Article de méthode

Analyse des sous-populations plaquettaires par cytométrie en flux multicolore

DOI :

10.3791/67878

⸱

10 juin 2025

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cytométrie en flux multicolore pour les plaquettes permet d’identifier de nouveaux sous-types de plaquettes au sein des sous-populations de plaquettes classiques, telles que les plaquettes au repos, agrégées, procoagulantes et apoptotiques. Cela permet de comparer différents modèles de sous-populations induits par divers agonistes plaquettaires. Ici, une procédure d’établissement d’un panel de cytométrie en flux multicolore est décrite en détail.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les plaquettes, ou thrombocytes, sont de petites cellules sanguines anulcléées qui jouent un rôle crucial dans l’hémostase et la thrombose. Les défauts des fonctions plaquettaires peuvent provoquer des saignements ou des événements thrombotiques chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires. Par conséquent, il est important de caractériser phénotypiquement les plaquettes pour pouvoir attribuer des sous-populations de plaquettes à la fonction plaquettaire. La stimulation des plaquettes humaines avec des agonistes et des activateurs plaquettaires induit des changements morphologiques et physiologiques dans les plaquettes, accompagnés de changements dans la population de récepteurs de surface. Cela conduit à des sous-populations plaquettaires fonctionnellement diversifiées. Les sous-populations plaquettaires classiquement définies sont les plaquettes au repos, agrégées, procoagulantes et apoptotiques. Pour caractériser l’effet des agonistes sur les sous-types plaquettaires, nous avons établi un test utilisant la cytométrie en flux multicolore composée de 10 anticorps et colorants différents (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrineαIIbβ3 (clone : PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexine V, Zombie NIR). Des plaquettes humaines isolées ont été incubées avec des agonistes plaquettaires et colorées avec des anticorps et des colorants spécifiques conjugués aux fluorophores. Ensuite, ils ont été mesurés par cytométrie en flux. Cela nous permet de définir des sous-types spécifiques aux agonistes au sein des quatre sous-populations classiques. En conclusion, la combinaison de marqueurs d’activation (anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntégrineαIIbβ3 (clone : PAC-1)), de marqueurs inflammatoires (anti-CXCR4, anti-ACKR3) et de marqueurs apoptotiques (Annexine V, Zombie NIR) qui composent le panel de cytométrie en flux 10 couleurs décrit dans ce manuscrit ouvre la possibilité de définir d’autres sous-types plaquettaires qui pourraient être liés à une fonction plaquettaire spécifique. Cette méthode peut être appliquée dans la recherche fondamentale sur la fonction plaquettaire et la physiologie, ainsi que dans la définition de nouveaux sous-types de plaquettes dans des modèles de maladies et des études sur des patients.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les thrombocytes, également appelés plaquettes, sont de petites cellules sanguines sans noyau essentielles à l’hémostase et au développement de la thrombose 1,2. Ils peuvent être activés par divers agonistes plaquettaires. Les agonistes plaquettaires physiologiques classiques sont l’adénosine diphosphate (ADP), qui se lie aux récepteurs P2Y12 et P2Y1, la thrombine qui active les plaquettes par le biais des récepteurs PAR1 et PAR4, et le collagène qui interagit avec la glycoprotéine VI. Le collagène peut être substitué dans des expériences in vitro par le peptide lié au collagène (CRP-XL)3,4. Récemment, il a été démontré que l’hémine induit l’activation plaquettaire par l’interaction du récepteur de type lectine de type C (CLEC-2) et de la glycoprotéine VI (GPVI), établissant ainsi que l’hémine est un nouvel activateur/agoniste plaquettaire endogène 5,6. Plusieurs situations pathologiques peuvent conduire à l’hémolyse, entraînant la libération d’hémine libre contenant du fer ferrique. Tous ces agonistes plaquettaires modifient l’expression des récepteurs de surface sur les plaquettes. L’altération des récepteurs de surface et de la membrane plasmique dépend de la force et de la concentration de l’agoniste plaquettaire 7,8,9. Par conséquent, il est important de caractériser phénotypiquement les plaquettes pour pouvoir attribuer des sous-populations de plaquettes à la fonction plaquettaire.

Des méthodes de grande dimension, telles que la cytométrie en flux, ont révélé que les plaquettes forment des sous-populations aux fonctions distinctes. Les sous-populations peuvent être classées à l’aide de différents marqueurs de surface. Dans la littérature, il est bien connu que deux sous-populations plaquettaires distinctes sont présentes : le procoagulant, qui se caractérise par l’externalisation de la phosphatidylsérine, et le phénotype agrégatif qui active l’intégrineα IIIbβ3. En plus des marqueurs d’activation classiques, les colorants de fluorescence tels que le glutathion-S-Aryloxyde (GSAO) qui détecte la fonction mitochondriale et le stress oxydatif peuvent être utilisés pour une catégorisation plus poussée, par exemple, les plaquettes procoagulantes selon leur état métabolique10. Cela permet de faire une distinction entre le ballonnement et le phénotype11 des plaquettes procoagulantes de la perméabilité mitochondriale (MPTP).

Heemskerk et al. ont montré, en analysant l’exposition à la phosphatidylsérine (PS) et l’activité de l’intégrineα IIbβ3, que différentes populations de plaquettes peuvent contrôler des étapes de coagulation distinctes et que des activateurs puissants tels que la thrombine et le collagène sont nécessaires pour l’exposition à la phosphatidylsérine12. De plus, l’activation des plaquettes par GPVI avec du collagène ou l’agoniste spécifique de GPVI convulxin est principalement responsable de la formation de plaquettes procoagulantes adhérentes. De même, l’acide arachidonique, qui conduit à l’activation plaquettaire en produisant du thromboxane A2 par la cyclooxygénase, induit une exposition à la PS13. Cependant, l’acide arachidonique est, par rapport à la thrombine ou au collagène, un faible activateur plaquettaire14. Van Velzen et al. ont également évalué les antigènes de surface plaquettaire (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) et les marqueurs d’activation (PAC-1, CD63, CD62P) dans deux mesures distinctes15. De plus, van Velzen et al. ont pu analyser le sang de patients atteints de thrombasthénie et comparer les sous-populations entre les patients sains et malades. Hindle et al. ont mesuré l’influence de la prostacycline sur les sous-populations plaquettaires après un traitement par thrombine et CRP-XL avec deux panels individuels composés de quatre marqueurs chacun (PAC-1, Annexine V, CD62P, CD42b ou CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. Récemment, la cytométrie en flux multicolore a été utilisée pour définir lessous-populations plaquettaires procoagulantes au repos (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Annexine V-), agrégées (CD42b+, PAC1+, Annexine V-), procoagulantes (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Annexine V+) et apoptotiques (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Annexine V+) 7,17. Laspa et al. ont étendu/affiné l’approche de cytométrie en flux multicolore par l’ajout d’anticorps contre les récepteurs de chimiokines CXCR4 et ACKR318. Sur la base de la littérature disponible, il s’agit du premier panel de cytométries en flux 10 couleurs pour les plaquettes humaines isolées qui permet la détection de 10 antigènes différents sur une plaquette individuelle (au niveau de la cellule unique) au sein d’une population de plaquettes humaines isolées dans un seul tube. Par conséquent, il est possible de mesurer simultanément le potentiel d’activation, d’adhésion et d’agrégation, les récepteurs de chimiokines et le potentiel apoptotique d’une seule cellule pour distinguer davantage la sous-population existante. Ainsi, il complète Johnson et al., qui ont défini les quatre principales sous-populations avec quatre marqueurs (au repos, procoagulant, agrégé, apoptotique)17. Ainsi, la mise en place d’un test de cytométrie en flux multicolore permet de comparer différents agonistes plaquettaires en ce qui concerne leur schéma d’activation et la formation de sous-types plaquettaires au sein de sous-populations plaquettaires classiques.

La méthode peut être utilisée pour la recherche fondamentale concernant l’analyse de la fonction plaquettaire et de la physiologie. De plus, le test de cytométrie en flux multicolore établi pour les plaquettes humaines peut être réalisé avec des plaquettes obtenues dans le cadre d’études sur des patients, par exemple, dans le cadre de recherches sur les maladies cardiovasculaires et les événements thrombotiques, afin de décoder les sous-populations plaquettaires induites par ces maladies et les effets des traitements sur ces phénotypes induits. Par exemple, Mueller et al. ont montré que les sous-populations de plaquettes peuvent différer chez les patients atteints de sténose aortique19. Les connaissances acquises pourraient offrir de nouvelles opportunités pour les interventions pharmaceutiques.

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Protocole

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La collecte et la manipulation de sang à des fins de recherche ont été approuvées par le comité d’éthique de la faculté de médecine de l’université Eberhard Karls et de l’hôpital universitaire de Tübingen (vote éthique 238/2018B02), et les méthodologies d’étude ont été conformes aux normes établies par la déclaration d’Helsinki. Les donneurs sains ont donné leur consentement éclairé écrit pour le prélèvement sanguin. Les caractéristiques de base des donneurs en bonne santé sont énumérées dans le tableau 1. La figure 1 donne un aperçu du protocole de cytométrie en flux.

1. Isolement des plaquettes humaines dans le sang total

REMARQUE : Les lignes directrices de l’ISTH ont été suivies en ce qui concerne le prélèvement d’échantillons, les garrots et le choix de l’anticoagulant afin d’assurer une manière normalisée d’isoler les plaquettes20.

  1. Préparation du tampon
    1. Tampon anticoagulant acide-citrate-dextrose (ACD) : Dissoudre 12,50 g deNa 3-Citrat (85 mM C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6,82 g de citrate acide (71 mM) et 10,00 g de glucose (111 mM) dans 475 mL d’aqua destillata. Ajustez le pH avec 1 M de NaOH à 4,69. Remplissez jusqu’à 500 ml d’aqua destillata. Ensuite, filtrez, stérilisez le tampon et conservez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Toutes les solutions sont stérilisées par filtre à l’aide d’un système de filtration sous vide, qui utilise une membrane en polyéther sulfone à débit rapide de 0,22 μm.
    2. Tampon Tyrode (10x) : Peser 80,00 g de NaCl, 10,15 g de NaHCO3 et 1,95 g de KCl et ajouter de l’aqua destillata à 1 L. Filtrer, stériliser le tampon et le conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
    3. Tampon Tyrode’s-HEPES (1x ; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 5 mM de glucose, 10 mM HEPES) : Mélanger 10 mL de 10x tampon Tyrode et 90 mL d’aqua destillata. Dissoudre 0,1 g de glucose et 0,1 g d’albumine sérique bovine (BSA). Ajustez le pH avec l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) à 7,4. Réglez 10 ml de tampon Tyrode à pH 7,4 et ajustez le pH des 90 ml résiduels de Tyrode à 7,4 avec 1 N HCl à pH 6,5.
      REMARQUE : BSA pourrait récupérer certains produits chimiques, tels que l’hémine. Dans ce cas, il est important de préparer le tampon 1x Tyrode sans BSA. Tous les tampons doivent se réchauffer à température ambiante ou à 37 °C avant utilisation.
  2. Prélèvement d’échantillons de sang
    1. Préparez pour chaque donneur une seringue de 10 ml avec 2 ml d’anticoagulant ACD et laissez-la s’ajuster à la température ambiante ou à 37 °C à l’aide d’un incubateur. Conservez le facteur de dilution de 1:5 (ACD : sang).
      REMARQUE : Utilisez des seringues plus petites ou plus grandes pour prélever des échantillons de sang. Un tampon ACD froid pourrait pré-activer les plaquettes et altérer vos résultats.
    2. À l’aide d’une aiguille papillon (21G), recueillir lentement le sang du donneur dans les seringues ACD préchauffées. Ouvrez le tuyau du garrot avant de remplir la seringue pour éviter la pré-activation.
      REMARQUE : Les seringues avec une aiguille de plus gros calibre peuvent minimiser l’activation des plaquettes induite par le cisaillement.
    3. Transférez lentement le sang ACD dans un tube de réaction de 15 ml. Utilisez le sang immédiatement pour éviter la pré-activation des plaquettes.
  3. Isolement plaquettaire
    1. Centrifuger le sang ACD pendant 20 min à 209 x g (température ambiante, RT) sans freins. Préparez 25 mL de tampon Tyrode-HEPES pH 6,5 dans un tube de réaction de 50 mL.
    2. Transférez doucement le plasma riche en plaquettes obtenu (PRP, couche supérieure) dans le tube de réaction de 50 ml contenant le tampon Tyrode-HEPES, pH 6,5.
    3. Laissez environ 1 ml de PRP au-dessus de la couche leucocytaire et des érythrocytes pour éviter la contamination par d’autres cellules sanguines.
    4. Centrifuger la suspension à 430 x g pendant 10 min à RT pour granuler les plaquettes. Remettez soigneusement en suspension la pastille obtenue dans 200 à 300 μL de tampon Tyrode, pH 7,4.
    5. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer la numération plaquettaire. Ajustez la numération plaquettaire avec le tampon HEPES de Tyrode pH 7,4 à 200 x 103 plaquettes/μL. Voir l’étape 3 pour un traitement ultérieur de la coloration plaquettaire.

2. Sélection et titrage des anticorps pour la cytométrie en flux

  1. Sélection d’anticorps et de colorants
    1. Sélectionnez les anticorps et les colorants avec des fluorophores appropriés pour le cytomètreen flux 21. Notez la configuration du filtre recommandée par le fabricant du cytomètre en flux. Un exemple de configuration des marqueurs plaquettaires et des fluorophores est donné dans le tableau 2 et la figure 2 pour le cytomètre suivant : BD LSR Fortessa avec configuration laser : violet (402 nm), bleu (488 nm), jaune/vert (561 nm), rouge (640 nm).
      REMARQUE : Utilisez des fluorochromes plus brillants pour les antigènes moins exprimés. Par exemple, les fluorochromes brillants BV412 et BV650 ont été utilisés pour les récepteurs de chimiokines faiblement exprimés (ACKR3 et CXCR4)22,23,24.
  2. Titrage des anticorps et des colorants
    1. Titrez les anticorps pour trouver la bonne concentration de travail. Pour le titrage, utilisez des plaquettes humaines isolées de l’étape 1 et une série de concentrations de l’anticorps.
      REMARQUE : Les concentrations de travail indiquées par le fabricant sont généralement un bon point de départ pour la série de concentrations.
      1. Si vous travaillez avec des antigènes qui ne sont exprimés que sous traitement, activez les plaquettes avant la coloration pour vous assurer que les cellules négatives et positives peuvent également être détectées. Par exemple, PAC-1 ne se lie qu’à l’intégrine activée αIIbβ3. Par conséquent, activez fortement les plaquettes pour obtenir un signal lumineux et positif, par exemple avec 10 μg/mL de peptide lié au collagène (CRP ; voir Figure 3).
  3. Titrage des échantillons
    1. Isolez les plaquettes humaines comme à l’étape 1 et ajustez le nombre de plaquettes à 1 x 106 plaquettes par échantillon.
      1. Pour les récepteurs qui n’ont pas besoin d’être activés avant la coloration : CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 utiliser un échantillon non coloré et un échantillon coloré par anticorps. Pour les récepteurs/marqueurs qui doivent être activés avec, par exemple, 10 μg/mL de CRP-XL avant la coloration : PAC1, CD63, CD62P, Annexine V, Zombie NIR, utiliser un échantillon activé et un échantillon non activé 15,25,26.
    2. Activer les plaquettes (1 x 10,6 plaquettes par échantillon) si nécessaire pendant 30 min avec 10 μg/mL DE CRP-XL. Ensuite, incubez les plaquettes isolées (1 x 106 plaquettes par échantillon) pendant 30 min avec différentes concentrations de l’anticorps ou du colorant conjugué au fluorochrome et ajoutez 300 μL de 1x tampon de liaison à l’annexine pour diluer l’échantillon (des exemples de concentrations sont donnés dans le tableau 3).
    3. Mesurez 10 000 événements pour chaque échantillon.
    4. Calculez l’indice de coloration qui montre la séparation optimale des populations positives et négatives pour chaque anticorps, comme le montre la figure supplémentaire 1.
    5. Tracez l’indice de coloration pour chaque concentration d’anticorps afin de trouver la concentration optimale.

3. Coloration pour la cytométrie en flux

REMARQUE : Voir le tableau 4 pour un exemple de coloration avec quatre activateurs plaquettaires différents (CRP-XL, ADP, thrombine, hémine).

  1. L’hémine doit être préparée fraîchement. Dissoudre la poudre dans 1,4 M de NaOH dans une solution de 3 M et la chauffer à 96 °C pendant 5 min à 450 tr/min. Ensuite, diluez-le avec du H2O distillé dans une solution mère de 3 mM.
  2. Après ajustement de la numération plaquettaire (par échantillon : 1 x 106 plaquettes), activez les plaquettes dans un tube avec les activateurs plaquettaires pendant 30 min à RT comme indiqué dans le tableau 4.
  3. Ajoutez 43,3 μL de cocktail d’anticorps aux échantillons et incubez les plaquettes pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
  4. Après l’incubation, diluer les échantillons avec 300 μL de 1x tampon de liaison à l’annexine (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) afin que la protéine Annexine V puisse se lier à la phosphatidylsérine sur la face externe de la membrane cellulaire. Mesurez les échantillons immédiatement.
    REMARQUE : Mesurez les échantillons immédiatement après la préparation. Comme les échantillons ne sont pas fixes, le retard dans la préparation et la mesure des échantillons peut augmenter la variabilité des résultats. La fixation altère la liaison de l’Annexine V.

4. Configuration de la compensation et mesure de la fluorescence moins un contrôle (FMO)

REMARQUE : Avant d’enregistrer des données, exécutez une configuration de compensation. Un cytomètre en flux calcule automatiquement les paramètres de compensation ; Reportez-vous aux manuels habituels du cytomètre en flux pour la procédure de compensation particulière. Néanmoins, utilisez des contrôles de compensation soit avec des cellules, soit avec des billes.

  1. Configuration de la rémunération
    1. Pour compenser avec des billes, préparez 150 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour chaque fluorophore avec une goutte de billes et 1 μL de l’anticorps conjugué à la fluorescence.
    2. Surveiller la réactivité des perles de l’espèce. Utilisez des IgGκ anti-souris et le contrôle négatif des microparticules de polystyrène. Pour compenser la présence d’Annexine V, étiquetez les billes de PE/Cy7 avec l’anticorps PE/Cy7 anti-humain CD62L qui conjugue le même fluorophore que l’Annexine V.
    3. Utilisez des billes de compensation réactives aux amines pour le colorant réactif aux amines. Utilisez deux gouttes de perles positives et une goutte de perles négatives dans 150 μL de PBS avec 1 μL de colorant. Vérifiez que les billes de compensation réactives aux amines réagissent avec le colorant et montrent un signal positif. Vérifiez que les billes négatives ne réagissent pas avec le colorant réactif aux amines et présentent un signal négatif.
      REMARQUE : Pour Zombie NIR APC-Cy7, utilisez des billes réactives aux amines négatives et positives.
    4. Incuber les échantillons de compensation pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
    5. Faites fonctionner chaque tube de compensation séparément et enregistrez la population de billes singulet sur la base du FSC et du SSC. La population de billes apparaît comme une petite population concentrée. Dessinez une barrière autour de cette population.
    6. Affichez les histogrammes de chaque tube de compensation et ajustez les valeurs de compensation jusqu’à ce que les pics positifs des différents anticorps et colorants ne se chevauchent pas. Ensuite, mesurez chaque tube de compensation et laissez le débordement des fluorophores être calculé conformément aux SOP du fabricant.
    7. Passez à l’expérience de coloration réelle avec les plaquettes humaines isolées (voir l’étape 3 et le tableau 4). Ajustez la tension SSC/FSC avant la mesure pour trouver la population de plaquettes. Étant donné que CD61 est exprimé de manière ubiquitaire sur les plaquettes, vérifiez avec ce seuil de fluorescence si toutes les tailles de plaquettes peuvent être détectées.
    8. Ensuite, mesurez 20 000 événements par échantillon.
  2. Mesure FMO
    1. Préparez pour chaque marqueur une commande FMO conformément au tableau 5. Afin de pouvoir déterminer les chevauchements de tous les marqueurs, préparez des échantillons non stimulés et stimulés.

5. Analyse des données

  1. Analyse à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux (Figure 4)
    1. Faites glisser et déposez les fichiers FSC dans le logiciel. Définissez avec le contrôle FMO la population positive pour chaque marqueur.
      1. Déterminez les FMO en traçant chaque contrôle FMO par rapport à chaque marqueur dans un graphique à points. Cela rend le débordement visible dans d’autres canaux. Utilisez la porte FMO avec le débordement de fluorescence le plus élevé comme limite à la population positive pour les échantillons 10 couleurs traités.
  2. Analyse à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux basée sur les nuages (Figure 5)
    1. Ouvrez le logiciel et créez un nouvel ensemble de données. Glissez-déposez les fichiers FCS acquis avec le cytomètre en flux.
    2. Démarrez l’analyse en créant un workflow. La matrice de compensation est automatiquement créée à partir des fichiers de données brutes.
    3. Exécutez une analyse UMAP avec les paramètres suivants : Voisins : 15, Distance minimale : 0,4 ; Composants : 2 ; Métrique : euclidienne ; Taux d’apprentissage : 1 ; Époques : 200 ; Initialisation de l’intégration : spectrale. Sélectionnez tous les fichiers et les 10 marqueurs (fonctionnalités).
    4. Ajoutez l’analyse Phenopraph en tant que nouvelle tâche et exécutez l’analyse avec les paramètres suivants : K Voisins les plus proches : 20 ; Distance métrique : euclidienne ; Louvain Runs : 1 ; Nombre de résultats : 1.
    5. Ajoutez une tâche de contrôle pour indiquer les clusters générés. Après avoir exécuté l’analyse, il est possible de présenter les données dans différents transferts, qui peuvent être exportés.

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Résultats

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Il existe deux options pour analyser les données brutes collectées par un panel de cytométrie en flux multicolore. Une option consiste à l’analyser manuellement avec le logiciel d’analyse (Figure 3 et Figure 4). Par conséquent, les données brutes doivent être glissées et déposées dans la fenêtre du logiciel. Tout d’abord, les cellules doivent être trouvées en ajustant l’échelle SSC/FSC dans le mode d’affichage du nuage de points pour montrer la population plaque...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cytométrie en flux multicolore permet de définir des grappes/sous-populations plaquettaires distinctes associées à des fonctions discrètes 12,17,18. La qualité des plaquettes humaines isolées est décisive pour les résultats des sous-populations et l’expression à la surface des récepteurs. Par conséquent, une étape clé du protocole présenté est la préparation des plaquettes. Ils doivent être i...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le projet a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) - Numéro de projet 335549539 - GRK 2381.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x tampon de liaison  ;   ;Invitrogen,
Carlsbad, Californie, États-Unis		88-8103-74Tampon  ;
Adénosine diphosphate (ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Allemagne  ;   ;		70212agoniste plaquettaire  ;
Annexine V PE-Cyanine7Invitrogen,
Carlsbad, Californie, États-Unis		88-8103-74colorant  ;
anti-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, États-Unis		303728anticorps  ;
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, États-Unis		303727anticorps  ;
anti-CD42b PerCP/Cyanine5.5  ;BioLegend,
San Diego, CA, États-Unis		303918anticorps  ;
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, États-Unis  ;		744382anticorps  ;
anti-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, Californie, États-Unis		IM1759Uanticorps  ;
anti-CD63 PE/Cy5  ;Abcam,
Cambrigde, Royaume-Uni		anticorps ab 234251
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, États-Unis		740599anticorps  ;
anti-CXCR7 BV421  ;BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, États-Unis.		566234anticorps  ;
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, États-Unis		340507anticorps  ;
Albumine sérique bovine (BSA)Applichem,
Darmstadt, Allemagne		A1391-Acide
nitrit  ;Carl Roth,
Karlsruhe, Allemagne		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Royaume-Uni		Agoniste plaquettaireCRP-XL
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, États-Unis		G7528-DUBecco
' s Phosphate salin tamponné (PBS)Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA		D8537-Hemin
  ;Sigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, États-Unis		H9039-10Gagoniste plaquettaire  ;
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Allemagne		9105.3-Chlorurede
potassium  ;Carl Roth,
Karlsruhe, Allemagne		6781.3-Chlorure
de sodium  ;Carl Roth,
Karlsruhe, Allemagne		3957.1-Hydrogénocarbonate
de sodium  ;   ;Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, États-Unis
401676-Thrombin  ;Roche ;10602400001agoniste plaquettaire  ;
citrate-dihydrat trisodique  ;Applichem,
Darmstadt, Allemagne		1416551211-Zombie
NIRBioLegend,
San Diego, CA, États-Unis		423105colorant réactif aux amines  ;
  ;

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  4. Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
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