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Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

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DOI :

10.3791/67846

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24 janvier 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Résumé

Le tissu adipeux est principalement composé d’adipocytes matures chargés de lipides en volume. Ces cellules postmitotiques jouent un rôle essentiel dans le stockage et la mobilisation de l’énergie, la thermorégulation et la sécrétion de facteurs endocriniens. L’expansion du tissu adipeux blanc due au déséquilibre calorique entraîne à la fois l’élargissement des adipocytes existants et la génération d’adipocytes supplémentaires à partir de cellules progénitrices adipocytaires. Les modifications du tissu adipeux blanc dues à l’obésité, y compris celles affectant les adipocytes, sont associées à de nombreuses comorbidités, telles que le diabète de type 2 et 13 types de cancer. Un obstacle important à l’étude de la contribution des adipocytes à la maladie est l’incapacité d’isoler et de cultiver facilement les adipocytes matures. Cet article décrit un protocole permettant d’isoler les adipocytes maigres et obèses murins des dépôts de graisse sous-cutanés et viscéraux de souris C57BL/6 mâles et femelles. Le protocole détaille comment des adipocytes primaires isolés peuvent être cultivés dans un système d’agrégats d’adipocytes membranaires jusqu’à 2 semaines, facilitant ainsi leur analyse fonctionnelle dans des expériences de co-culture, des tests de lipolyse ou par la collecte de milieux conditionnés contenant des facteurs sécrétés par les adipocytes. De plus, le protocole décrit des méthodes pour cultiver des explants de tissu adipeux dans des dômes de matrice de membrane basale et imager des adipocytes primaires isolés. Il est important de noter que cette approche peut être intégrée aux protocoles existants pour l’isolement des cellules progénitrices adipocytaires résidentes du tissu adipeux à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Ensemble, ces protocoles fournissent aux chercheurs des outils pour étudier fonctionnellement les adipocytes, les cellules progénitrices adipocytaires et le tissu adipeux entier de souris maigres et obèses, mâles et femelles.

Introduction

On s’attend à ce que la prévalence de l’obésité chez les adultes aux États-Unis atteigne 50 % d’ici 20301, d’où la nécessité de mieux comprendre les effets cellulaires et physiologiques de l’obésité. L’obésité se caractérise par un déséquilibre calorique entraînant l’expansion du tissu adipeux blanc en raison d’un stockage accru de l’énergie sous forme de graisse. L’expansion du tissu adipeux peut se produire à la fois par la génération de nouveaux adipocytes (hyperplasie) ou par une augmentation de la taille des adipocytes existants (hypertrophie). Bien que les deux processus entraînent l’expansion du tissu adipeux, l’expansion hypertrophique coïncide avec une santé métabolique réduite et une incidence plus élevée de troubles métaboliques 2,3. Une meilleure compréhension des complexités du tissu adipeux permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant les troubles métaboliques et d’autres comorbidités liées à l’obésité, y compris le diabète de type 2 et les cancers.

Le tissu adipeux a longtemps été apprécié pour son rôle dans le stockage de l’énergie et la thermorégulation. Plus récemment, cependant, le tissu adipeux est apparu comme un tissu de signalisation métabolique important, responsable de la sécrétion de métabolites, de lipides et de peptides 4,5. Ces molécules dérivées du tissu adipeux, appelées adipokines, signalent localement et systématiquement et peuvent réguler l’homéostasie énergétique, la fonction immunitaire, la dynamique vasculaire, etc. 5,6,7. Les adipocytes matures représentent environ 50 % des cellules du tissu adipeux et la grande majoritédu volume 8 du tissu adipeux. Il est important de noter que des études ont montré que les adipocytes sont constitués de nombreuses sous-populations 9,10. En tant que telles, les cellules progénitrices des adipocytes génèrent des populations distinctes d’adipocytes matures en fonction de facteurs tels que le sexe et le dépôt de tissu adipeux. Ces adipocytes matures peuvent être modulés davantage par les changements de régime alimentaire et l’obésité, créant des sous-populations d’adipocytes qui sont transcriptionnellement distinctes et expriment différentes signatures paracrines 9,11,12,13,14,15,16 . Malgré leur complexité et leur importance physiologique, la capacité d’isoler et de cultiver des adipocytes matures reste un obstacle distinct à l’étude de ces cellules.

Les méthodes actuellement disponibles utilisées pour isoler les adipocytes matures utilisent la différenciation à partir des cellules progénitrices des adipocytes (APC), le tri cellulaire activé par fluorescence et les techniques basées sur la centrifugation, bien que toutes ces techniques aient leurs propres inconvénients. La différenciation in vitro ou ex vivo des APC en adipocytes matures est largement utilisée pour développer des adipocytes matures. Cependant, ces cellules différenciées artificiellement sont multiloculaires, contenant de nombreuses petites gouttelettes lipidiques, plutôt que le phénotype uniloculaire des adipocytes matures in vivo, qui contiennent une grosse gouttelette lipidique17. De plus, des études ont montré que les cellules différenciées in vitro sont transcriptionnellement distinctes des adipocytes matures isolés trouvés in vivo17. Il est important de noter que la différenciation in vitro n’est pas en mesure de faire la différence entre les adipocytes maigres et obèses. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est couramment utilisé pour isoler des populations cellulaires spécifiques dans les tissus. cependant, les adipocytes matures peuvent facilement éclater dans des conditions FACS en raison de leur grande taille et de leurs membranes fragiles, ce qui en fait une méthode inefficace pour l’isolement des adipocytes matures. D’autres protocoles existants entraînent l’accumulation de grandes quantités de lipides libres, qui peuvent être toxiques pour les adipocytes matures en culture au fil du temps.

Ici, nous décrivons un protocole pour l’isolement d’adipocytes matures murins à partir de tissu adipeux blanc. Ce protocole a été adapté du protocole pour les cultures d’agrégats d’adipocytes matures établi à l’origine par Harms et al.17 ; Cependant, l’approche basée sur la centrifugation décrite ici utilise des équipements de laboratoire courants et est capable d’isoler efficacement les adipocytes à partir de petites quantités (~0,5 g) de tissu adipeux. Il s’agit d’un système facilement adaptable, et des modifications pour isoler les adipocytes murins matures des souris mâles et femelles, les dépôts de graisse viscérale et sous-cutanée, et différentes conditions de régime sont inclus.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université de l’Utah. Ce protocole a été optimisé pour l’isolement d’adipocytes matures de souris mâles et femelles C57BL/6 âgées de 8 à 16 semaines, avec des poids corporels allant de 20 à 45 g. Des détails sur les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Préparation de la solution

  1. Préparez le tampon de collagénase. Ajouter 100 mg de poudre de collagénase, 1 ml de tampon 1 M HEPES, 500 μL de 100x P188, 50 μL de 1 M CaCl2, 0,05 g de BSA et 48,45 ml de Medium 199. Filtrer stérilement la solution, l’aliquote et la conserver à -20 °C.
  2. Fabriquer des milieux de culture cellulaire. Combinez 500 ml de DMEM, 50 ml de FBS, 5 ml de pénicilline-streptomycine et 5 ml de supplément de L-glutamine.

2. Collecte de dépôts de tissu adipeux blanc sur des souris

  1. Préparez une plaque de 1 x 10 cm avec 200 μL de HBSS pour chaque dépôt et conditionnez le cas échéant et placez-la sur de la glace.
  2. Récupérer les animaux de la animalerie et euthanasier les souris conformément aux directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’établissement. Ici, les animaux ont été euthanasiés par luxation cervicale sous anesthésie profonde.
  3. Pesez et notez le poids de chaque souris le cas échéant.
  4. Stérilisez la souris en vaporisant 70 % d’éthanol pour enrober l’extérieur.
  5. Récoltez les coussinets graisseux appropriés de la souris18,19.
    REMARQUE : Prenez soin de retirer les ganglions lymphatiques du dépôt sous-cutané avant de placer le tissu dans le plat.
  6. Pesez chaque graisse et notez le poids.
  7. Placez le tampon adipeux dans l’assiette préparée de 10 cm sur de la glace.

3. Préparation des explants de tissu adipeux blanc

REMARQUE : Cette étape est facultative.

  1. Au moins 12 h avant de commencer la dissection, décongeler la matrice de la membrane basale (Matrigel) à 4 °C sur de la glace et refroidir une boîte d’embouts de pipette stériles de 200 μL à 4 °C.
  2. À l’aide d’embouts de pipette réfrigérés, pipeter 80 μL de matrice de membrane basale au centre de chaque puits d’une plaque de culture à 24 puits pour créer un dôme (figure 1A). Placez la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 min pour solidifier partiellement la matrice.
  3. Préparez les tissus : À l’aide de ciseaux de dissection stériles, pesez 0,1 g de tissu de chaque échantillon et placez-le dans du PBS sur de la glace.
  4. À l’aide d’une pince stérile, encastrez les tissus pré-pesés dans le dôme de matrice partiellement solidifié. Ajouter 30 μL de matrice de membrane basale sur le tissu incrusté. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer le tissu dans la matrice de la membrane basale.
    REMARQUE : L’intégration de tissus dans la matrice de la membrane basale est cruciale pour s’assurer que les tissus restent en culture plutôt que de flotter. Cela préserve la santé et la qualité des tissus (Figure 1B).
  5. Ajouter 1 mL de milieu de culture (DMEM avec 10 % de FBS) dans chaque puits et retourner dans l’incubateur.

4. Traitement à la collagénase

  1. Calculez la quantité de solution de collagénase nécessaire. Voir le tableau 1.
  2. Préparez une solution de collagénase avec de la DNase. Ajouter 0,00017 g de DNase pour 1 mL de solution de collagénase. Vortex à mélanger.
  3. À l’aide d’une lame de rasoir, émincez le tissu adipeux isolé jusqu’à ce qu’il apparaisse homogène (Figure 2A). Transférez le tissu haché dans un tube conique stérile de 50 ml.
    REMARQUE : Ne pas trop hacher. Le hachage est terminé lorsque le tissu apparaît homogène et pâteux. Les tissus insuffisamment hachés semblent épais et hétérogènes, et les tissus trop hachés entraîneront la libération de lipides libres (Figure 2B).
  4. Ajouter la solution préparée de collagénase et de DNase au tissu adipeux haché en utilisant les volumes calculés à l’étape 4.1. Vortex à vitesse maximale pendant 7 à 10 s pour bien combiner. Placez les tubes coniques de 50 mL horizontalement dans un agitateur réglé à 220 tr/min, 37 °C.
  5. Incuber en agitant pendant 10 min, puis tourbillonner pendant 5 s et vérifier les échantillons. Les échantillons entièrement digérés apparaîtront homogènes, sans amas ou morceaux de tissu visibles. Si les échantillons ne sont pas complètement digérés, poursuivez la digestion dans l’agitateur, en vérifiant toutes les 2 minutes (Figure 2C).
    REMARQUE : Ne pas trop digérer. Un temps excessif dans une solution de collagénase peut entraîner la dégradation des adipocytes et la libération de lipides.
  6. À l’aide d’une pipette sérologique, faire passer le tissu digéré à travers un tamis dans une nouvelle conique de 50 ml. Ajoutez un volume de FBS égal au volume de tissu + solution de collagénase à travers le tamis en une conique pour neutraliser la collagénase.
    REMARQUE : Une petite quantité de tissu restera dans le tamis après le filtrage.

5. Lavage du tissu

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissus stérile.

  1. Préparez 1 tube de 15 ml avec 10 ml de milieu de culture chaud pour chaque condition.
  2. Faites tourner les tubes de l’étape 4.6 à 300 x g pendant 3 min à la température spécifiée dans le tableau 1.
    REMARQUE : La température de centrifugation doit être modifiée en fonction du sexe des souris chez lesquelles le tissu adipeux a été isolé ; ces températures sont indiquées dans le tableau 1.
  3. Assurez-vous qu’après l’essorage, le tissu se sépare en quatre couches (Figure 3A).
    REMARQUE : La couche supérieure est les lipides libres, la deuxième couche est la couche adipocytaire mature, la troisième couche est la collagénase et la FBS, et la quatrième couche est la fraction vasculaire stromale (SVF) qui se transforme en granules vers le bas20,21.
  4. Jetez soigneusement la couche supérieure des lipides libres à l’aide d’une pipette de 200 μL.
  5. Après avoir retiré la couche supérieure, à l’aide d’une pipette p1000 dont le bas est coupé, transférer les adipocytes matures dans le tube de 15 mL préparé avec 10 mL de milieu de croissance (figure 3B).
    1. Facultatif : Pour isoler les cellules progénitrices adipocytaires primaires (CPA), faites tourner à nouveau les tubes à 300 x g pendant 10 min. Procédez ensuite à l’isolement des cellules progénitrices adipocytaires par Liu et al.22, Cho et al.23, ou similaire.
  6. Retournez doucement les tubes de 15 ml avec les adipocytes matures 3 à 5 fois jusqu’à ce que la couche blanche se soit dispersée dans tout le support.
  7. Laissez les tubes reposer à la verticale pendant 10 minutes à la température indiquée dans le tableau 1 pour permettre la séparation des couches adipocytaires et médiales.
  8. Après 10 minutes de repos, faites tourner les tubes à 100 x g pendant 1 minute à température ambiante pour favoriser davantage la séparation des couches. Après le spin, les échantillons seront à nouveau séparés en quatre couches, comme le montre la figure 3A.
  9. Retirez et jetez la couche supérieure des lipides libres à l’aide d’une pipette.
  10. À l’aide d’une aiguille de 21 g attachée à une seringue de 5 ml, faites glisser l’aiguille le long du bord du tube jusqu’à ce que le bas de l’aiguille soit dégagé de la couche d’adipocytes matures (figure 3C). Assurez-vous que le haut de l’aiguille et le bas de la seringue ne perturbent pas la couche adipocytaire mature.
  11. Tirez lentement la seringue vers le haut pour retirer le milieu de culture et tous les débris cellulaires.
    REMARQUE : Au fur et à mesure que le support est retiré, assurez-vous que la pointe de l’aiguille est dégagée de la couche adipocytaire mature.
  12. Ajouter délicatement 10 ml de milieu de culture dans chaque tube.
  13. Répétez les étapes 5.6 à 5.11. N’ajoutez pas de milieux de culture supplémentaires.
  14. À l’aide des pointes de pipette à chargement de gel, faites glisser la pointe de la pipette le long du bord du tube pour retirer le support restant sous la couche adipocytaire mature.

6. Emballage

  1. Cellules de centrifugation à 100 x g pendant 1 min à la température indiquée dans le tableau 1. Retirez les lipides libres (couche d’huile claire sur le dessus des cellules) à l’aide d’une pipette. Retirez le milieu de culture sous les adipocytes à l’aide d’une pointe de chargement de gel. Veillez à minimiser la perturbation de la couche adipocytaire (Figure 4).
  2. Répétez l’étape 6.1 jusqu’à ce que tous les milieux de culture et les lipides libres aient été éliminés (généralement 3 à 5 fois). L’emballage cellulaire doit être de couleur blanche, sans lipides libres visibles au-dessus des cellules ou sous les cellules (figure 4).

7. Placage et dosages fonctionnels

  1. Placage des adipocytes matures pour la culture cellulaire
    1. Retirez les inserts de culture cellulaire d’une plaque de 24 puits traitée pour la culture tissulaire et placez-les avec la membrane vers le haut sur la surface de la hotte.
    2. Remplir en alternant les puits de la plaque avec 1 mL de milieu de culture chaud.
    3. À l’aide d’une pointe de pipette p200 coupée, placez 30 μL d’adipocytes matures emballés de l’étape 6.2 sur le dessus d’un insert de transpuits (Figure 5A,B).
    4. Prenez et retournez avec précaution l’insert de transpuits et placez-le dans un puits prérempli dans la plaque à 24 puits (figure 5A). Placez délicatement la plaque dans l’incubateur réglé à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Les adipocytes correctement emballés doivent former une couche opaque sans gouttelettes de lipides libres claires visibles lorsqu’ils sont vus d’en haut (Figure 5C).
    5. Changez le milieu sur les adipocytes matures tous les 2 à 7 jours jusqu’à 14 jours.
      1. Pour retirer le support des puits, maintenez le transwell en place et utilisez une pipette p200 pour retirer soigneusement le support par les petites ouvertures sur le côté de l’insert du transpuits (Figure 5D).
      2. Une fois le milieu retiré, tout en maintenant le puits en place, ajoutez très lentement 1 mL de milieu sur la paroi latérale du puits.
        REMARQUE : Veillez à ajouter et à retirer des supports très lentement. Les adipocytes peuvent facilement se déloger de la membrane si le milieu est changé rapidement.
  2. Dosage de la lipolyse
    1. Plaquez des explants de tissu adipeux comme décrit à l’étape 3.4 ou des adipocytes matures comme décrit à l’étape 7.1.
      REMARQUE : Les cellules ou les tissus doivent être cultivés dans un milieu sans rouge de phénol pendant au moins 24 h avant d’effectuer le test de lipolyse.
    2. Préparation de la solution : Préparez une solution de 5 % de BSA dans du DMEM (pas de rouge de phénol) en dissolvant 5 g de BSA dans 100 mL de DMEM. Retournez doucement pour combiner jusqu’à ce que BSA soit complètement dissous.
      1. Préparer des solutions de travail pour les milieux de contrôle et de stimulation. Pour les supports de contrôle, combinez 5 % de supports DMEM BSA avec le véhicule. Pour les milieux de stimulation, combinez 5 % de milieux DMEM BSA avec 5 μM de CL-316,243. Réchauffez le fluide de contrôle et de stimulation à 37 °C avant utilisation.
    3. Retirer le milieu des puits et laver avec 1 mL de DPBS chaud. Remplissez les puits avec 500 μL par puits de milieu de contrôle ou de stimulation. Incuber à 37 °C, 5 % CO2.
    4. À 1 h, 2 h, 4 h et 24 h après le début du test de lipolyse, prélever 100 μL de milieu de chaque puits dans un tube de microcentrifugation et le remplacer par 100 μL de milieu de contrôle ou de stimulation approprié.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade.
    5. Effectuez un test colorimétrique de glycérol à l’aide d’un kit de glycérol gratuit disponible dans le commerce (voir la table des matériaux) ou similaire.
      1. Préparez les réactifs comme indiqué dans le kit.
      2. Décongelez les échantillons et mélangez doucement par pipetage.
      3. Préparez une courbe standard avec une dilution en série de sept points, 2 fois, à l’aide de la solution étalon de glycérol.
      4. Transférez 25 μL d’échantillon ou d’étalon dans chaque puits d’une plaque à fond transparent de 96 puits.
      5. Ajouter 100 μL de réactif de dosage de glycérol libre dans chaque puits contenant un échantillon ou une solution étalon.
      6. Incuber 15 min à température ambiante, puis lire l’absorbance à 540 nm (Figure 6A-D).
  3. Imagerie
    1. Préparez les lames d’imagerie. Pour préparer les diapositives, retirez la couche de papier de support de chaque entretoise d’imagerie et placez-la sur la diapositive. Deux entretoises d’imagerie peuvent être placées côte à côte sur chaque lame.
    2. À l’aide d’une pointe de pipette coupée de 200 μL, transférez 30 μL d’adipocytes emballés de l’étape 6.2 dans un tube de microcentrifugation.
    3. Préparez le mélange de coloration. Préparer 200 μL par échantillon de solution de coloration par membrane plasmique à 5 μg/mL et Hoechst à 4,5 μg/mL dans du PBS. Ajoutez le mélange de coloration aux échantillons et secouez doucement.
    4. Colorer les échantillons pendant 30 min à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière.
    5. Une fois la coloration terminée, lavez les échantillons. Ajoutez 500 μL de PBS à chaque échantillon et agitez doucement pour combiner. Laisser reposer 5 min. Faites tourner à 100 x g pendant 1 min, puis retirez le milieu sous les cellules à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel.
    6. Préparez les diapositives. Retirez le film plastique transparent de la face supérieure des entretoises d’imagerie pour exposer la couche collante.
    7. Ajoutez 500 μL de PBS dans le tube d’adipocytes colorés et mélangez délicatement.
    8. Rapidement, afin de ne pas laisser le temps aux adipocytes matures de remonter à la surface, utilisez une pointe de pipette p200 coupée pour placer 35 μL des adipocytes à l’intérieur de l’espaceur sur la lame d’imagerie.
    9. Placez une lamelle sur l’entretoise.
    10. Passez immédiatement à l’imagerie (Figure 6C). Un retard dans l’imagerie peut entraîner une hémorragie du marqueur membranaire.

Résultats

Comme le montre la figure 2, un hachage correct (figure 2B) et une digestion (figure 2C) sont importants pour l’isolement des adipocytes matures intacts. Le sous-hachage et la sous-digestion peuvent entraîner un faible rendement d’adipocytes matures en raison d’une séparation inadéquate du tissu conjonctif. Visuellement, cela peut être observé avec des tissus filandreux restant après le hachage et des amas visibles dans la solution de collagénase. De plus, le hachage excessif et la digestion excessive entraînent également un faible rendement en raison de l’éclatement des adipocytes matures. Visuellement, cela se traduit par la perte de la couche blanche opaque et l’accumulation d’une grande couche lipidique claire et libre. Des niveaux inappropriés de hachage ou de digestion entraîneront une mauvaise isolation des adipocytes.

Une bonne préparation et une bonne digestion du tissu adipeux entraîneront la séparation du tissu en quatre couches distinctes, comme le montre la figure 3. Un certain éclatement des adipocytes entraînant la libération de lipides libres est inévitable ; Cependant, un hachage et une digestion appropriés assureront une rupture minimale des adipocytes. La couche lipidique libre restante et le milieu seront éliminés lors de l’empilement des adipocytes (Figure 4). L’empilement correct des adipocytes est essentiel pour l’isolement efficace des adipocytes matures. Tout lipide libre ou milieu restant entraînera une mauvaise isolation et aura un impact négatif sur les tests fonctionnels en aval, tels que le placage, la lipolyse et l’imagerie cellulaire.

Ce protocole génère une préparation propre des adipocytes matures. Des tests d’imagerie cellulaire et de lipolyse peuvent être effectués pour évaluer la fonction cellulaire et démontrer que les adipocytes matures conservent leur fonction après l’isolement et après la culture pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines. Le test de lipolyse indique que les adipocytes matures conservent la capacité de répondre à la signalisation cellulaire par la libération de glycérol libre lors de la stimulation du récepteur adrénergique β-3 (Figure 6A,B). Cette capacité est conservée même après 2 semaines de culture et est très comparable à l’activité de lipolyse des explants de tissu adipeux cultivés pendant 24 h (Figure 6C,D). Les adipocytes de mauvaise qualité présenteront une lipolyse atténuée. L’imagerie cellulaire d’adipocytes isolés montre des adipocytes matures uniloculaires ronds et intacts contenant une seule grosse gouttelette lipidique. Les isolements d’adipocytes de mauvaise qualité montreront principalement de grosses gouttelettes d’huile extracellulaires indiquant des adipocytes éclatés.

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Figure 1 : Enrobage d’explants de tissu adipeux. (A) Image d’un dôme matriciel de membrane basale partiellement solidifié avant l’enrobage du tissu. (B) Des images représentatives d’un enrobage tissulaire inapproprié et approprié. Un mauvais enrobage est visible car le tissu semble flotter partiellement ou complètement au-dessus du dôme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Schéma d’hachage et de digestion corrects du tissu adipeux. (A) Représentation schématique des étapes de hachage et de digestion des tissus 4.2-4.6. (B) Images représentatives de tissus sous-hachés, optimaux et trop hachés. Le tissu sous-haché a de gros morceaux qui conservent leur forme d’origine. Un tissu trop haché entraîne une augmentation visible des lipides libres entourant le tissu, qui semblent clairs et huileux. (C) Images représentatives de tissus sous-digérés, optimaux et surdigérés. Les tissus sous-digérés contiennent des morceaux de tissu entier restant dans la solution. Les tissus surdigérés présentent une grande couche de lipides libres qui se sépare rapidement de la solution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Séparation des couches de tissu adipeux digéré. (A) Image schématique et représentative des couches présentes à la suite de l’étape 5.3. (B) Utilisation d’une pointe de pipette coupée pour enlever la couche adipocytaire mature du tube conique de 50 ml. (C) Technique et placement appropriés de l’aiguille et de la seringue pour retirer le milieu de culture sous la couche adipocytaire mature. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Empilement séquentiel d’adipocytes matures. Images séquentielles de l’empilement des adipocytes matures. Des couches de lipides libres, d’adipocytes et de milieux sont marquées. Après chaque essorage, les lipides libres et les milieux sont éliminés. Ceci est répété jusqu’à ce qu’aucun milieu ou lipide libre ne se sépare des adipocytes après une rotation. L’image finale est représentative d’adipocytes matures bien tassés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Ensemencement et culture d’adipocytes matures. (A) Schéma de l’ensemencement des adipocytes matures. À l’aide d’une pointe de pipette p200 coupée, des adipocytes emballés sont placés sur la membrane d’un insert de culture cellulaire. L’insert est ensuite inversé dans des puits préremplis de milieux de culture. (B) Une image représentative du placage d’adipocytes matures représentant l’extrémité de pipette coupée déposant des adipocytes sur l’insert transwell. (C) Schémas et images représentatives d’adipocytes correctement emballés et mal emballés plaqués de transpuits, vus du dessus des puits. Les adipocytes correctement emballés apparaissent blancs et opaques, tandis que les adipocytes mal emballés entraînent la formation de gouttelettes lipidiques claires. (D) Schéma de la technique utilisée pour changer de milieu de culture. Une pointe de pipette p200 permet d’évacuer soigneusement le support par les ouvertures de la paroi latérale de l’insert transwell. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Imagerie d’adipocytes matures et dosage de lipolyse. (A,B) Libération de glycérol par les adipocytes matures sous-cutanés (A) et viscéraux (B). Les adipocytes ont été isolés chez des souris mâles C57BL/6 âgées de 16 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. 30 μL d’adipocytes ont été mis en boîte comme décrit à l’étape 7.1 et cultivés pendant 1 ou 10 jours. Les adipocytes ont été traités avec 5 μM de CL-316,243 pendant 1 h, 2 h et 4 h, et des surnageants ont été collectés et analysés pour le glycérol libre. (C, D) Libération de glycérol par les explants de tissu adipeux sous-cutané (C) et viscéral (D). Le tissu adipeux a été isolé chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 18 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. 0,1 g d’explants de tissu adipeux ont été plaqués comme décrit aux étapes 3.1 à 3.4 et cultivés pendant 24 h. Les adipocytes ont été traités avec 5 μM de CL-316,243 pendant 1 h, 2 h et 4 h, et des surnageants ont été collectés et analysés pour le glycérol libre. N = 3 répétitions techniques pour A-D. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. (E) Images représentatives d’adipocytes matures sous-cutanés et viscéraux isolés. Les adipocytes ont été isolés chez des souris mâles C57BL/6J âgées de 16 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. Les adipocytes ont été colorés par coloration à membrane plasmique (rouge) et par coloration des noyaux de Hoechst (bleu). Barres d’échelle : 50 μm ; Grossissement : 60x. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

SexeDièteDépôtDifficulté de hachageCollagénase : rapport tissulaireTemps de digestion suggéré (min)Température d’essorageTempérature de lavage.
FemelleChow normalSous-cutanéDur2:112RT37 °C
ViscéralDouleur moyenne1:18RT37 °C
Régime riche en graissesSous-cutanéFacile1:18RT37 °C
ViscéralFacile1:18RT37 °C
MâleChow normalSous-cutanéDur2:1144 °CRT
ViscéralDouleur moyenne1:1104 °CRT
Régime riche en graissesSous-cutanéFacile1:1104 °CRT
ViscéralFacile1:1104 °CRT

Tableau 1 : Modifications spécifiques au sexe, au dépôt et au régime alimentaire. La difficulté de hachage de chaque tissu, décrite comme « Facile », « Moyenne » ou « Difficile » par rapport aux autres dépôts. Notez que le temps réel de hachage variera en fonction du chercheur et du tissu. Colgénase : Rapport tissulaire indiqué comme le volume (mL) de la solution de collagénase + DNase préparée à l’étape 4.1 par rapport au poids du tissu (g). Le temps de digestion est une estimation approximative, mais le temps réel de digestion variera en fonction du hachage et des tissus. Les chercheurs doivent évaluer la digestion comme décrit dans le protocole. La température d’essorage et la température de lavage diffèrent entre les souris mâles et femelles. RT indique la température ambiante.

Discussion

Les adipocytes primaires sont notoirement difficiles à isoler et à cultiver car ils se rompent facilement, et leur grande taille empêche l’utilisation d’outils courants d’isolement de cellules primaires tels que la cytométrie en flux. Le protocole décrit ici produit des adipocytes matures propres et fonctionnels, qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications en aval. Il est important de noter que ce protocole permet de séparer les adipocytes matures des autres débris cellulaires et de la couche lipidique libre, ce qui permet des tests efficaces d’imagerie, de culture et de lipolyse. Le protocole peut facilement être combiné avec des protocoles publiés22,23 pour l’isolement de la fraction vasculaire stromale et des APC. Ce protocole détaille également une procédure pour la préparation et la culture d’explants de tissus entiers à partir de tissu adipeux, qui peuvent être utilisés pour des applications en aval telles que les tests de lipolyse et la collecte de facteurs sécrétés dans le tissu adipeux entier.

Les aspects critiques comprennent le hachage, la digestion et l’élimination de la couche de lipides libres. Pour assurer un hachage correct, il est important de surveiller de près l’apparence visuelle du tissu tout au long du processus. Le temps et les efforts nécessaires pour obtenir un hachage optimal du tissu varieront en fonction du dépôt de tissu adipeux, des interventions diététiques (telles qu’un régime riche en graisses) et du chercheur. D’autres outils de hachage, tels que des ciseaux, peuvent être incorporés si nécessaire, mais cela n’a pas été exploré ici. Il convient de noter qu’un hachage excessif doit être évité car il rompra les adipocytes, ce qui diminue non seulement le rendement immédiat, mais diminue également le rendement total et la qualité des adipocytes en raison de l’effet délétère de la couche lipidique libre sur les adipocytes restants. Une bonne digestion, similaire à un bon hachage, dépendra du dépôt de tissu adipeux, des interventions diététiques, de l’âge des souris, etc. L’ajout de DNase à la collagénase aide à prévenir l’agrégation des adipocytes pendant la digestion, qui peut résulter de débris cellulaires. Le temps de digestion des tissus est donc très variable. Les estimations fournies pour les temps de digestion servent de guide, qui se trouve dans le tableau 1. Cependant, la meilleure façon de s’assurer que les tissus sont correctement digérés est d’inspecter visuellement les tissus tout au long du processus et comme décrit dans le protocole. Les différentes températures de centrifugation et de lavage détaillées dans le tableau 1, suggérées en fonction du sexe, sont essentielles pour la bonne séparation des adipocytes matures de la couche lipidique libre ainsi que des autres débris cellulaires et de la FVS ; L’utilisation d’autres températures peut entraîner la perte d’adipocytes matures en raison de l’agrégation et de l’éclatement des adipocytes.

L’élimination de la couche lipidique libre à chaque étape est d’une importance cruciale, et le non-respect de cette obligation entraînera des complications en aval pour le placage, l’imagerie et le test de lipolyse. De plus, la présence soutenue de la couche lipidique libre tout au long de la procédure entraînera une mort supplémentaire des adipocytes due à la lipotoxicité, ce qui aura un impact considérable sur le rendement et la qualité globaux. Bien qu’il soit généralement souhaitable de maximiser l’efficacité de l’isolement des adipocytes matures, l’élimination de la couche lipidique libre, même au détriment de certains des adipocytes matures, entraînera une augmentation globale du rendement des adipocytes matures à la fin du protocole.

Les limites de la procédure comprennent le nombre d’échantillons. En raison de la rigueur et du temps nécessaire à l’élimination des milieux et de la couche lipidique libre, la procédure est généralement limitée à six échantillons à la fois. Le traitement d’un nombre nettement plus élevé d’échantillons entraînera une exposition prolongée des adipocytes primaires aux lipides libres et diminuera le rendement global. Cependant, du personnel supplémentaire peut permettre d’augmenter le nombre d’échantillons. Le délai entre le hachage et le test fonctionnel est critique, car des retards excessifs dans l’élimination des milieux et de la couche lipidique libre entraînent un éclatement supplémentaire des adipocytes matures. Le protocole est en outre limité dans la capacité de séparer les sous-populations d’adipocytes matures.

Les méthodes actuelles d’étude des adipocytes matures reposent principalement sur l’isolement des APC et la différenciation ex vivo ultérieure de ces cellules. D’autres méthodes, y compris le modèle d’organe sur puce et les co-cultures de puits trans, ont commencé à être développées18,24. Cependant, il a été démontré que ces adipocytes différenciés ex vivo sont transcriptionnellement et morphologiquement distincts des adipocytes matures dans le tissu adipeux17. Morphologiquement, les adipocytes différenciés ex vivo sont multiloculaires, tandis que les adipocytes isolés in vivo sont uniloculaires. Ce protocole a été modifié et optimisé à partir de rapports précédents17,25 pour isoler et cultiver avec succès des adipocytes matures à partir d’aussi peu que 0,5 g de tissu adipeux par rapport à d’autres protocoles qui nécessitent au moins 5 g de tissu adipeux25 . Enfin, cette étude visait à illustrer visuellement la réussite des étapes clés du protocole au lieu des temps concrets, des températures de centrifugation et des quantités de collagénase, bien que des lignes directrices soient incluses dans le tableau 1. Ces paramètres doivent être ajustés en fonction de facteurs tels que le dépôt de tissu adipeux, le sexe et l’adiposité de l’animal, qui peuvent tous avoir un impact sur l’efficacité de la digestion et la séparation propre des adipocytes matures dans ce protocole.

Au total, la procédure dure 3 à 4 heures, en fonction du nombre de souris regroupées et du nombre d’échantillons de tissu adipeux individuels. On s’attend à ce que la capacité de cultiver et d’évaluer le rôle fonctionnel des adipocytes matures permette de nombreuses applications en aval pour l’étude de la biologie des adipocytes elle-même (par exemple, le métabolisme, l’utilisation des nutriments et le traçage) et de l’interaction des adipocytes avec d’autres types de cellules, telles que les APC, les cellules cancéreuses et les cellules du système immunitaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier 5 For The Fight et le Huntsman Cancer Institute (KIH), la V Foundation for Cancer Research (KIH) et DK133455 (KIH). Schémas du protocole créé avec Biorender. De plus, les auteurs tiennent à remercier Stephanie Giagnocavo et le Cell Imaging Core de l’Université de l’Utah pour leur aide en matière d’imagerie, ainsi que Mark Lee pour ses commentaires sur le manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100x Poloxamer 188 solutionSigmaP5556-100mL
15 mL coniqueCellstar188261
21 G AiguilleBD305165
5 mL SeringueBD 309646
50 mL ConiqueCellstar227261
6,5 mm Transwell avec 0,4 µ ; m Pore Polycarbonate Membrane InsertCorning3413
Bovin Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasma Membrane StainsThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 sel disodiqueTocris1499
Collagénase PoudreSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM no pheonol RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Fetal Bovin Serum (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific
Gel Loading Pipet TipFisher scientific02-707-181
Supplément GlutaMAX Gibco35050061
Glycérol Assay KitAbcamAB133130
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeuseThermo Scientific  ;
Hoechst 33342 SolutionThermo Fisher Scientific62249
Mini Shaker d’incubationVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Lunettes de protection de microscopeVWR16004-302
PBSGibco10010023
Pénicilline-StreptomycineGibco15140-122
Espaceurs d’imagerie SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (passoire à cocktail à mailles fines SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
151884875004271

Références

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Mots-clés

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