Article de méthode

Mesure par cytométrie en flux à haut débit du mécanotype cellulaire basée sur la rupture et l’administration de sondes de tension d’ADN dans les cellules

DOI :

10.3791/67852

⸱

13 juin 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode mesure la propension d’une cellule à rompre des ligands présentant des duplex d’ADN immobilisés pour signaler les forces de traction cellulaires relatives. Les oligonucléotides fluorescents rompus sont délivrés dans la cellule et analysés par cytométrie en flux, enregistrant l’histoire mécanique de la cellule. Cela permet de mesurer à haut débit la génération de force cellulaire dans le contexte du mécanophénotypage cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les forces mécaniques guident de nombreux processus cellulaires critiques, et le phénotype mécanique cellulaire, ou mécanotype, est perturbé dans de nombreuses maladies. La méthode la plus largement utilisée pour quantifier les forces cellulaires est la microscopie à force de traction, qui capture traditionnellement les forces que les cellules exercent sur leur environnement par microscopie à haute résolution des cellules déformant des substrats élastiques contenant des billes fluorescentes, déviant des micro-poteaux ou modifiant la conformation des capteurs de tension moléculaire immobilisés. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour mesurer les forces de traction cellulaire relatives à l’aide de sondes de tension d’ADN établies et quantifiées par cytométrie en flux. Cette méthode comporte cinq étapes globales décrites ci-dessous. Premièrement, l’expression et la purification du ligand d’intégrine de haute affinité échistatine fusionné à un marqueur HUH de liaison à l’ADN ; deuxièmement, préparation des sondes duplex d’ADN contenant des rapporteurs et des ligands ; troisièmement, la préparation de surface et l’immobilisation des sondes ; quatrièmement, exécution de l’expérience « Rupture and Deliver » et lecture de l’écoulement. Enfin, nous décrirons l’analyse des données et l’interprétation des résultats expérimentaux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les forces mécaniques guident de nombreux processus cellulaires critiques, de la migration1 à la différenciation des cellules souches2 en passant par la capacité d’un lymphocyte T à se lier à la cellule présentatrice d’antigène3 et à être activée par celle-ci. Les variables mécaniques sont dérégulées dans la maladie, ce qui entraîne des différences mesurables dans le phénotype mécanique cellulaire, ou mécanotype, des cellules 4,5. Le mécanotype est un terme générique désignant les propriétés mécaniques des cellules et des tissus et peut inclure des paramètres tels que la contractilité, la migration, l’adhésion et la déformabilité. La rigidité cellulaire ou tissulaire est l’aspect le plus courant du mécanotype mesuré car il peut être mesuré à haut débit. Par exemple, les cellules cancéreuses sont souvent plus rigides que les cellules normales tandis que les cellules métastatiques sont souvent plus dociles 6,7. La génération de force par les cellules est un aspect important du mécanotype modifié dans la maladie8 parce qu’il sonde des interactions spécifiques entre les cellules et l’environnement. La microscopie à force de traction est la méthode la plus courante pour mesurer la génération de force cellulaire et consiste à plaquer les cellules sur des substrats élastiques déformables noyés avec des billes fluorescentes ou sur des réseaux de micro-tenons et à suivre les changements dans le mouvement des billes ou la déviation des billes pour calculer les forces exercées par les cellules. Les capteurs de tension moléculaire ont également été utilisés pour mesurer les forces de traction et offrent l’avantage de la sensibilité à des forces de plus petites amplitudes et de la mesure des forces générées par des paires ligand-récepteur spécifiques 9,10. Cependant, la mesure des forces cellulaires avec les capteurs TFM et de tension moléculaire traditionnels repose sur l’imagerie à haute résolution, ce qui limite le débit de mesure.

Nous avons récemment adapté des sondes de tension DNA-duplex dans une lecture à haut débit de la génération de force cellulaire dans le contexte du mécanophénotypage cellulaire11 (Figure 1). Brièvement, des duplex d’ADN adaptés des sondes TGT12, largement utilisées, sont immobilisés dans les puits des plaques de 96 puits par la chimie biotine-neutravidine du brin « d’ancrage» 13. La force de rupture requise des duplex TGT peut être réglée en faisant varier la position de la biotine sur le brin d’ancrage, ce qui modifie la géométrie du duplex, ce qui entraîne soit une conformation de décompression à faible force de rupture (Figure 2A), soit une conformation de cisaillement à force de rupture élevée (Figure 2B). Le brin d’ancrage contient de la biotine et un quencher de fluorescence, tandis que le brin « ligand » de l’ADN contient une sonde fluorescente et un ligand reconnaissant un récepteur de surface cellulaire impliqué dans la mécanodétection, tel qu’une intégrine. Le ligand est lié de manière covalente à l’ADN (Figure 3) via l’utilisation d’une étiquette de fusion de liaison à l’ADN appelée étiquette HUH fusionnée au ligand14,15. Les marqueurs HUH sont de petits domaines endonucléases HUH impliqués dans la réplication virale et d’autres processus qui reconnaissent une séquence/structure de 9 pb d’ADN simple brin, l’entaillent et forment un adduit covalent de phosphotyrosine à l’extrémité 5' de l’ADN entaillé.

Les cellules plaquées sur le dessus de ces sondes se lient au ligand et se rompent un pourcentage des sondes proportionnel aux forces qu’elles génèrent. Le brin de ligand fluorescent lié à son récepteur est ensuite délivré dans la cellule. Ainsi, l’histoire mécanique des cellules est enregistrée dans les cellules d’intérêt via l’amplitude de leur fluorescence. La fluorescence peut être quantifiée à l’aide de la cytométrie en flux. Nous appelons cette méthode Rupture and Deliver-TGTS ou RAD-TGT. Cette méthode mesure non seulement la fluorescence et, par conséquent, la force relative générée par des milliers de cellules à la fois, mais la lecture de la cytométrie en flux offre également la possibilité de trier les cellules par leur mécanotype, permettant des lectures -omiques en aval, ainsi que des cribles CRISPR-KO ou de médicaments qui pourraient identifier des gènes ou des médicaments qui modifient le mécanotype cellulaire.

Dans le protocole ci-dessous, nous montrons comment préparer et exécuter une expérience RAD-TGT. Nous mettrons en évidence l’expression et la purification d’un type de HUH connu sous le nom de WDV (virus du nanisme du blé) par lui-même pour servir de contrôle négatif et fusionné à l’échistatine, un ligand qui se lie étroitement à une famille de récepteurs d’adhésion qui transduisent la force entre la cellule et l’environnement connue sous le nom d’intégrines de liaison RGD, pour servir de condition expérimentale. À partir de là, nous montrerons comment préparer les RAD-TGT pour une utilisation expérimentale. Nous vous expliquerons comment procéder aux expériences et comment analyser les données résultantes. Nous mettrons également en évidence une application des RAD-TGT en mesurant comment un inhibiteur de ROCK modifie les forces médiées par l’intégrine dans les cellules CHO-K1 (Figure 4). En résumé, nous espérons que ce protocole servira d’entrée à la mécanobiologie, indépendamment de l’expérience préalable ; Le domaine n’en est qu’à ses balbutiements et tous les horizons sont essentiels à une meilleure compréhension.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Expression et purification du HUH

  1. Transformer Escherichia coli avec le plasmide WDV (± Echistatin), environ 1,5 μL de plasmide de ~50 ng/μL par transformation, et cultiver sur des plaques de gélose à l’ampicilline.
  2. Inoculez 5 mL de LB avec une seule colonie et faites pousser toute la nuit à 37 °C.
  3. Inoculez 1 L de LB avec la culture de nuit et cultivez jusqu’à ce que la DO600 atteigne ~0,8.
  4. Abaisser la température à 18 °C, induire avec de l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) de 500 μM et incuber pendant la nuit.
  5. Granuler les cellules par centrifugation à 3 750 × g pendant 30 min. Remettre la pastille en suspension avec 40 mL de tampon de lyse (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 7,5, 1 mM d’EDTA).
  6. Lyse les cellules avec 3 x 90 s sonication sur glace à 70 % de rapport cyclique, puissance 7. Essorer à 24 000 × g pendant 30 min à 4 °C et verser le surnageant dans un tube neuf de 50 mL.
  7. Mettre la suspension de résine Ni-NTA dans un tube conique de 15 mL (1 mL de suspension de billes/L de culture), essorer à 700 × g pendant 2 min et retirer le surnageant.
  8. Ajoutez 6 ml d’eau à la résine et répétez le processus de lavage à l’étape 1.7.
  9. Répétez le lavage deux fois avec un tampon de lavage (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris [pH 7,5], 1 mM d’EDTA, 20 mM d’imidazole) au lieu de l’eau. Remettre les billes en suspension dans 5 mL de tampon de lavage.
  10. Ajoutez la suspension de billes (étape 1.9) dans les cellules lysées (étape 1.6) et mélangez soigneusement. Faites pivoter les cellules et les billes lysées pendant au moins 1 h à 4 °C.
    REMARQUE : Pour le reste de ce protocole, ne laissez jamais la résine sécher et prélevez tous les échantillons qui s’écoulent dans la colonne.
  11. Verser le mélange sur une colonne de 20 mL et recueillir le coulement. Lavez la colonne avec 4 x 25 ml de tampon de lavage.
  12. Éluer avec 1 x 10 mL de tampon d’élution (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris [pH 7,5], 1 mM d’EDTA, 250 mM d’imidazole) dans un tube frais de 15 mL, en recueillant séparément l’élution précoce et tardive (l’élution précoce est le premier 1 mL, l’élution tardive est le dernier 1 mL).
  13. Analysez toutes les fractions collectées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) pour vous assurer que le HUH a été collecté pendant l’élution (voir la figure supplémentaire S1). Pour de meilleurs résultats, chargez un gel à 4-20 % et faites-le fonctionner pendant 45 min à 35 W et 200 V.
  14. Ajouter la protéine éluée dans la tubulure de dialyse et incuber toute la nuit dans un tampon de dialyse (identique au tampon de lyse) à 4 °C. Pour retirer l’étiquette HIS, ajoutez ULP1 sans agent réducteur directement sur la protéine éluée avant de mettre la protéine dans la tubulure de dialyse.
  15. Le lendemain matin, préparez la résine Ni-NTA comme décrit aux étapes 1.7-1.9 et incubez avec la protéine dialysée. Versez le mélange de protéines et de résine Ni-NTA dans une colonne et récupérez le flux. Lavez la colonne avec 10 ml de tampon de dialyse et recueillez tout écoulement.
  16. Évaluer la fraction recueillie sur SDS-PAGE en suivant les réglages ci-dessus pour s’assurer que la protéine est présente, et se concentrer à la concentration souhaitée à l’aide d’un filtre ultracentrifuge de 15 mL avec une coupure de poids moléculaire de 10 kDa (voir la figure supplémentaire S1).
    REMARQUE : La concentration finale idéale en protéines se situe entre 40 μM et 100 μM.

2. Préparation RAD-TGT

  1. Assembler les duplex dans un rapport molaire de 1,1:1 entre le brin d’ancrage (avec trempeur) et le brin ligand (avec fluorophore) à une concentration finale de 40 μM de ligand dans une solution de 10 mM de Tris (pH 7,5), 50 mM de NaCl et 1 mM d’EDTA.
  2. Recuit par incubation à 98 °C pendant 5 min suivie d’un refroidissement à température ambiante pendant 1 h ; Protéger de la lumière.
    REMARQUE : Les échantillons de faible volume s’évaporent facilement et peuvent être difficiles à récupérer complètement. Préparez un volume plus important que nécessaire.
  3. Faire réagir les duplex recuits avec HUH (en utilisant la concentration du brin le moins abondant lors du recuit ; dans ce cas, le brin ligand) dans un rapport molaire de 1:2 à une concentration finale de 10 μM duplex et 20 μM HUH dans une solution contenant 1 mM de MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM de NaCl.
  4. Incuber la réaction pendant 30 min à 37°C dans un thermocycleur ou un bloc thermique protégé de la lumière. Après l’incubation, retirez-les du feu et utilisez-les à l’aide d’un minifuge de paillasse pour faire tourner les TGT maintenant assemblés. Placez les TGT immédiatement sur une plaque ou conservez-les à 4 °C dans l’obscurité.

3. Préparation de surface

  1. Immédiatement après l’ouverture d’une plaque inférieure en verre de 96 puits, couvrez tous les puits d’une feuille de plaque PCR adhésive afin de préserver les puits inutilisés pour une utilisation ultérieure. À l’aide d’une lame de rasoir, découpez la feuille d’aluminium au-dessus des puits d’intérêt (de préférence des puits sans bord) et ajoutez 100 μL de PBS froid dans les puits souhaités.
    REMARQUE : Une fois que le liquide est ajouté dans les puits, ne laissez pas les puits s’assécher. En cas de séchage, l’adsorption non spécifique des biomolécules à la surface aura un impact négatif sur les données. Gardez 100 μL de volume excédentaire en permanence dans le puits pour éviter tout dessèchement.
  2. Ajoutez 200 μL de PBS froid dans les puits, pipetez doucement le mélange 2 à 5 fois et retirez 200 μL de PBS. Répétez l’opération pour un total de trois lavages.
    REMARQUE : Lors de l’ajout et du retrait de liquide des puits, maintenez la pointe de la pipette sur le bord du puits à un angle de 45° pour éviter de perturber la surface. Faites-le pour toutes les manipulations de la plaque, sauf lors du placage des cellules.
  3. Pour les puits expérimentaux, préparer une solution de 0,1 mg/mL de BSA biotinylé dans du PBS et ajouter 80 μL de la solution dans les puits désirés. Pour les puits témoins, préparez la même solution avec l’ajout de 18,75 μg/mL de fibronectine et ajoutez 80 μL dans les puits respectifs. Mélangez doucement à la pipette tous les puits utilisés, placez le couvercle sur l’assiette et couvrez de papier d’aluminium. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  4. Retirez 80 μL de volume des puits et lavez les puits en répétant l’étape 3.2. Ajouter 80 μL de neutravidine à 0,1 mg/mL dans une solution de PBS de la même manière qu’à l’étape 3.3.
  5. Après l’incubation, retirer 80 μL de volume des puits et répéter l’étape 3.2. Diluer les TGT assemblés (étape 2 de la préparation RAD-TGT) à 0,1 μM dans du PBS et une solution de 80 μL dans les puits de la même manière qu’à l’étape 3.3. Soit couvrir les puits d’une feuille adhésive et les stocker dans l’obscurité à 4 °C, soit les protéger de la lumière et les incuber à température ambiante pendant 1 h avant de procéder aux expériences.
    REMARQUE : Nous vous recommandons de considérer l’étape 3.5 comme un point d’arrêt et d’attendre le lendemain pour procéder aux expériences.

4. Protocole expérimental RAD-TGT

  1. Une fois que les TGT ont eu suffisamment de temps pour adhérer, laver les puits (voir étape 3.2) 3 fois avec du PBS, suivi de deux lavages avec un milieu sans sérum. Laissez le média dans les puits après le lavage final. Ajoutez 200 μL de PBS dans les puits périphériques pour atténuer les effets de bord et transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C pour préchauffer la plaque.
  2. Récupérer les cellules d’intérêt à ~80 % de confluence, et aspirer le milieu suivi de l’ajout et de l’aspiration de PBS pour laver les cellules. Ajouter un volume approprié de trypsine et placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se dissocient (~5-10 min).
  3. Une fois les cellules dissociées, ajoutez le volume d’origine du milieu cellulaire complet utilisé pour maintenir les cellules à la plaque et remettez en suspension avec une pipette sérologique. Ajouter la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
  4. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 4 min, aspirer le média et remettre en suspension la pastille dans du PBS. Répéter la centrifugation et l’aspiration, puis remettre en suspension dans 5 mL de milieu sans sérum et répéter la centrifugation et l’aspiration. Remettre les cellules en suspension dans ~2 ml de milieu sans sérum.
  5. Déterminez la densité des cellules remises en suspension et ajustez la concentration comme vous le souhaitez.
    REMARQUE : Nous visons à plaquer ~15 000 cellules par puits, nous préparons donc les cellules pour qu’elles soient à une concentration de 150 000 cellules/ml, ce qui permet de plaquer 15 000 cellules avec 100 μL de cellules remises en suspension.
    1. Facultatif : Si l’on doit tester l’effet de médicaments ou d’autres agents pharmacologiques, ajoutez la concentration appropriée de médicament dans les cellules et renvoyez les cellules dans l’incubateur. Prévoyez suffisamment de temps de préincubation avant de passer à l’étape suivante.
  6. Récupérez la plaque de l’incubateur (étape 4.1) et retirez le volume de milieu restant du lavage des puits expérimentaux dans la plaque préchauffée. Lavez une fois avec le support souhaité. Pipetez soigneusement 100 μL des cellules remises en suspension vers les puits souhaités. Transférez les cellules plaquées dans l’incubateur pendant 90 min.
    REMARQUE : Pipetez doucement les cellules au centre des puits, en essayant de garder la pipette verticale.
  7. Après l’incubation, retirer ~125-170 μL de volume des puits. Si nécessaire, lavez doucement les cellules avec 200 μL de PBS chauffé. Ajouter 50 μL de trypsine dans chaque puits et remettre la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules commencent à se dissocier (5-10 min).
    REMARQUE : Assurez-vous que le puits ne s’assèche jamais et qu’il n’y a pas de surtrypsinisation.
  8. Ajouter 160 μL de tampon d’écoulement fraîchement préparé (1 mM d’EDTA, 2 % p/v d’albumine sérique bovine, dans du PBS froid) dans les puits. Pipetez doucement de haut en bas pour dissocier les cellules, ajoutez 196 μL de cette suspension cellulaire dans des tubes PCR suivis de 4 μL d’iodure de propidium, et mélangez délicatement. Préparer un échantillon de contrôle sans iodure de propidium pour servir de contrôle pour le contrôle de la viabilité.
  9. Placez les tubes dans un seau à glace avec le couvercle bloquant la lumière et procédez à la mesure de l’intensité de fluorescence avec un cytomètre en flux.

5. Collecte et analyse des données

  1. Analysez chaque échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Essayez de collecter au moins 2 000 cellules vivantes par échantillon.
    REMARQUE : Minimisez l’exposition à la lumière pour les échantillons qui n’ont pas encore été analysés et conservez-les sur de la glace.
  2. Une fois toutes les données collectées, transférez les fichiers vers le logiciel de votre choix et contrôlez les cellules.
    1. Porte pour cellules par aire de diffusion vers l’avant (FSC-A) par rapport à la zone de diffusion latérale (SSC-A).
    2. Porte pour les singlets au sein de la population cellulaire par FSC-A par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H).
    3. Porte pour les cellules vivantes de la population singulet en fixant une porte verticale sur l’histogramme de l’intensité de la zone d’iodure de propidium à la valeur la plus élevée pour le contrôle sans iodure de propidium préparé à l’étape 4.8. Tous les événements qui ne dépassent pas la porte sont des cellules vivantes
    4. Placez une porte verticale sur un histogramme de l’intensité de la zone Cy5 (Cy5-A) des singlets pour éliminer tout événement non fluorescent sur le canal Cy5-A causé par des débris cellulaires. Assurez-vous que cette porte verticale est à une valeur inférieure à celle des cellules non marquées analysées mais supérieure à 0 intensité fluorescente.
    5. Pour analyser les populations cellulaires, définissez une porte bissectrice au 99e centile de chaque témoin négatif respectif.
    6. Appliquez une porte à la même intensité que les conditions expérimentales correspondantes et collectez le pourcentage de cellules dépassant la porte de contrôle négative pour chaque condition.
      REMARQUE : Les pourcentages peuvent être directement comparés entre les répétitions biologiques au moyen d’une analyse statistique appropriée. Voir les données représentatives.
  3. Analysez les données à l’aide de la fluorescence Cy5 médiane, en divisant l’intensité médiane du ligand-WDV par la médiane du WDV seul et comparez ces valeurs entre les répétitions.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour démontrer l’utilité et la facilité d’utilisation des RAD-TGTs, nous avons analysé les effets des inhibiteurs de la Rho Kinase (ROCK) sur le mécanotype des cellules CHO-K1. La voie ROCK est impliquée dans l’organisation de l’actine et l’activation de la myosine. Des études antérieures utilisant des TGT ont montré que l’inhibition de ROCK diminue la rupture des TGT de cisaillement 16,17,18. Les TGT de cisaillement ou à force ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons fourni des protocoles sur la façon de configurer et d’effectuer des expériences RAD-TGT dans le but d’encourager les scientifiques des sciences de la vie à intégrer le mécanotypage dans leur flux de travail. L’un des principaux avantages des RAD-TGTs, en particulier pour ceux qui ont des capacités de production de protéines, est l’utilisation d’endonucléases HUH pour ligaturer des ligands à des duplex d’ADN avec une haute fidélité sans aucune réticulation chimique et/ou purifi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. reconnaît le financement du NIH R35GM119483. Biorender a été utilisé pour faire des schémas de figures.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 mLSarstedt62.554.205
Plaque à fond en verre à 96 puitsCellvisP96-1.5H-N
Plaque adhésive PCR feuilleThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillineApex Bioresearch Products  ;25-530
Bio-Rad Colonne de 20 mLBio-Rad7321010
Biotinylé BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Compétent E. coliNewEngland BiolabsC2527H
Albumine sérique bovineThermo Fisher ScientificBP9703100
Incubateur de culture cellulaireThermo Fisher Centrifugeuse51030284
Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Tube de dialyseThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTA Thermo Fisher ScientificS311-100
Flow CytomètreBDAccuri C6 Plus
FlowJo  ;BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazoleThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Ligand StandTechnologies d’ADN intégréesconçues par l’utilisateur oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo FisherScientific M87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA résine  ;Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Boîte de PétriVWR25384-342
Solution d’iodure de propidiumCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE gelBio-Rad4561096
Média sans sérumThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem D’occasion, les milieux alternatifs sans sérum peuvent être utilisés
Shearing Anchor Strand IntegratedDNA technologiesconçues par l’utilisateur oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
ThermocycleurBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
filtre ultracentrifuge, coupure 10 kDaAmikon
Unzipping Anchor StrandTechnologies d’ADN intégréesconçues par l’utilisateur oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049reconstitué dans DMSO
scientifique

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

Articles connexes