Article de méthode

Isolement et identification de souches bactériennes dans la peau d’amphibiens terrestres

DOI :

10.3791/67862

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17 juin 2025

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1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

Dans cet article

Résumé

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Il s’agit d’une méthode d’échantillonnage et d’isolement des bactéries cultivables du microbiote cutané des salamandres pléthodontidés européennes (genre Speleomantes). Ici, nous présentons un protocole pour prélever des échantillons de peau de salamandre avec des écouvillons et les traiter à l’aide d’approches cultivables. Nous décrivons l’échantillonnage, l’isolement et l’établissement d’une culture axénique avec caractérisation de la souche bactérienne.

Résumé

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Le microbiote est un élément vital des organismes supérieurs, le microbiote cutané contribuant de manière significative à la défense de l’organisme contre les agents extérieurs. Il n’existe pas de méthode standard pour échantillonner les communautés microbiennes cutanées de Speleomantes (Amphibia : Plethodontidae) pour l’approche de culture microbienne. Pour y remédier, nous avons mis au point un protocole pratique pour isoler les bactéries de la peau des individus et une pratique exemplaire pour la manipulation et le stockage des échantillons. Les étapes sont simples : les écouvillons sont stockés dans une solution saline physiologique complétée par du glycérol lors de l’échantillonnage. Une fois transférés en laboratoire, les écouvillons peuvent être conservés à +4 °C pendant un maximum de 10 jours pour garantir l’intégrité de la communauté microbienne. Cette étude offre des informations intéressantes sur l’étude du microbiote cutané des espèces d’amphibiens terrestres, telles que celles appartenant au genre Speleomantes. Cette approche contribue à la mise en œuvre, au suivi et à la conservation des espèces menacées et pourrait améliorer la connaissance du fonctionnement du microbiote dans la santé et l’écologie des amphibiens. Ce protocole peut également avoir une signification plus large pour la recherche sur le microbiome dans de nombreux scénarios de conservation de la faune.

Introduction

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Tous les organismes hébergent une variété de symbiotes microbiens sur leurs surfaces épithéliales, leurs tissus et leurs organes1. La peau est la principale interface entre l’hôte et son environnement, fournissant un habitat à divers micro-organismes2. La peau est le plus grand organe des vertébrés et agit comme une barrière contre les agressions mécaniques, chimiques et microbiennes3. Cependant, cette large exposition de la peau aux conditions environnementales en fait probablement la frontière écologique la plus critique qui médie l’interaction de l’organisme avec les facteurs biotiques et abiotiques externes4.

Le microbiote cutané des amphibiens a été étudié de manière intensive au cours de la dernière décennie, et la relation entre cette communauté microbienne et son hôte a été explorée en profondeur 5,6,7,8,9,10. La biodiversité du microbiote cutané est largement déterminée par le type d’hôte (c’est-à-dire la communauté spécifique à l’espèce), mais d’autres facteurs environnementaux peuvent favoriser une plus grande diversité interspécifique11. Le microbiote cutané des amphibiens a une composition distincte de celle des autres animaux. Il est connu que les amphibiens ont une relation mutualiste avec les microbes de leur peau, étant capables de biosynthétiser des composés antimicrobiens ou de protéger leur hôte contre les maladies infectieuses émergentes12.

L’isolement des bactéries de la peau est généralement atteint après avoir accompli différentes étapes. La première étape consiste à obtenir un prélèvement d’échantillon représentatif par écouvillonnage et à éviter la contamination externe. Les échantillons microbiens sont suspendus dans une solution saline stérile ou un tampon. La supplémentation des liquides en suspension avec des protecteurs (par exemple, du glycérol) pourrait améliorer l’intégrité de la communauté bactérienne pendant le transfert en laboratoire13,14. Une fois transférés au laboratoire, les échantillons peuvent être traités immédiatement ou après une courte période pour maintenir l’intégrité de la communauté microbienne. L’approche microbienne classique implique le traitement des échantillons par dilution en série pour réduire la densité microbienne et assurer une meilleure séparation des colonies sur les plaques de Petri. Les dilutions d’échantillons et en série sont ensuite striées sur des milieux non spécifiques et non sélectifs tels que la gélose Luria-Bertani (LBA)15, le soja tryptique (TSA)16, l’extrait de levure tryptone Agar (TYEA)17,18,19 ou le nutriment (NA)20 qui favorisent la croissance d’un large éventail de bactéries. Des enrichissements non sélectifs lors de l’échantillonnage et du traitement sont utilisés car il est nécessaire de cultiver une large gamme de microbes. Les méthodes de la traînée ou de la plaque étalée répartissent uniformément la suspension microbienne sur la surface de la gélose21. La distribution uniforme permet aux différentes espèces microbiennes présentes dans l’échantillon de former des colonies distinctes. Après une incubation à 20-37 °C pendant 2 à 7 jours, les colonies microbiennes sont comptées et distinguées en fonction de leur morphologie. La caractérisation morphologique de la colonie bactérienne a été effectuée sur la base de la pigmentation, de la forme, de l’élévation, de la marge, de l’opacité et de la surface. Les colonies bien isolées aux dilutions les plus élevées sont sous-cultivées sur des plaques de gélose fraîche pour purifier les cultures microbiennes. La pureté des colonies est assurée sur la base de l’uniformité cellulaire et de l’affinité pour la coloration de Gram. Plusieurs tests biochimiques ou moléculaires peuvent également être effectués pour vérifier la pureté des colonies22. Les cultures pures de souches isolées peuvent être stockées soit sur des gélose inclinées à 4 °C pour une utilisation à court terme, soit conservées à long terme à -80 °C dans des cryoprotecteurs (par exemple, un rapport glycérol/moyen de 20:80 ou 50:50)23.

Dans ce protocole, nous rapportons les meilleures pratiques pour isoler les bactéries du microbiote cutané des salamandres des cavernes de Speleomantes , des amphibiens strictement terrestres qui peuvent vivre à la fois dans des environnements de surface et souterrains24. Compte tenu de l’absence de protocoles universellement appliqués dans la littérature, cette étude visait à développer une bonne pratique pour l’échantillonnage et la conservation d’échantillons de microbiote cutané de ces amphibiens terrestres. Pour tester ce protocole, nous avons utilisé la salamandre des cavernes italienne (Speleomantes italicus) comme modèle, en échantillonnant 12 individus d’une population de grottes située dans les Abruzzes (Italie). Les individus ont été prélevés à la main et frottés à plusieurs reprises (au moins 5 fois) sur leurs côtés dorsal, ventral et flanc. Les écouvillons utilisés ont été trempés dans de l’eau distillée stérile. Les écouvillons ont ensuite été immergés dans une solution saline physiologique à 0,9 % avec et sans supplémentation en glycérol. Lors du transfert au laboratoire, la conservation de l’échantillon a été testée dans diverses conditions : température ambiante non contrôlée, 4 °C et -20 °C pendant 10 jours. Les communautés microbiennes cultivables ont été comparées à l’aide de méthodes basées sur des cultures sur des milieux génériques et semi-sélectifs (LBA, TSYEA, TSA, NA).

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Protocole

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Ce protocole présente les meilleures pratiques pour l’obtention et la manipulation d’échantillons de peau de Speleomantes pour une approche microbiologique cultivable d’isolement des souches bactériennes. Les matériaux utiles dans les étapes suivantes sont répertoriés dans la table des matériaux. Le protocole suit les directives de soins aux animaux de l’article 11 du DPR 357/97 sur autorisation du ministère italien de l’Environnement (PNM 74554 du 22/04/2024).

1. Préparation des supports

  1. Calculez et pesez la quantité d’ingrédients en poudre (voir les instructions du fabricant pour la quantité de poudre utilisée pour LBA, TSYEA, TSA, NA ou d’autres milieux).
  2. Suivez les instructions du fabricant pour dissoudre les ingrédients dans de l’eau distillée. Selon le milieu et le produit acheté, des étapes d’ébullition peuvent être nécessaires.
  3. Amenez le milieu au volume final lorsque les ingrédients se dissolvent complètement et contrôlez le pH. Si la valeur est supérieure ou inférieure à celle prévue, ajustez-la à l’aide des solutions suggérées dans les instructions du fabricant. Les solutions HCl et NaOH sont couramment utilisées pour diminuer et augmenter le pH, respectivement.
  4. Ajouter la gélose (2 % p/v), chauffer jusqu’à 95 °C et faire bouillir pendant environ 1 minute pour dissoudre la gélose avant l’autoclave.
  5. Stérilisez le milieu à l’autoclave, en suivant les instructions du fabricant. Les procédés d’autoclave courants incluent 121-134 °C pour un traitement de 15 à 30 minutes.
  6. Après l’autoclavage, refroidissez le milieu gélosé à environ 45-50°C et versez-le dans des boîtes de Pétri stériles sous une hotte à flux laminaire préalablement stérilisée
  7. Après solidification, étiquetez les plaques en fonction du type de fluide et de la date de préparation.

2. Prélèvement d’échantillons

  1. Rincez la peau de la salamandre (genre Speleomantes) dans de l’eau distillée stérile pour éliminer les communautés microbiennes transitoires.
  2. Prélevez des écouvillons cutanés d’amphibiens à l’aide d’écouvillons stériles en coton dans un tube à essai. Frottez doucement les écouvillons sur la surface de la peau pour prélever des échantillons microbiens sans nuire à l’individu.
    1. Passez cinq fois un écouvillon imbibé d’eau distillée stérile de chaque côté de l’ensemble du corps, y compris toutes les extrémités (cinq mouvements de va-et-vient) pour prélever des échantillons sur les individus.
      REMARQUE : La supplémentation avec des additifs n’est pas recommandée car elle pourrait nuire aux individus.
    2. Placez les écouvillons dans des tubes contenant une solution saline physiologique (0,9 % de NaCl) complétée par du glycérol (20 %).
  3. Mélangez l’échantillon avec la solution, en poussant l’écouvillon vers les parois du tube tout en pressant le tube et en tournant l’écouvillon à fond (10 fois dans le sens des aiguilles d’une montre et 10 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre).
  4. Après le mélange, fermez l’écouvillon à l’intérieur du tube et transférez les échantillons microbiologiques au laboratoire, en maintenant l’échantillon à 4 °C jusqu’à l’analyse microbienne.
    REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’aide d’un nouveau matériau stérile et de gants pour chaque individu afin d’éviter la contamination et l’exposition de l’opérateur à des contaminants biologiques et chimiques.

3. Inoculation et incubation

  1. Mélangez soigneusement l’échantillon microbiologique avant le traitement.
  2. Préparez des dilutions en série de l’échantillon cutané avec une solution saline (0,9 % de NaCl), allant de 10-1 à 10-6.
  3. Inoculer 100 μL d’échantillon tel quel et de dilutions en série sur les plaques de gélose préparées. À l’aide d’une boucle stérile en forme de L, étalez l’échantillon sur la surface du milieu gélosée, en le répartissant uniformément sans appliquer de pression excessive pour éviter d’endommager la gélose.
  4. Retournez les plaques inoculées dans un incubateur à 20-25 °C pendant 3 à 5 jours. Cette plage de température est favorable à la croissance de nombreuses bactéries mésophiles et psychotropes environnementales qui habitent la peau des amphibiens.
    REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’aide d’un matériau stérile sous un capuchon laminaire préalablement stérilisé. Cinq répétitions indépendantes sont préparées pour chaque unité expérimentale. Étant donné que la densité de départ est inconnue et imprévisible, il est toujours utile d’inclure une large gamme de dilutions.

4. Purification et identification de la souche

  1. Sélectionner des colonies bactériennes avec des morphologies distinctes pour une analyse plus approfondie après l’incubation.
    1. Tout d’abord, choisissez des colonies bien isolées pour éviter la contamination ou le chevauchement et évitez les zones surpeuplées où les colonies pourraient fusionner. De plus, choisissez des colonies ayant des apparences différentes (par exemple, couleur, taille, forme, bord, surface ou texture) pour assurer l’échantillonnage d’espèces ou de souches potentiellement différentes.
      REMARQUE : Cette étape est cruciale pour sélectionner les différentes souches bactériennes cultivables du microbiote cutané.
  2. Sous-culture les colonies sélectionnées.
    1. Transférez une colonie bien isolée de la plaque de gélose d’origine de manière aseptique dans une plaque de gélose fraîche à l’aide d’une boucle d’inoculation. Striez la colonie pour l’isoler, puis incubez-la de manière appropriée.
    2. Répétez cette étape plusieurs fois sur des plaques de gélose fraîche pour obtenir des cultures pures de chaque isolat bactérien jusqu’à ce que les colonies isolées semblent similaires. Répéter la sous-culture à l’aide de milieux sélectifs et génériques.
      REMARQUE : La combinaison de la manipulation aseptique, de l’examen visuel et microscopique et de l’identification moléculaire garantit une souche sans contamination.
  3. Vérifiez la pureté des cultures microbiennes par des observations microscopiques (objectifs 5x à 100x), l’affinité de coloration de Gram (fixation des colonies, coloration et observation) et des tests biochimiques (par exemple, catalase, oxydase, uréase et test de fermentation du sucre)21,25.
    REMARQUE : Les cultures pures doivent présenter une morphologie de colonie uniforme, des caractéristiques microscopiques constantes et des traits biochimiques.
  4. Effectuer l’identification moléculaire.
    1. Extrayez l’ADN de colonies bactériennes purifiées et effectuez le séquençage du gène de l’ARNr 16S pour identifier l’espèce bactérienne. Effectuez une amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S à l’aide d’amorces universelles bactériennes, suivie d’un séquençage et d’une comparaison avec des séquences connues dans des bases de données telles que GenBank26.
  5. Établir des cultures de biobanques.
    1. Testez la stérilité des cultures axéniques (ou pures) en les inoculant dans un milieu non sélectif et en vérifiant l’absence de croissance de contaminants. Conservez les cultures axéniques pour une utilisation à moyen et à long terme.
      REMARQUE : Les méthodes normalisées comprennent le striage des colonies sur des pentes de gélose du milieu sélectif et le stockage à température ambiante, la suspension de la culture dans des solutions mères préparées avec un mélange de milieu sélectif et de glycérol (20:80 ou 50:50), ou la lyophilisation de la culture en bouillon (lyophilisation) et la congélation à -80 °C.

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Résultats

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Le flux de travail de l’approche expérimentale est illustré à la figure 1.

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Figure 1 : Déroulement de l’échantillonnage, de la manipulation et du traitement des échantillons de peau d’amphibiens. Veuille...

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Discussion

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Nous avons développé un protocole de bonnes pratiques pour obtenir une communauté de bactéries cultivables à partir du microbiote cutané des amphibiens et l’avons démontré sur Speleomantes italicus. Comme démontré dans l’application ci-dessus, plusieurs étapes doivent être prises pour assurer une isolation microbienne réussie de la peau des amphibiens. La collecte, à l’aide d’une technique d’écouvillonnage doux et de matériaux stériles, est très importante pour recueill...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous reconnaissons le soutien financier de l’Université de L’Aquila dans le cadre des projets « Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ : Ecotoxicology of the endangered European cave salamanders » et « Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35 » de Biodiversa+, le partenariat européen pour la biodiversité, dans le cadre du projet Sub-BioMon - Développer et tester des approches pour surveiller la biodiversité souterraine dans le karst dans le cadre du Appel conjoint BiodivMon 2022-2023 et Plan national pour la reprise et la résilience (PNRR), Mission 4, Composante 2, Investissement 1.1, Appel d’offres n° 1409 publié le 14.9.2022 par le ministère italien de l’Université et de la Recherche (MUR), financé par l’Union européenne - NextGenerationEU- Code du projet : P2022CYF9L, Titre du projet Les espèces de grottes facultatives sont-elles des moteurs de contaminants métalliques dans les environnements souterrains ? (METALCAVE) - COUPE E53D23015380001.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lagar-Bertani agarMerk MilliporeL3027
Gélose de soja tryptiqueMerk Millipore22091
Tryptone Extrait de levure de soja AgarMerk Millipore17221
Gélose nutritiveMerk Millipore70148
Solution de glycérolMerk Millipore49781

Références

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Mots-clés

Microbiote cutan des amphibiensIsolement bact rienCommunaut microbienneDilution en s rieBo tes de PetriConservation dans du glyc rol salinMorphologie des coloniesBact ries m sophilesViabilit microbienneMicrobiome de la faune sauvage

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