigelGibco ThermofisherLOT 0202003SBMe
Motor driver  ;Longrunerhttps://www.amazon.it/gp/product/
B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search
_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Driver A4988
PBSMicroGem, VWRTL1006-500ML
Pénicilline-StreptomycineGibco Thermofisher15070063
Pointes de pipetteSigma-AldrichZ740058MARQUE  ; pointes filtrantes, en rack, TipBox (volume 50-1000 &mu ; L)
Plaques de plexiglasMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti-
plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF
Q4BHQZ/ref=sr_1_14 ?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7
Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF
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rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E
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H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO
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MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_
E& dib_tag=se& Mots-clés=Lastra+Plexiglass+
2+mm& nsdOptOutParam=true& qid=1734702823& sr=8-14		Tôle transparente de 2 mm d’épaisseur, 21 x 32,5 cm
Plaques de plexiglasMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C
FQ4BHQZ/ref=sr_1_14 ?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b
f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N
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UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO
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uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux
nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3
9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E& dib_tag=se
& mots-clés=Lastra+Plexiglass+2+mm& nsd
OptOutParam=true& qid=1734702823& sr=8-15		2 feuilles transparentes, 2 mm d’épaisseur, 20 x 20 cm
Plaques de plexiglasMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C
FQ4BHQZ/ref=sr_1_14 ?dib=eyJ2IjoiMSJ9.
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N_E& dib_tag=se& Mots-clés=Lastra+Plexigl
ass+2+mm& nsdOptOutParam=true& qid=1
734702823& sr=8-16		2 feuilles transparentes, 2 mm d’épaisseur, 20 x 30 cm
Filament d’acide polylactique (PLA)FlashforgeNoir 100102
AlimentationSQUADOhttps://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore
-stabilizzato-dissipatore-efficienza
/dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6 ?dib
=eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb
eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4
ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg< br/> eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI
B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV
fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5
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Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y
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o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX
RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd
S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB
W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf
RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq
H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh
C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ&
dib_tag=se& mots-clés=puissance+sup
pli+AC+ENTRÉE %3A+110-220V %2
C+DC+SORTIE %3A+12V+15A& n
sdOptOutParam=true& qid=173471
4722& sr=8-6		Alimentation Old Prusa i3 (ENTRÉE AC : 110-220 V, SORTIE DC : 12 V 15 A). Lien vers l’alternative disponible dans le commerce
Poulie 5 mmVooGenzekhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& psc=1		Alésage 5 mm, Largeur de la courroie 6 mm
Poulie 8 mmYxtaiihttps://www.amazon.it/gp/product/
B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title ?ie=UTF8& th=1		Alésage 8 mm, Largeur de la bande 6 mm
Câbles platsQUARKZMANhttps://www.amazon.it/sspa/click?ie
=UTF8& spc=MTo0NDgyNTkwNzU
wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6
c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN
TYzMjo6MDo6& url= %2FQUARKZM
AN-connettore-Lunghezza-Comput
er-confezione %2Fdp %2FB0CQRM
DQNG %2Fref %3Dsr_1_15_sspa %
3F__mk_it_IT %3D %25C3%2585M
%25C3%2585%25C5%25BD %25
C3 % 2595%25C3%2591%26crid %3
D3BZ8Q05YA50TX %26dib %3Dey
J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D
ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl
wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H
vGQ-UUpPom12OcwyRVXLAR
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Références

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