Caractérisation de l’auto-assemblage réversible dépendant du pH de colloïdes d’or enrobés de bêta-amyloïde 1-40

Résumé

Ici, nous présentons une méthode systématique décrivant l’auto-assemblage quasi-réversible des agrégats d’or 20 nm enrobés de bêta-amyloïde 1-40 (Aβ _1-40). Le réseau quasi-réversible dépendant de la taille nanométrique entre les peptides a été corrélé avec des acides aminés spécifiques ou des sections du monomère Aβ _1-40.

Résumé

La caractérisation de Aβ _1-40 revêtu sur les surfaces des particules colloïdales de nano-or a été réalisée à l’aide de la spectroscopie par résonance plasmonique de surface (SPR) et de la microscopie électronique à transmission (MET). Le décalage dépendant du pH observé de la bande SPR des particules d’or Aβ _1-40 enrobées de 20 nm a été corrélé avec l’alternance d’agrégation et de désagrégation observée dans les images TEM. Un pH de ~4 a induit une conformation dépliée, et un pH de ~10 a induit une conformation plissée de Aβ _1-40 sur la surface de l’or. Ce processus d’agrégation réversible a été observé par imagerie Raman lorsque le pH a été progressivement modifié de pH 4 à pH 10. Nous avons observé un changement de morphologie dépendant du pH en Aβ _1-40 sur la surface de l’or, où des agrégats clairs ont été observés à pH 4. Cependant, nous avons observé des différences très subtiles dans le spectre de la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) entre des conditions de pH 4 et de pH 10, la différence la plus frappante étant une densité spectrale de l’ordre de 250 ^cm-1 et 1750 ^cm-1. Plus précisément, l’analyse du mode de l’agrégation réversible a indiqué que les agrégats étaient formés par la conformation dépliée de Aβ _1-40 qui impliquait la section du cycle benzénique de la tyrosine et de la phénylalanine. Inversement, le désassemblage des agrégats a été associé à des changements conformationnels dans le repliement protéique de Aβ _1-40 impliquant l’histidine, la glutamine, la méthionine et l’acide aspartique.

Introduction

La fibrillogenèse des peptides bêta-amyloïdes 1-40 (Aβ _1-40) ou 1-42 (Aβ _1-42) a été largement étudiée en tant que composant essentiel dans la formation des plaques amyloïdes qui sont une cause de la maladie d’Alzheimer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ^,11. Le mécanisme clé de la fibrillogenèse est une oligomérisation des peptides Aβ _1-40 ou Aβ _1-42 pour former un agrégat de protéines neurotoxiques, et des recherches approfondies ont été menées pour comprendre les mécanismes de formation des monomères 12,13,14. Nous avons adopté une approche consistant à examiner les peptides amyloïdogènes formant des agrégats sur une surface de nano-or et à identifier les facteurs responsables de la mise en réseau entre les peptides éloignés de la surface d’or 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ _1-40 adoptent une conformation dépliée (A) dans des conditions acides (pH ~4) et une conformation repliée (B) dans des conditions basiques (pH ~10). Nous avons observé des particules colloïdales d’or isolées Aβ _1-40 enrobées à pH ~10 et de grands agrégats colloïdes dorés Aβ _1-40 enrobés à pH ~4 (Figure 1)^23,24. La conformation dépliée de Aβ _1-40, dans des conditions acides, favorise la mise en réseau peptidique entre les monomères Aβ _1-40 sur la surface des nanoparticules d’or, ce qui entraîne la formation d’agrégats colloïdaux d’or (voir A sur la figure 1). Lorsque le monomère Aβ _1-40 maintient la conformation repliée à un pH basique ou neutre, Aβ _1-40, les monomères ne se mettent pas en réseau en agrégats, et les nanoparticules d’or enrobées restent sous forme de particules dispersées individuelles (voir B dans la figure 1). Nous pouvons donc interroger le processus par lequel les peptides Aβ _1-40 subissent des changements conformationnels pour former des agrégats en mesurant le décalage de la bande SPR sur une gamme de conditions de pH 25,26,27,28,29,30,31.

Nous avons testé plusieurs tailles différentes de nanoparticules d’or et avons constaté que le colloïde d’or de 20 nm présentait le processus d’auto-assemblage réversible le plus important des monomères Aβ _1-40 en réponse à un changement externe de pH (Figure 2). Il s’agit d’une indication claire d’un changement réversible de la conformation peptidique, où les conditions acides (A) induisent une conformation dépliée, améliorant la mise en réseau et conduisant à l’agrégation de colloïdes d’or. La condition de base (B) induit une conformation repliée des monomères 26,27,28,29,30,31.

Protocole

1. Préparation de nanoparticules d’or enrobées Aβ _1-40

1. Ajouter un volume de 1 mL d’eau distillée désionisée à 1 mg d’Aβ _1-40 lyophilisé (MW : 4,2 kDa, pureté HPLC de 98 %) à l’aide d’une aiguille de seringue. Mélanger la solution à l’aide d’un mélangeur vortex pendant environ 30 s et s’assurer qu’aucune particule solide n’est observée dans la solution à température ambiante (RT ; ~20 °C).
   1. Préparez toutes les solutions mères en utilisant de l’eau désionisée et distillée (~18 MΩ·cm).
   2. Identifier spectroscopiquement la concentration en utilisant l’absorption de tyrosine à 275 nm³², qui a un coefficient d’extinction moléculaire ε₂₇₅ de 1390 ^cm-1· ^M-1.
   3. Conserver les solutions-mères de Aβ _1-40 à -80 °C. (Voir le tableau des matériaux pour les produits commerciaux de Aβ _1-40.)
2. Décongeler la solution mère de peptides environ 5 minutes avant la collecte des données. Mélangez un volume de 8 μL de la solution peptidique avec 800 μL de particules colloïdales d’or dans un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter un volume de 4,2 mL d’eau distillée désionisée, puis agiter l’échantillon pendant 10 s 30,31,33,34.
3. Fixez la concentration des peptides Aβ _1-40 à 1,8 nmol et situez le rapport des peptides Aβ _1-40. Le nombre de colloïdes d’or variait entre ~500:1 et ~2000:1²⁵.

2. Changement itératif du pH et surveillance du décalage de bande SPR correspondant

1. Réglez la température de la solution à une valeur déterminée (par exemple, 25 °C) à l’aide de l’unité de contrôle de température du spectrophotomètre ultraviolet-visible-proche infrarouge (UV-Vis-NIR).
2. Surveillez le pH initial de la solution d’échantillon à l’aide d’un pH-mètre et réglez-le légèrement en dessous du pH 7. Collectez le spectre d’absorption dans la gamme comprise entre 400 nm et 1000 nm.
3. Modifiez le pH de l’échantillon à ~ pH 4 (c’est-à-dire pH 4,0 ± 0,3) en ajoutant des volumes de 10 μL de HCl 0,1 M et collectez le spectre d’absorption entre 400 nm et 1000 nm.
4. Modifiez le pH de l’échantillon à ~ pH 10 (c’est-à-dire pH 10 ± 0,3) en ajoutant des volumes de 10 μL de NaOH 0,1 M et collectez le spectre d’absorption entre 400 nm et 1000 nm.
5. Modifiez le pH entre pH 4 et pH 10 avec HCl et NaOH 10 fois et collectez le spectre d’absorption en continu à 25 ± 0,2 °C^29,30.
   REMARQUE : Pour toutes les solutions d’échantillons, la densité optique du pic de la bande SPR a été maintenue autour de 0,2. On s’attend à un effet tampon dû à la solution tampon résiduelle dans une solution. Ainsi, la valeur finale du pH a été déterminée après la confirmation de l’équilibre. La valeur du pH a été mesurée directement dans une cellule de cuvette d’échantillon à l’aide d’une microélectrode de pH, qui a une précision de ±0,005 pH.
6. Obtenez l’ensemble de données ASCII (American Standard Code for Information Interchange) de longueurs d’onde en fonction de l’absorbance. Extrayez la position moyenne des pics de bande à l’aide du programme Peak Fit .
   1. Tracez l’ensemble de données pour afficher la densité optique en fonction de la longueur d’onde (nm) à l’aide de la fonction Plot .
   2. Marquez les longueurs d’onde de crête initiales λ₁, λ₂ et λ₃ en sélectionnant leurs positions approximatives dans les données tracées et ajustez les données à l’aide de la fonction RUN .
   3. Obtenez le graphique contenant le pic central de chaque (λ_i), XC_i, avec l’aire de chaque bande (A_i).
7. Exportez les positions et les zones de pic extraites vers un tableur et calculez la position moyenne du pic à un pH donné.
   1. Déterminez le facteur de pondération a_i de chaque centre de crête λ_i en comparant l’aire de la bande (A_i) à l’aire totale de l’ensemble des bandes comme suit : .
   2. Extrayez la position moyenne du pic (pH) à l’aide de l’équation (1).
      (1)
8. Générez un tracé de réversibilité à l’aide du processus suivant :
   1. Tabulé les positions moyennes des pics, , en fonction de chaque numéro d'"opération », n comme vs. n. Faire en sorte que le numéro d’opération, n, soit 1 pour l’échantillon avant l’ajout d’acide à ~pH 7. Augmentez le nombre d’opérations de 1 à chaque fois, en changeant le pH pour qu’il soit ~pH4 avec HCl ou que le pH soit ~pH 10 avec NaOH. Faites en sorte que n soit pair à une condition acide (c’est-à-dire ~pH 4) et impair soit une condition basique (c’est-à-dire pH 10).
   2. Analysez la position du pic à chaque n, (n) = λ(n), en utilisant la formule³⁰
      (2)
      REMARQUE : Représenter une position de crête moyenne initiale à n = 1 par A. Exprimer les paramètres B et C comme le décalage de position de crête dépendant de n. Définissez le paramètre D comme une amplitude du facteur d’amortissement, E, de répétition. Utilisez la fonction sinusoïdale pour montrer l’ondulation de la position du pic en fonction de n.
   3. Transportez l’ensemble de données de (x, y) vers le logiciel Origin et tracez.
   4. Former la fonction personnalisée donnée dans l’équation (2) sous Fonction d’ajustement de courbe non linéaire de l’analyse. Entrez les valeurs initiales A, B, C, D et E, puis cliquez sur RUN pour terminer l’ajustement.
9. Imagerie TEM
   1. Réaliser les échantillons TEM des colloïdes d’or 20 nm revêtus d’Aβ _1-40 avec des grilles de cuivre revêtues de Formvar. Examiner les échantillons à l’aide d’un MET fonctionnant à 80 kV.
   2. Collectez des images à un grossissement nominal de 28 000x ou 71 000x sur un modèle d’appareil photo numérique CCD (AMT) de 4 mégapixels XR-40. Recueillir les images TEM pour l’or 20 nm Aβ _1-40 couché à chaque numéro d’opération n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 et 10 (pH 4), et n = 3, 5, 7 et 9 (pH 10).

3. Imagerie Raman et étude de l’agrégation réversible

1. Déposer 100 μL de solution sur un disque de mica (diamètre de 1 cm) pour chaque échantillon au numéro d’opération n. Faites sécher les échantillons pendant la nuit avant la mesure.
2. Collectez des images en lumière blanche à chaque numéro d’opération n. Préparez l’échantillon séparé sur un disque de mica, car le pH a été continuellement modifié entre ~pH 4 et ~pH 10 pour chaque numéro d’opération n (figure 3).
3. Collecter l’image Raman à chaque opération numéro n avec un laser d’une longueur d’onde de λ = 633 nm à une puissance de 0,5 ± 0,05 mW avec une résolution spatiale de ~0,43 μm dans une grille composée de 100 × 100 pixels avec un temps d’intégration de 500 ms/spectre pour la région comprise entre ~200 ^cm-1 et ~2 800 ^cm-1 (Figure 4).
4. Tracez le spectre représentatif de chaque n aligné en fonction de n et construisez le spectre tridimensionnel du SERS en fonction de n pour Aβ_1-40 revêtu d’or 20 nm (Figure 5A). Utilisez la vue de dessus du spectre SERS tridimensionnel comme carte de contour (Figure 5B) afin d’extraire les modes spécifiques associés à une condition de pH particulière (c’est-à-dire ~pH 4 et ~pH 10). Extrayez toutes les caractéristiques spectrales améliorées pour à seulement n_pairs ou à seulement n_impairs.

Résultats

Avec la fixation de Aβ _1-40 sur la surface des particules nano-colloïdales d’or, la bande SPR autour du maximum d’absorption de 530 nm s’est significativement décalée vers le rouge à la position de pic de ~650 nm lorsque la solution a été rendue plus acide (pH 4)³⁵. Avec des images TEM, nous avons identifié que les caractéristiques spectroscopiques observées à pH 4 correspondent à la formation des agrégats de colloïdes d’or avec une conformation plausiblement dépliée et un réseau avec les monomères Aβ _1-40 dépliés environnants adsorbés sur la surface d’or³⁰. Nous avons observé que les monomères Aβ _1-40 s’inversent vers la conformation repliée dans des conditions basiques (pH 10), entraînant une déformation des agrégats de manière quasi réversible. Ce processus quasi réversible était évident à partir de l’alternance du pic de bande moyen ((n)), qui se décalait entre une longueur d’onde plus courte et une longueur d’onde plus longue, et de la morphologie dispersée par rapport à la morphologie agrégée dans les images TEM entre des conditions basiques (pH = 10) et acides (pH = 4). Il a déjà été observé qu’une partie du monomère Aβ _1-40 reste dépliée même après que la solution a été ramenée aux conditions de base³⁶. La vidéo 1 montre le changement de couleur dépendant du pH de Aβ _1-40 et du colloïde d’or nu de 20 nm.

À titre de comparaison, l’étude du pH du houblon sur un colloïde d’or nu de 20 nm a été menée (figures 5C et D). Au fur et à mesure que l’opération de changement de pH se poursuivait, elle a montré la croissance de la grappe des colloïdes d’or dans la bande SPR shoft, les images TEM ainsi que les images en lumière blanche. Il est assez intéressant de noter qu’il y avait plusieurs raies spectrales SERS en fonction de n_{pair et impair.} Par exemple, à n_pair (pH ~4), la ligne à 275 ^cm-1, qui a été attribuée comme mode associé à Au_n (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)³⁷ ou au mode Au-Cligand³⁸ a été observée de manière intensive. D’autre part, pour n_pair, à 1008 ^cm-1 C-N str a été observé³⁹ et CH₂ wag³⁹, CH₂ déformation⁴⁰ ont été largement observées à 1291 ^cm-1.

Contrairement à la morphologie d’agrégation claire dépendante du pH et réversible observée par l’imagerie en lumière blanche, il y avait des différences relativement subtiles dans les caractéristiques spectrales du spectre SERS entre n_{pair et impair.} En première approximation, la densité spectrale des raies dans la région comprise entre 250 ^cm-1 et 1750 ^cm-1 était plus élevée pour n_impair que n_pair. Les raies spectrales dans la région de l’empreinte, 1250 ^cm-1 et 1750 ^cm-1 (bandes Amide I, II et III) pour n_impaires, ont montré des caractéristiques spectrales moins résolues, impliquant soit un élargissement, soit une augmentation des densités spectrales. Dans la figure 6, une carte de contour donnée à la figure 5B (figure 6B) a été organisée avec les signaux SERS à 761 ^cm-1 (rouge) et 1395 ^cm-1 (bleu), représentant les accents à n_{pair et impair, respectivement} (figure 6C). En tant que spectre SERS représentatif de n_{pair et impair, le} spectre SERS à n = 7 (rouge) et n = 4 (bleu) est représenté en haut (figure 6A). Afin de montrer la correspondance avec le décalage de bande SPR pour l’or 20 nm revêtu d’Aβ_1-40, le graphique de décalage de bande de la figure 3 est montré sur le côté (figure 6D).

Bien que nous disposions de données préliminaires sur l’attribution complète du spectre SERS observé, nous notons ici plusieurs caractéristiques notables de décalage Raman. Les raies spectrales et (assignations plausibles) améliorées en n_impaires se trouvent principalement dans la région inférieure à 1000 ^cm-1 : 394 ^cm-1 (Trp)^41,42,43, 761 ^cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 ^cm-1 (déplacement NH indole, étirement C-C de Met)³⁹, 974 ^cm-1 (Glu, C-COO^- étirement de l’Asp, mode associé au citrate)39,48,49. Le décalage Raman amélioré à n_{a même} montré des caractéristiques spectroscopiques significatives dans la région de l’empreinte digitale (Amide I, II et III) : 1166 ^cm-1 (déformation N-H⁺ de Tyr)^39,41, 1227 ^cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 ^cm-1 (COO ^- étirement symétrique ou CH₂- CH₃- ciseaux de Glu)^39,48, 1585 ^cm-1 (étirement CC de l’anneau de Phe, étirement asymétrique du carboxylate -Au, étirement du COO^- du citrate, déformation du cycle benzénique)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ^cm-1 (Phe, Tyr, C=C étirement de Tyr, étirement CC de l’anneau en Phe, étirement du cycle benzénique et COO^- étirement en Phe et Tyr, et étirement asymétrique de OH)39,41,48,50,51, et 1628 ^{cm-1 (sous-pic} d’Amide I distinctif pour les structures intermoléculaires en feuillet β⁵³, C=O et les modes vibrationnels couplés CN/NH du squelette protéique provenant de structures parallèles de type β, accumulation de Aβ⁵⁴ agrégé, bobines aléatoires, β-tours, β-épingles^{à cheveux 48}. Les séquences apparaissant pour n_{pair ou impair sont} illustrées à la figure 7. Dans l’ensemble, pour n_{correspondant même} à l’agrégation réversible ou à la conformation dépliée de Aβ _1-40, Phe/Tyr contenant le cycle benzénique, l’étirement symétrique du mode de ciseaux COO^-, CH₂- CH₃- de Glu et la déformation -NH⁺ de Tyr ont été significativement impliqués dans le changement conformationnel du peptide. Lors du désassemblage de l’agrégation observée lorsque les peptides adoptaient la conformation plissée correspondant aux modes proéminents à n_impairs, Glu, Asp, Met, His et Ala semblaient être impliqués.

Figure 1 : L’absorbance et la morphologie dépendantes du pH. Le spectre d’absorption à pH 4 (A) et pH 10 (B) pour les nanoparticules d’or enrobées Aβ _1-40 (20 nm), ainsi que les images TEM correspondantes, les croquis de particules agrégées/dispersées et les images de solutions dans des flacons sont présentés. A est la conformation dépliée des monomères Aβ _1-40 dans des conditions acides, et B est la conformation repliée dans des conditions basiques. Des diagrammes des monomères Aβ _1-40 dans chaque conformation et morphologies d’agrégation/dispersion sont présentés à côté des images TEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Réversibilité de l’auto-assemblage dépendant de la taille nanométrique. Décalage de la position maximale moyenne de la bande SPR, , en fonction du numéro d’opération, n, pour toutes les tailles testées de particules colloïdales d’or. Les valeurs approximatives du pH et l’étape correspondante des agrégats illustrés à la figure 1 sont également indiquées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : et images TEM/lumière blanche à chaque numéro d’opération. En fonction du numéro d’opération, n, a été tracé ensemble pour Aβ _1-40 recouvert d’or 20 nm (cercles fermés) et 20 nm d’or (cercles ouverts) et est montré avec des images représentatives TEM (A et C)/lumière blanche (B et D) aux numéros d’opération sélectionnés (n = 1, 2, 3, 7 et 8 marqués par des flèches décodées) pour Aβ _1-40 recouvert d’or 20 nm (A et B) et 20 nm d’or (C et D). La police noire indique un pH de 7, la police bleue indique un pH de 4 et la police rouge indique un pH de 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Lumière blanche représentative et image Raman. L’image en lumière blanche, l’image Raman et le spectre SERS pour (A) n = 2 et (B) n = 3 ; i) image en lumière blanche dans un large champ de vision, ii) image en lumière blanche dans la zone où l’image Raman a été collectée (étiquetée par un carré rouge en i)), iii) l’image Raman de deux composants combinés, iv) l’image Raman du composant 1 et son v) le spectre SERS de iv), vi) l’image Raman du composant 2, et vii) spectre SERS de vi). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Carte des contours du spectre SERS pour n_impair, n_pair et n_tous. (A) La carte tridimensionnelle du spectre SERS dans la région de 250 ^cm-1 et 1750 ^cm-1 en fonction de n pour Aβ_1-40 recouvert d’or 20 nm avec une carte de contour illustrée en (B) en haut. (C) La carte tridimensionnelle du spectre SERS dans la région de 250 ^cm-1 et 1750 ^cm-1 en fonction de n pour 20 nm d’or, avec une carte de contour illustrée en (D) en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Carte des courbes de niveau du spectre SERS. La carte des contours du spectre SERS en fonction de n (1-10). (A) Absorbance à 1395 ^cm-1 (bleu) et 761 ^cm-1 (rouge). (B-D) Le panneau inférieur montre le spectre SERS et le panneau de droite montre l’amplitude de la variation d’intensité du signal des signaux SERS à chaque n. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Séquences notables de Aβ_1-40. Les séquences assignées pour avoir une implication significative à n_impair (correspondant à la formation de la conformation pliée) sont indiquées par des flèches rouges vers le bas, et celles assignées pour avoir une implication significative à n_pair (correspondant à la formation de la conformation dépliée) sont indiquées par des flèches bleues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Changement de couleur dépendant du pH de Aβ_1-40 et du colloïde d’or nu de 20 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

L’entretien des échantillons est un élément essentiel à prendre en compte dans les études sur la conformation des peptides, car ceux-ci se détérioreront s’ils ne sont pas stockés correctement. Les échantillons de peptides ont été reçus sous forme lyophilisée et ont commencé à se dénaturer une fois qu’ils ont été réhydratés avec de l’eau désionisée distillée, même lorsqu’ils ont été stockés à -80 °C. La pureté des colloïdes d’or a été vérifiée par une analyse de contrôle de la qualité. Afin de maintenir la stabilité des colloïdes, ils ont été stockés à 4 °C et non congelés. Les solutions de colloïdes d’or ont été préparées fraîches pour chaque expérience, car la solution tampon de sels déstabiliserait le colloïde d’or. Des solutions de HCl et de NaOH ont été préparées pour chaque expérience.

Les défis techniques liés à la lecture et à l’enregistrement manuels du pH de la solution à l’aide d’instruments délicats tout en modifiant le pH entre 4 et 10 limitent la précision de nos résultats rapportés. Ainsi, nous n’avons pas observé de résultats cohérents dans l’intensité des signaux SERS. Cela a probablement entraîné une erreur dans l’amplitude utilisée pour le tracé des courbes de niveau. Des travaux futurs visant à vérifier les modes associés à n_pair ou n_impair pourraient introduire des mutations pour substituer les acides aminés de la séquence Aβ _1-40 que nous rapportons être impliqués dans le changement de conformation de la protéine, tels que les résidus simples de tyrosine ou d’asparagine.

"L’interaction entre le monomère Aβ_1-40 et la surface de l’or est considérée comme une interaction dipolaire, et le niveau de liaison hydrogène a été supposé dans les travaux de H. Schmidbauer et ^al.55. Dans un travail séparé, nous avons étudié la spectroscopie SERS en fonction de la quantité de Aβ_1-40 dans des conditions acides, elle a extrait la formation d’adsorption dépendante de la taille nanométrique⁵⁶. Pour l’or de 20 nm, on a supposé que la liaison C=C ou -C-N de l’histidine (His) initiait l’adsorption ; pour l’or de 80 nm, cependant, un mode respiratoire en cycle benzénique de phénylalanine (Phe) ou de tyrosine (Tyr) a atteint la surface de l’or pour initier l’adsorption. Le processus d’adsorption de l’Aβ_1-40 sur la surface de l’or dans des conditions neutres ou basiques (pH ~10) a été considéré comme maintenant le colloïde d’or enrobé d’Aβ_1-40 comme étant hydrophile puisqu’aucun précipité ne s’est formé à l’état aqueux. Cependant, les précipités ont été observés à un pH de 4, ce qui implique que les agrégats étaient hydrophobes.

Les images TEM et les images en lumière blanche ne montrent qu’indirectement des preuves de l’agrégation. Nous avons tenté d’effectuer une spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) pour corréler la morphologie observée dans l’agrégation réversible avec les structures secondaires. Cependant, les lignes de base de diffusion nous ont empêchés d’obtenir des signaux CD reproductibles. Au lieu de cela, nous avons utilisé la spectroscopie Raman, en nous concentrant davantage sur les modes améliorés soit lorsque l’agrégation (conformation dépliée de Aβ_1-40) avait lieu sous pH ~4, soit lorsque la désagrégation (conformation dépliée de Aβ_1-40) sous pH ~10. Ainsi, la meilleure spéculation pour identifier la structure secondaire dans ce travail s’est limitée à la surveillance des nœuds associés aux structures secondaires. Cela a été démontré par l’observation de la feuille de β à 1628 ^cm-1, en particulier dans des conditions de pH 4.

Cette étude n’a observé que le changement de conformation peptidique pour les colloïdes d’or de 20 nm de diamètre et n’a étudié que n jusqu’à 10. Les propriétés de conformation et d’agrégation du peptide Aβ _1-40 pourraient être modifiées par la taille de la particule qu’ils adsorbent à⁵⁶. Par conséquent, des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les propriétés des peptides qui sont basés sur la mise en réseau entre les monomères et ceux qui sont affectés par les caractéristiques physiques de la surface d’adsorption. Dans les conditions que nous avons testées, seuls les colloïdes d’or de 20 nm de diamètre présentaient une réversibilité de la morphologie de l’agrégation, et les mécanismes de la façon dont le diamètre du colloïde affecte la réversibilité de cette propriété ne sont pas connus. L’augmentation de n jusqu’à 20 pourrait fournir plus d’informations sur le degré de réversibilité de la morphologie de l’agrégation dépendant du mode. Ces recherches sur la façon dont la taille du colloïde d’or affecte l’agrégation du peptide bêta-amyloïde fourniront des informations importantes sur les mécanismes moléculaires de la pathologie de la maladie d’Alzheimer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Le peptide bêta-amyloïde 1-40 (A&bêta ; 1&ndash ; 40 peptide)	r-Peptide (Bogart, GA, USA)	A-1156-2
Appareil photo numérique CCD	AMT	XR-40 4 mégapixels CCD  ;
Eau distillée désionisée du système d’eau Milli-Q- Millipore	Sigma (Burlington, MA, USA)	Milli-Q IQ 7000
Freezer -86 oC	Thermo Scientific	Revco Chilly Willy  ; Série RLE ID d’unité 187004 Numéro de build 40.04
Gold Colloid (10 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15703-20
Gold Colloid (100 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15711-22
Gold Colloid (15 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15704-20
Gold Colloid (20 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15705-20
Gold Colloid (30 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15706-21
Gold Colloid (40 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15707-21
Gold Colloid (50 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15708-21
Gold Colloid (60 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15709-22
Gold Colloid (80 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Californie, États-Unis)	15710-22
Disques en mica V1AFM de la plus haute qualité 10 mm	Ted Pella Inc.	# 1,0
N	Fluka	Lot# SHBB4705V   ;   ;   ; 318949-2L
Macro quartz quvette Trajet Lumineux 10 mm	Fire Fly Science  ;	Type1-MC-Path10mm
Micro électrode de pH	HORIBA	Modèle 9618S (MFG n° 9Y8E0050)
Peak Fit Program	Origin (Northampton, MA, USA)	OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Academic)
pH 4.00 Buffer solution  ;	VWR	Cat n° 34170-127
pH 7,00 Solution tampon	Fisher Chemical	SB107-4 Lot 191041
pH-mètre	HORIBA	Modèle F-72G (MFG n° B27M0017)
Pointes de pipette   ; Maxi Tips 1&ndash ; 5 mL	de Fisher   ;	02-707-467
Pointes de pipette 10 mL	Fisher	02-717-135
Pointes de pipette 1000 mL	Fisher	02-717-156
Pointes de pipette 1&ndash ; 200 mL	Fisher	02-717-143
Pipette Fisher Brand Elite 0,5&ndash ; 5 mL
pipette Fisher Brand Elite 100&ndash ; 1000 mL	Fisher	QU01672
Pipeter Fisher Brand Elite 10&ndash ; 100 mL	Fisher	MU10985
Pipetter Fisher Brand Elite 1&ndash ; 10 mL	Fisher	MU08178
solution d’hydroxyde de sodium 1,0 m	Fluka	Lot#05096BPV  ;   ; 319511-2L
TEM	FEI Co	Morgagni modèle 268  ;
TempAssure Tubes PCR, Bouchons plats, Naturel  ;			Tubes individuels à paroi mince de 0,2 mL avec capuchons plats givrés attachés
Spectrophotomètre UV-VIS-NIR	VARIAN	CARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Microscope Raman confocal	WITec-Oxford Instrument	XMB3000-3001