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Tests de tolérance à la chaleur à l’aide du système de surveillance de l’activité de la drosophile : Guide d’une application exécutable pour l’analyse des données

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DOI :

10.3791/67814

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13 décembre 2024

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1Department of Biology, University of Nebraska at Kearney, 2School of Computing, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Psychology, University of Nebraska at Kearney, 4School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln

Dans cet article

Résumé

Ce rapport décrit une méthode permettant de mesurer le temps de chute de Drosophila melanogaster adulte à l’aide d’un moniteur d’activité de la drosophile (DAM2) en réponse à un facteur de stress thermique par conduction aérienne dans une chambre d’incubation. Le DAM2 mesure l’activité en enregistrant les mouvements individuels des mouches lorsqu’elles traversent un faisceau infrarouge. L’analyse des données est facilitée par un nouveau fichier exécutable créé par les auteurs.

Résumé

L’étude de la tolérance à la chaleur chez Drosophila melanogaster intéresse particulièrement les chercheurs depuis des décennies, une approche commune pour évaluer la tolérance à la chaleur étant de surveiller le temps de neutralisation (TKD) après une exposition à une température élevée. Classiquement, les mouches sont logées dans des flacons individuels et placées dans un bain d’eau chauffé. Le TKD est ensuite surveillé manuellement par les chercheurs. Bien que très bien établis, il reste des problèmes de subjectivité et d’application cohérente d’une définition tangible de l’arrêt de tout mouvement, y compris les spasmes musculaires, lors de la mise en œuvre de ces tests manuels. Nous avons développé une méthode à haut débit pour automatiser les tests de tolérance à la chaleur à l’aide des moniteurs d’activité de la drosophile TriKinetics (DAM2). Pour accompagner le système DAM2, nous avons écrit un programme et créé un exécutable facile à utiliser pour lire automatiquement le dernier moment de mouvement à partir des données d’activité générées. Ce script écrit ensuite dans un fichier .csv le temps de paralysie thermique (TKD) pour chaque mouche. Nos données montrent que cette méthode automatisée de DAM2 est cohérente et fiable. En revanche, les profils d’activité créés à partir des données de comptage d’activité sont intéressants. Ces profils d’activité peuvent être compilés et ont le potentiel d’élargir les tests de tolérance à la chaleur pour inclure les composantes comportementales relativement peu étudiées de la tolérance à la chaleur. Ce protocole décrira en détail comment utiliser le système DAM2 et le système HoTDAM ! logiciel pour estimer la tolérance à la chaleur chez D. melanogaster.

Introduction

Les ectothermes réagissent généralement au stress thermique par une activité locomotrice accrue. Ce phénomène est apparent pour les chercheurs depuis des décennies, avec la réponse comportementale caractéristique décrite par Cowles et Bogert en 19441. Ils ont décrit comment un organisme soumis à un stress thermique montrera d’abord une augmentation du mouvement locomoteur. Au fur et à mesure que le stress thermique s’accumule, de courtes périodes d’activité sont entrecoupées de périodes d’inactivité. La température à laquelle l’organisme ne peut plus présenter de mouvement coordonné est le maximum thermique critique (CTmax). Des spams musculaires suivent, et finalement l’organisme s’effondre 1,2. Cet effondrement est difficile à définir et représente quelque chose qui s’apparente à « la rigueur thermique, au coma ou à la mort »2. Ici, nous utiliserons le terme d’effondrement physiologique pour désigner théoriquement ce point final flou du stress thermique.

Drosophila melanogaster et d’autres petits insectes ont été des modèles précieux pour étudier le stress thermique. Pour estimer au moins une partie de l’ensemble complexe de traits qui constituent la tolérance à la chaleur, de nombreux chercheurs ont observé manuellement le moment et la température auxquels l’effondrement physiologique se produit, représentant respectivement le temps avant l’abattage (TKD) et le CTmax. Bien que très bien établies, ces méthodes d’essai manuel présentent certains inconvénients. Une définition opérationnelle de l’effondrement physiologique peut être difficile à établir et à appliquer de manière appropriée à tous les cas, surtout lorsque les observateurs sont moins expérimentés. Par exemple, à quel moment l’organisme passe-t-il des spasmes musculaires à l’effondrement ? Le schéma des spasmes musculaires et de l’activité convulsive avant l’effondrement peut être imprévisible et peut compliquer l’observation précise 2,3, menaçant l’exactitude et la précision. Pendant ce temps, la difficulté d’observation limite également le nombre d’organismes qui peuvent être analysés en même temps, ce qui limite l’évolutivité.

Étant donné qu’une augmentation de l’activité est une réponse cohérente à la chaleur et que TKD et CTmax sont finalement le point où l’activité cesse, nous avons cherché à utiliser les moniteurs d’activité de la drosophile (DAM2) de TriKinetics pour automatiser les tests de tolérance à la chaleur. Nous avons récemment publié une méthode de dosage automatisé, ainsi qu’un logiciel facile à utiliser, utilisant le système DAM24. Le test a été validé en comparant les mesures de tolérance à la chaleur en termes de TKD à un test TKD manuel classique basé sur l’observation sur plusieurs facteurs. Nous avons également exploré la composante de l’activité locomotrice des tests TKD afin de caractériser davantage le phénotype de thermotolérance inductible. Nous avons nommé le test et le logiciel qui l’accompagne HoTDAM ! (Tests de tolérance à la chaleur à l’aide du système de surveillance de l’activité de la drosophile). Nous fournissons ici une description détaillée de la méthode automatisée de dosage de la tolérance à la chaleur à l’aide du système DAM2 et du HoTDAM ! logiciel. Le test est facile à utiliser et est facilement évolutif pour permettre la mesure de plusieurs organismes à la fois.

Dans ce manuscrit, nous avons effectué des tests TKD sur des mouches mutantes thermosensorielles (potentiel de récepteur transitoire ankyrine 1 ; TRPA1) et leurs contrôles génétiques (White1118 ; w1118). Ces organismes ont été choisis pour souligner l’importance de l’activité accrue caractéristique observée pendant le stress thermique pour l’essai. En effet, les organismes TRPA1 ne présentent pas ce comportement d’échappement, illustrant le lien intrinsèque entre les réponses comportementales conservées et les estimations de la tolérance à la chaleur, telles que la TKD. Nous avons effectué le test pour les femelles et les mâles, ainsi que la mise en œuvre d’un prétraitement par durcissement thermique. Les résultats représentatifs présentés ici sont des données provenant d’essais entièrement nouveaux par rapport à ceux utilisés dans les essais de validation originaux publiés précédemment.

Protocole

1. Élevage de mouches

  1. Choisissez la crosse/ligne de mouches appropriée pour l’enquête.
    REMARQUE : Pour illustrer le test, nous avons utilisé le stock knock-out TRPA1 du récepteur transitoire et son contrôle génétique, le stock w1118 .
  2. Maintenez les stocks de mouches dans des conditions constantes, le cas échéant. Pour suivre ce protocole, faites des stocks à 25 °C sous un cycle diurne de 12:12 avec des aliments standard (semoule de maïs, mélasse et levure torula).
  3. Séparez les mâles et les femelles avec une anesthésie légère.
    REMARQUE : Selon l’expérience, des mouches vierges ou accouplées peuvent être utilisées.
    1. Laissez les mâles et les femelles adultes (séparément pour les deux stocks) s’accoupler et pondre pendant 5 jours. Retirez les adultes des bouteilles.
    2. Lorsque les adultes commencent à se refermer plusieurs jours plus tard, nettoyez à nouveau les bouteilles. Après 2 jours, séparez les mâles et les femelles à l’aide d’une anesthésie à l’éther léger et laissez-les mûrir séparément à une densité de 25 mouches par flacon.

2. Prétraitement

  1. Appliquez la variable de prétraitement ou la variable indépendante qui définira les groupes expérimentaux (génétique, environnemental, pharmacologique ou autre).
    1. Pour suivre ce protocole, séparez les adultes par sexe, et après 5 jours, prétraitez la moitié des adultes en immergeant un flacon scellé contenant les organismes dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h. Maintenez les commandes dans l’incubateur à 25 °C. Laissez les mouches récupérer pendant 24 h après le prétraitement, avant le test de tolérance à la chaleur.

3. Configuration du système DAM2

  1. Chargez les mouches dans les tubes de moniteur DAM2 et recouvrez les tubes aux deux extrémités avec du coton. Si l’on veut évaluer immédiatement la tolérance à la chaleur des mouches, ne pas utiliser d’anesthésie pendant le chargement des organismes dans les tubes de surveillance afin d’éviter tout effet de confusion potentiel associé à l’exposition à l’anesthésie. Au lieu de cela, aspirez les mouches individuelles des flacons de maintien dans les tubes de contrôle.
  2. Placez les tubes de test dans les moniteurs d’activité, en prenant note des numéros d’emplacement des différents groupes chargés.
    REMARQUE : Ceux-ci peuvent être randomisés en fonction de l’expérience si l’emplacement dans le moniteur peut être considéré comme une variable confondante.
  3. Logiciel d’acquisition de données DAM2
    REMARQUE : Le système et le logiciel DAM2 sont décrits en détail dans la fiche technique du logiciel DAMSystem3 disponible sur le site Web de l’entreprise (voir le tableau des matériaux). Reportez-vous aux instructions du DAM2 pour un dépannage spécifique et des fonctionnalités générales. Nous fournissons ici des conseils pour l’utilisation du système dans le cadre de notre test de tolérance à la chaleur.
    1. Le système DAM2 surveille le nombre de fois qu’une mouche individuelle à l’intérieur de chaque tube brise un faisceau infrarouge. Le logiciel d’acquisition de données indexe et réinitialise ensuite ce décompte à chaque intervalle de temps défini. Sous préférences, sélectionnez l’intervalle de lecture à utiliser dans le test. Nous avons trouvé un intervalle de lecture de 15 s pour obtenir un bon équilibre entre la résolution et les erreurs de lecture.
      REMARQUE : Il est recommandé que l’intervalle de lecture ne soit pas plus court en secondes que le nombre de moniteurs utilisés. Un intervalle de lecture plus court donnera une meilleure résolution temporelle au test, mais augmentera également potentiellement les cas d’erreurs de lecture. Le logiciel peut prendre du retard lors de la tentative d’indexation des relevés. De plus, un ordinateur plus récent et plus rapide contribue grandement à prévenir les erreurs de lecture.
    2. Lorsque vous examinez les erreurs de lecture, assurez-vous que l’ordinateur utilisé pour exécuter le logiciel d’acquisition de données DAM2 est configuré pour ne jamais se mettre en veille ou en veille prolongée afin de ne pas interrompre le test. De plus, assurez-vous que les mises à jour automatiques (y compris les mises à jour réseau contrôlées par l’établissement) sont désactivées lors de la collecte de données.
    3. Vérifiez que tous les moniteurs sont connectés et communiquent avec le logiciel. Vérifiez que l’état de chaque moniteur est vert sous l’onglet Données actuelles .
      REMARQUE : Consultez la fiche technique du logiciel DAMSystem3 pour plus de détails sur les problèmes auxquels se réfèrent les différents codes de couleur.
    4. Le logiciel d’acquisition de données écrira automatiquement le nombre d’activités dans des fichiers texte dans le dossier Données des fichiers système. Pour faciliter l’analyse des données, supprimez tous les fichiers texte dans ce dossier de données avant de démarrer le logiciel d’acquisition de données pour tout test.
      REMARQUE : Les fichiers texte seront automatiquement remplis, il est donc permis de les supprimer de ce dossier pour effacer les anciennes données sans entraver le programme.

4. Essai de tolérance à la chaleur

  1. Chargez les moniteurs dans l’incubateur de test.
  2. Démarrez le logiciel d’acquisition et laissez-le indexer pendant une durée définie (par exemple, 40 indices ou 10 min si l’intervalle de lecture est réglé sur 15 s) avant d’appliquer le stress thermique.
    REMARQUE : Cela permet une certaine acclimatation aux tubes et une récupération du mouvement des moniteurs lors de leur installation. Surtout si l’activité pendant le test est analysée, ce temps d’acclimatation établira une activité de base avant l’induction du stress thermique. En fonction de la nature spécifique du test effectué, cette phase d’acclimatation pourrait être sautée, les moniteurs étant placés directement dans l’incubateur déjà à la température de stress.
  3. Si vous effectuez un essai statique (TKD), réglez l’incubateur pour qu’il atteigne le plus rapidement possible la température nocive définie après la période d’acclimatation. La variable de réponse sera opérationnalisée comme la dernière heure de mouvement enregistrée (c.-à-d. le dernier indice non nul) pour estimer la TKD.
    1. Si vous effectuez un test dynamique, déterminez la vitesse à laquelle la température augmentera après la période d’acclimatation. Ici, la variable de réponse mesurée est techniquement le temps à nouveau. L’heure à laquelle le dernier mouvement est enregistré coïncidera avec une température (CTmax), en fonction de la vitesse de rampe.
    2. Surveillez le comptage de l’activité en temps réel sur l’écran du système DAM dans le logiciel d’acquisition ou examinez directement les fichiers texte dans le dossier de données des fichiers du programme DAMSystem3. Copiez les fichiers texte et ouvrez-les plutôt que le fichier d’origine dans le dossier de données pour éviter de causer des problèmes lors de l’enregistrement des données en direct.
    3. Une fois qu’aucun mouvement n’a été observé chez l’une des mouches pendant plusieurs minutes, arrêtez le logiciel d’acquisition.
      REMARQUE : Avec nos tests, nous avons constaté que quelques à plusieurs minutes d’inactivité sont indicatives d’un effondrement physiologique dû à un stress thermique similaire à celui observé dans les tests manuels classiques de TKD. Cela dépend toutefois du comportement d’évasion spontanée. En tant que tel, considérez les variables confusionnelles possibles si le traitement spécifique de l’enquête pourrait modifier cette réponse comportementale. De plus, en fonction des paramètres spécifiques de l’essai (p. ex., température, traitement), la durée de l’essai variera évidemment.

5. Organisation et analyse des données

REMARQUE : reportez-vous à la vidéo supplémentaire S1 pour savoir comment télécharger l’application exécutable à partir de GitHub, ainsi que les fonctionnalités de base du logiciel.

  1. Une fois les données acquises, analysez les fichiers texte à la recherche d’erreurs à l’aide du logiciel référencé (voir la table des matériaux) et sélectionnez des points de début et d’arrêt spécifiques pour le regroupement des données d’activité. Si un intervalle d’acclimatation de 10 minutes a été mis en place, démarrez le binning 10 min après le début de l’enregistrement de l’activité. Voir la discussion pour plus de détails sur le binning.
  2. Ouvrez le HoTDAM ! et importez les fichiers de données du moniteur analysés en cliquant sur Fichier | Charger les données du moniteur.
    REMARQUE : Le logiciel et l’application exécutable sont disponibles sur GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) ou sur le site Web de l’entreprise dans la section Logiciel d’analyse . Notez que l’application exécutable n’est compatible qu’avec les systèmes d’exploitation Windows pour le moment.
  3. Ajoutez des désignations de groupe pour indiquer quels groupes de traitement correspondent à quelle cellule au sein des moniteurs DAM2.
    REMARQUE : La disposition de l’interface logicielle correspond à la disposition des moniteurs.
  4. Cliquez sur Démarrer la définition multigroupe pour ouvrir une boîte de dialogue permettant d’ajouter une désignation de groupe qui sera appliquée à plusieurs cellules. Une fois la désignation de groupe acceptée, cliquez sur les cellules pour appliquer la désignation de groupe, puis cliquez sur Arrêter la désignation multigroupe.
    REMARQUE : Le logiciel organise et exporte les données de DAMSystem3 vers des fichiers .csv à analyser dans un logiciel de statistiques.
  5. Exportez le TKD (c’est-à-dire le dernier index non nul) pour chaque mouche dans les moniteurs vers un fichier .csv en cliquant sur Fichier | Exporter les données de renversement | Exporter tous les moniteurs ou exporter les moniteurs sélectionnés. La TKD pour chaque mouche sera organisée dans la production par désignation de groupe.
  6. Exportez les données d’activité de chaque mouche en cliquant sur Fichier | Exporter les données d’activité | Exporter tous les moniteurs ou Exporter les moniteurs sélectionnés dans un fichier .csv, en ne conservant que les données d’horodatage et de comptage, ce qui facilite l’utilisation du fichier de données, tout en attribuant des étiquettes de groupe désignées pour chaque mouche.
    REMARQUE : Les premières colonnes des fichiers de données DAMSystem3 correspondent aux données internes des moniteurs (par exemple, surveillance de la lumière ou messages d’erreur) lors de l’acquisition. Les données de comptage se trouvent dans les colonnes 11-42 (voir la fiche technique de DamSystem3 pour plus de détails). L’exportation des données d’activité avec le logiciel d’analyse supprimera toutes les colonnes, à l’exception des colonnes de données d’horodatage et de comptage.
  7. Si vous effectuez une expérience CTmax, utilisez le TKD pour déterminer le CTmax en utilisant le taux de montée en puissance de la température.
    figure-protocol-1
    REMARQUE : Le logiciel d’analyse a été écrit de manière orientée objet en C# (code source disponible sur GitHub ; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) de sorte que certains aspects du programme peuvent être facilement modifiés pour permettre une personnalisation à des fins spécifiques.

6. Statistiques

REMARQUE : De nombreux tests différents peuvent être utilisés pour analyser les données TKD, en fonction des spécificités de la configuration expérimentale.

  1. Utilisez l’analyse de survie (par exemple, la régression de Cox, Kaplan-Meier) pour conceptualiser le renversement comme un événement que chaque mouche du test connaîtra.
    REMARQUE : Pour un examen détaillé, voir la série de 4 articles de Bradburn et Clark traitant de l’analyse de survie et de sa mise en œuvre 5,6,7,8.
  2. Utilisez l’ANOVA pour évaluer les différences entre les groupes et comparer les modalités, en particulier lors de la validation du test automatisé pour des conditions spécifiques.
  3. Analysez les données TKD à l’aide de l’analyse de survie de Kaplan-Meier. Divisez le fichier par stock de sorte que l’analyse soit effectuée séparément (par exemple, pour les lignes de stock TRPA1 et w1118 ). Choisissez la variable temporelle comme TKD (en min), knockdown comme événement, prétraitement comme facteur et sexe comme strates.
  4. Effectuer les tests log-rank, Breslow et Tarone-Ware pour comparer le prétraitement de chaque strate (c.-à-d. le sexe), à des fins d’illustration montrant plusieurs méthodes.
  5. Construisez des parcelles de survie.

Résultats

Les analyses des stocks TRPA1 et w1118 ont été effectuées séparément. Le tableau 1 présente les temps centiles de TKD et d’autres descriptifs.

Percentilesa
SexeTraitement25.00%50.00%75.00%
NEstimerErreur standardEstimerErreur standardEstimerErreur standard
N° W1118
FemelleContrôle1642.500.4340.752.0038.750.43
Durci1648.754.5543.252.5038.501.95
MâleContrôle1643.251.8839.750.2537.002.38
Durci1646.505.6335.502.0030.753.03
TRPA1
FemelleContrôle1634.252.1729.257.5021.500.72
Durci1537.254.8428.751.7725.750.86
MâleContrôle1538.253.2932.001.2924.507.92
Durci1627.500.7225.751.0022.756.06

Tableau 1 : Statistiques descriptives pour les analyses de survie de Kaplan-Meier des mouches w1118 et TRPA1 . Les valeurs centiles TKD sont données en minutes. Le durcissement fait référence à un prétraitement à 37 °C suivi d’une récupération de 24 heures avant un choc thermique à 39 °C. Les témoins ont été maintenus à 25 °C pendant toute la durée du prétraitement. REMARQUE : Dans les analyses de survie, le 75e centile est le dernier moment où 75 % de l’échantillon continue de montrer une activité.

Pour les mouches w1118, les tests de log-rank ont révélé une différence significative dans la probabilité d’inactivation entre les femelles durcies et les femelles témoins (p = 0,026), de sorte que les femelles endurcies avaient une probabilité plus faible d’être renversées par le facteur de stress thermique au cours de l’essai. Pendant ce temps, les tests de log-rank n’ont révélé aucune différence significative dans la probabilité d’inactivation entre les mâles durcis et témoins w1118 (p = 0,798). Pour les femelles TRPA1 , aucune différence significative dans la probabilité de renversement n’a été observée entre les organismes endurcis et les organismes témoins (p = 0,547) à l’aide des tests de classement logarithmique. Enfin, pour les mâles TRPA1 , les tests de log-rank ont révélé une différence significative dans la probabilité d’inactivation entre les organismes endurcis et les organismes témoins (p = 0,014), de sorte que les organismes témoins avaient une probabilité plus faible d’être renversés par le facteur de stress thermique. Voir le tableau 2 pour tous les résultats des analyses de survie (y compris les tests généralisés de Wilcoxon et de Tarone-Ware) et la figure 1 pour les courbes de survie.

Sexeχ2DfValeur p
N° W1118
FemelleRang logarithmique (Mantel-Cox)4.9610.026
Breslow (Wilcoxon généralisé)1.7210.190
Tarone-Ware3.0710.080
MâleRang logarithmique (Mantel-Cox)0.0710.798
Breslow (Wilcoxon généralisé)0.8610.353
Tarone-Ware0.3210.572
TRPA1
FemelleRang logarithmique (Mantel-Cox)0.3610.547
Breslow (Wilcoxon généralisé)0.4510.503
Tarone-Ware0.3610.549
MâleRang logarithmique (Mantel-Cox)6.0110.014
Breslow (Wilcoxon généralisé)4.1910.041
Tarone-Ware5.2010.023

Tableau 2 : Tests de signification comparant la probabilité de rester actif entre les mouches femelles et mâles w1118 prétraitées et les mouches témoins w 1118 et TRPA1 . Le durcissement fait référence à un prétraitement à 37 °C suivi d’une récupération de 24 h avant un choc thermique à 39 °C. Les organismes témoins ont été maintenus à 25 °C pendant toute la durée du prétraitement.

figure-results-1
Figure 1 : Courbes de survie illustrant la proportion d’organismes ayant une activité résiduelle au cours de l’essai TKD pour les mouches w1118 et TRPA1. Le durcissement fait référence à un prétraitement à 37 °C suivi d’une récupération de 24 h avant un choc thermique à 39 °C. Les organismes témoins ont été maintenus à 25 °C pendant toute la durée du prétraitement. Le TKD est en minutes depuis l’introduction du facteur de stress thermique de 39 °C. Abréviations : TKD = temps avant de renverser ; TRPA1 = potentiel de récepteur transitoire ankyrine 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’activité moyenne en fonction du temps est illustrée à la figure 2 pour les mâles et les femelles TRPA1 et témoins et w1118.

figure-results-2
Figure 2 : Activité moyenne en fonction du temps des mouches w1118 et TRPA1 pendant la durée du test TKD. Abréviations : TKD = temps avant de renverser ; TRPA1 = potentiel de récepteur transitoire ankyrine 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Il existe probablement d’innombrables et nouvelles façons d’analyser les données d’activité, en particulier si l’on considère les effets de groupe et l’intégration de la TKD. Étant donné que l’analyse de l’activité pendant la tolérance à la chaleur est relativement peu étudiée, nous n’avons pas exploré d’approches statistiques potentiellement nouvelles pour analyser les données d’activité. De tels tests statistiques justifieraient une revue de la littérature et une discussion beaucoup plus approfondies qu’il ne convient ici. Au lieu de cela, nous avons simplement représenté graphiquement l’activité moyenne de chaque groupe (prétraitement ou contrôle) en fonction du temps, car nous avons déjà publié cette méthode pour illustrer l’activité avec une revue de littérature appropriée.

Vidéo supplémentaire S1 : Procédure pas à pas pour le téléchargement de l’application exécutable à partir de GitHub et des fonctionnalités de base du logiciel. La version la plus récente (compatible uniquement avec Windows pour le moment) se trouve sur le GitHub référencé (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) ou via un lien indexé dans la section Logiciel d’analyse du site Web de l’entreprise. Une fois la version téléchargée, les fichiers devront être extraits et le HoTDAM ! L’application peut être ouverte. Un logiciel antivirus peut empêcher l’application de s’exécuter ; Il peut être nécessaire d’accorder des autorisations à l’application. Une fois l’interface en cours d’exécution, le DAM2 (File Scan Software) numérisé peut être téléchargé (Fichier | Charger les données du moniteur). L’interface de désignation de groupe représente la disposition du moniteur d’activité et permet à l’utilisateur de désigner des groupes de traitement pour les tubes individuellement un par un ou plusieurs à la fois avec la fonction de définition de groupe à sélection multiple . Tous les moniteurs s’excluent mutuellement en ce qui concerne la fonctionnalité de désignation de groupe et doivent être définis séparément. Les données TKD et d’activité peuvent ensuite être exportées vers .csv fichiers (Fichier | Exporter des données ou des fichiers de rabattage | Exporter les données d’activité) pour un moniteur sélectionné individuellement ou pour tous les moniteurs à la fois. Si tous les moniteurs sont exportés en même temps, les données TKD ou d’activité seront exportées dans un seul fichier .csv, mais les données de chaque moniteur seront séparées dans le fichier. Les fichiers TKD exportés regrouperont les mouches en groupes affichant l’indice non nul de la dernière activité pour chaque tube. Les fichiers d’activité garderont tous les tubes séparés, mais associeront des désignations de groupe et supprimeront toutes les informations des fichiers, à l’exception des données d’horodatage et de comptage pour chaque tube. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La méthode de dosage de la tolérance à la chaleur que nous décrivons ici est polyvalente et évolutive. Nous avons déjà publié une étude de validation dans laquelle nous avons comparé les modèles HoTDAM ! méthode à un test TKD classique, basé sur l’observation, et a constaté que le test automatisé donnait la même tendance générale à travers plusieurs facteurs4 (Figure 3). En d’autres termes, de la même manière que le test manuel TKD classique, le test automatisé DAM2 a été capable de différencier les organismes par sexe, température de test, prétraitement de durcissement et temps de récupération après le prétraitement de durcissement avant le test. Bien que le test automatisé soit présumé plus objectif dans la mesure où le TKD ne dépend pas de l’observation du chercheur, nos données ne suggèrent pas que cela rend le test DAM2 sensiblement supérieur au test manuel en termes de découverte d’un effet. Nous avons constaté que les tests étaient assez similaires en termes de précision, et que les tailles d’effet dans le test automatisé sont légèrement plus petites (voir le matériel supplémentaire de Rokusek et al.4 pour des données statistiques descriptives détaillées et des données ANOVA pour le DAM2 automatisé et les tests manuels basés sur l’observation de nos études de validation). La raison en est probablement liée à la différence inhérente à ce que les tests mesurent en termes de TKD, qui est discutée en détail ci-dessous.

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Figure 3 : Comparaison du test automatisé DAM2 à un test TKD classique basé sur l’observation. Les graphiques montrent le TKD moyen en minutes et les barres d’erreur sont l’erreur standard de la moyenne. Les facteurs indépendants comparés sont (A) le sexe par la température d’essai, (B) le durcissement par la température d’essai, (C) le sexe par le temps de récupération, (D) le durcissement par le sexe, (E) la température de l’essai par le temps de récupération et (F) le durcissement par le temps de récupération. La TKD absolue a tendance à être plus longue dans le dosage automatisé, mais les tendances générales entre les facteurs sont cohérentes entre les dosages. Cette figure est tirée de Rokusek et al. 4. Abréviation : TKD = temps avant de renverser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les données illustratives présentées ici représentent des expériences entièrement distinctes de nos essais de vérification originaux, qui utilisaient également des lignées de mouches différentes. Le test (TKD et activité) était sensible aux effets du prétraitement de durcissement dans la crosse w1118 (nous avons utilisé une souche de type sauvage du canton S dans les expériences originales), ce qui confirme que la fonctionnalité de base du test est stable dans des conditions variables, bien que seules quelques lignées aient été testées jusqu’à présent. Le test est polyvalent en ce sens qu’il ne se limite pas à la mesure du TKD. Étant donné que la TKD dans notre test est définie comme l’arrêt de l’activité locomotrice, le CTmax peut être déterminé si le taux de montée en température est connu. Enfin, le test est entièrement automatisé et peut facilement être mis à l’échelle en ajoutant des moniteurs d’activité supplémentaires, ce qui permet d’obtenir des tailles d’échantillonnage beaucoup plus grandes que ce qui serait possible avec une méthode d’observation manuelle.

Voici quelques points clés à prendre en compte lors de la réalisation du test et de l’analyse. Utilisez un incubateur qui peut rapidement atteindre une température définie, de sorte que les moniteurs puissent être chargés dans l’incubateur à la température d’élevage et laissés reposer tranquillement pour s’acclimater au nouvel environnement avant d’appliquer le facteur de stress thermique. Si la température augmente trop lentement, le test commence à ressembler davantage à un test CTmax dynamique qu’à un test TKD statique. Par exemple, si le logiciel a été autorisé à indexer 40x avant l’induction du stress thermique pour établir une base de référence, le logiciel peut sortir le fichier de données à partir de l’indice 40 pour la détermination du TKD et l’analyse des données. Le point de départ est en termes d’horodatage enregistré par le logiciel, alors soyez conscient de l’intervalle d’index (par exemple, 40 index sont 10 min si l’intervalle d’index est de 15 s).

Le logiciel d’analyse de fichiers peut également être utilisé pour « regrouper » les index et peut additionner ou faire la moyenne des comptes. Par exemple, lorsque nous avons représenté graphiquement des données d’activité (voir ci-dessous), nous avons regroupé tous les quatre index pour additionner les comptes (c’est-à-dire que nous avons exporté l’activité toutes les minutes au lieu de toutes les 15 s). Notez que le logiciel d’analyse de fichiers ne permet pas de prendre des minutes partielles lors du regroupement, en termes d’horodatage. Par exemple, si le premier index était à 12:10:15, avec l’intervalle d’index défini sur 15 s, le binning à 1 min commencera à la minute la plus proche (par exemple, 12:11:00). Ainsi, si l’activité par incréments de minute doit être utilisée pour l’analyse, mais que la résolution d’intervalles de 15 s pour TKD est souhaitée, démarrez le logiciel d’acquisition dans les 15 s de la minute entière la plus proche (par exemple, après 12:09:45 et avant 12:10:00). Cette complication est due au fait que le logiciel d’acquisition de données utilise l’horloge du système informatique comme horodatage, car le DAMSystem3 a probablement été conçu en tenant compte des études du sommeil.

En termes d’approches statistiques de comparaison de la TKD, nous soutenons que l’analyse de survie offre plus d’informations que la simple comparaison des temps d’inactivation moyens ou médians entre les groupes. Les courbes de survie peuvent offrir un aperçu visuel de l’évolution temporelle de l’abattage des populations au cours de l’essai. De même, les tests statistiques peuvent être adaptés à la question spécifique posée dans l’étude. Par exemple, les tests de Wilcoxon généralisés accordent plus de poids aux événements précoces, tandis que les tests de log-rank donnent un poids égal à tous les points temporels et sont plus sensibles aux différences aux points temporels ultérieurs. Si les rapports de risque ne sont pas proportionnels (c’est-à-dire que les courbes de survie se croisent), Tarone-Ware est plus rigoureux. Comme il ne devrait pas y avoir de censure des données, car tous les organismes auront vécu l’événement (knockdown), on pourrait plaider en faveur de l’utilisation de tests non paramétriques de classement comme Mann-Whitney U et Kruskal-Wallis, ainsi que des courbes de survie de Kapan-Meier9. Si une enquête s’intéresse à l’inactivation après une période définie plutôt qu’à la TKD après que tous les organismes ont été renversés, l’utilisation de l’analyse de survie et des tests de log-rank ou de Wilcoxon généralisé serait robuste aux données censurées (c.-à-d. un scénario où tous les organismes n’auraient pas cessé de bouger ou ne se seraient pas effondrés à la fin de l’essai). Nous avons fourni les résultats de log-rank, de Wilcoxon généralisé et de Tarone-Ware dans le tableau 2 à titre d’illustration.

Pendant le stress thermique et avant CTmax, les altérations comportementales (par exemple, le comportement d’évasion) servent de mécanismes d’adaptation. Ces stratégies comportementales innées sont conservées dans tout le règne animal, mais sont particulièrement importantes pour les ectothermes étant donné leur faible capacité de thermorégulation métabolique10,11. De toute évidence, le comportement est un aspect important du phénotype du stress thermique ectotherme, mais des recherches relativement rares ont examiné ces aspects comportementaux de la tolérance à la chaleur. Étant donné que le test que nous décrivons repose sur l’augmentation caractéristique de l’activité locomotrice en réponse au stress thermique, il est bien adapté pour explorer les aspects locomoteurs des réponses au stress thermique. En même temps, cette dépendance à l’égard de l’activité spontanée comporte certaines limites. Il est important de se rappeler, en particulier lorsque l’on explore les composantes des réponses locomotrices au stress thermique, que la TKD et l’activité sont intrinsèquement liées. Pour démontrer une situation où cela serait limitatif pour notre test, nous avons fourni ici des données provenant d’organismes TRPA1 qui sont déficients en thermosensation. Lorsque les organismes sont déficients pour le récepteur TRPA1, les mouches ne présentent pas la réponse locomotrice caractéristique à la chaleur12. Dans les données représentatives présentées ici, la réponse de l’activité chez les organismes TRPA1 est émoussée. Les mesures de TKD ne seraient pas facilement comparables à celles des organismes de type sauvage, car la mesure représente une réponse locomotrice différente.

La généralisabilité et la comparaison directe des résultats, en particulier avec les tests classiques de tolérance à la chaleur, constituent également une limitation potentielle (figure 3). Souvent, les tests basés sur l’observation impliquent un stimulus mécanique ou autre pour s’assurer qu’un organisme immobile connaît effectivement un effondrement physiologique et ne montre pas simplement un manque d’activité spontanée 3,13. Étant donné que notre test repose sur l’activité spontanée, il existe une différence inhérente dans la définition opérationnelle de la TKD qui pourrait compliquer la comparaison. En d’autres termes, nous avons défini la TKD comme l’arrêt de l’activité locomotrice, tandis que les tests classiques définissent généralement la TKD comme un effondrement physiologique. De plus, les tests automatisés comme celui que nous décrivons reposent sur de l’air chauffé, tandis que les tests manuels impliquent généralement un bain-marie et, par conséquent, un transfert de chaleur plus efficace. Toutes ces limitations à la comparaison entre les modalités de dosage représentent des inconvénients à la généralisabilité de la méthode automatisée. Dans le même temps, il a été rapporté que les méthodes basées sur l’observation souffraient de complications avec des comparaisons directes entre les investigations ainsi que 2,14,15. Nous soutenons que malgré les limites, les tests automatisés sont un moyen viable d’estimer la tolérance à la chaleur en termes de TKD ou de CTmax.

D’autres tests automatisés de tolérance à la chaleur pour TKD et CTmax ont été mis en œuvre et décrits précédemment dans la littérature 16,17,18,19, certains utilisant les moniteurs d’activité DAM2 18,19. De plus, au moins quelques études ont utilisé des méthodes basées sur la vidéo 16,20,21, ainsi que les moniteurs d’activité DAM2 20, pour examiner les profils d’activité des mouches des fruits en ce qui concerne la tolérance à la chaleur dans le contexte d’un stress thermique aigu. En tant que tel, l’automatisation des tests de tolérance à la chaleur, y compris avec le système DAM2, n’est pas une idée nouvelle. Ce qui est nouveau et précieux dans notre test, c’est la facilité de gestion des données facilitée par le HoTDAM ! logiciel (d’analyse). Les données d’activité sont difficiles à utiliser, et il peut être long et fastidieux d’extraire même les mesures les plus simples (par exemple, TKD) à partir de grands ensembles de données sans utiliser de logiciels ou de scripts qui doivent être personnalisés pour chaque scénario. HoTDAM ! est gratuit et disponible sous la forme d’une application exécutable entièrement fonctionnelle avec une interface simple et facile à utiliser. Aucune expérience préalable en codage n’est requise. De plus, le logiciel a été écrit de manière orientée objet avec une documentation pour faciliter la modification. En tant que tel, HoTDAM ! Peut être facilement personnalisé pour répondre à des besoins spécifiques. Le code source est disponible avec l’application exécutable. Nous espérons que HoTDAM ! peut servir les laboratoires novices en matière d’essais de tolérance à la chaleur en offrant un moyen facile de mesurer le TKD et le CTmax, ainsi que servir les laboratoires expérimentés dans les essais de tolérance à la chaleur en offrant un logiciel personnalisable pour faciliter la gestion des données.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le projet décrit a été soutenu par des subventions IDeA (Institutional Development Award) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (5P20GM103427 et 1U54GM115458). Le programme de bourses de recherche de premier cycle de l’UNK et le programme de recherche d’été pour les étudiants en médecine de l’UNMC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à essai en polystyrène de 14 mlFalcon352057
Aquarium de 30 gallonsWal-mart
Bouteilles de 8 ozGenesee32-129F
Chambre climatique constanteMemmertHPP750eco
Semoule de maïsLaboratoire scientifiqueFLY801010
DAM2  ; Moniteur d’activité de la drosophileTriKineticsDAM2(Fiche technique DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
DAMSystem logiciel d’acquisition de donnéesTriKineticstéléchargement gratuit
Drosophilaagar LabScientific FLY80201
éthanolFisher ScientificBP82011
EtherFisher ScientificE134-4
Logiciel FileScanTriKineticspour la recherche d’erreurs de texte, le regroupement des données et la sortie
FlyStuff Flugs pour bouteillesGenesee49-100
FlyStuff Flugs pour flaconsGenesee49-102
FletosFlyStuff Genesee32-113RL
Logiciel HoTDAMGithub ou Trikineticshttps://github.com/MatthewR47/HoTDAM
ThermoplongeurPolyScienceMX-CA11B
mélasseLab ScientificFLY80084
acide propioniqueFisher ScientificA258-500
Pyrex Tubes en verre 5 x 65 mm pour DAM2TriKineticsPGT 5x65https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
petit pinceauWal-mart
SPSS StatisticsIBM
tegoseptLab ScientificFLY55015
torula levureMP Biomedicals290308505
TRPA1 mutant stockBloomington Stock center26504w[1118] ; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1]
w1118 stockBloomington Stock center3605

Références

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