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Article de méthode

Un protocole robuste et reproductible pour la génération d’organoïdes par tube neural à partir de cellules souches embryonnaires de souris uniques

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DOI :

10.3791/67883

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19 décembre 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Dans cet article

Résumé

Les organoïdes du tube neural tridimensionnel (NTO) dérivés de cellules souches embryonnaires de souris sont des outils précieux pour étudier le système nerveux central au début du développement. Ici, une démonstration étape par étape d’un protocole optimisé pour la culture des NTO in vitro, fournissant des conditions de culture stables et des stratégies de dépannage pour une génération fiable et reproductible de NTO est présentée.

Résumé

Le développement des mammifères est un processus très complexe, caractérisé par la nécessité d’une signalisation précise dépendante de la concentration et du temps pour une formation correcte des motifs et une morphogenèse. Malgré les avancées technologiques considérables et les connaissances acquises, de nombreux aspects du développement des mammifères restent insaisissables. Lorsqu’on examine l’organisme dans son ensemble, il devient difficile de démêler les effets des voies individuelles ou le mécanisme par lequel les stimuli externes guident l’interférence des tissus et facteurs environnants. Pour répondre à cette complexité, les modèles in vitro tridimensionnels (3D) tels que les organoïdes se sont révélés être des outils précieux. Les organoïdes, dérivés de cellules souches embryonnaires (ESC) ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), présentent des caractéristiques tissulaires qui ressemblent étroitement à leurs homologues in vivo en termes de schémas d’expression et de fonctionnalité. Il est important de noter qu’ils offrent une accessibilité pour la manipulation et des études biologiques approfondies dans un cadre expérimental contrôlé. Bien qu’ils proviennent de cultures pluripotentes, les systèmes organoïdes présentent souvent une hétérogénéité et une variabilité substantielle, limitant leur utilité lors de l’étude de questions biologiques complexes et complexes. Par conséquent, il est urgent de disposer de protocoles détaillés visant à harmoniser les procédures qui aboutissent à des données reproductibles de haute qualité, à la réduction des matériaux utilisés, et qui permettent surtout l’investigation de phénomènes complexes. Dans ce contexte, un protocole optimisé pour la culture des organoïdes du tube neural (NTO) in vitro est présenté ici. En produisant des conditions de culture stables et en proposant des stratégies de dépannage complètes, ce protocole permet la génération fiable et reproductible d’ORN, qui servent de modèle adéquat pour étudier des questions scientifiques pertinentes, notamment les mécanismes d’induction neuronale, de schéma et le développement précoce du système nerveux central.

Introduction

Le développement chez les mammifères, à partir d’une seule cellule souche totipotente, est un processus complexe qui implique l’induction de la formation de motifs et de lamorphogenèse 1,2. Ce développement nécessite des programmes cellulaires strictement régulés pour gérer les interactions dynamiques entre les cellules et leur environnement. Les cellules souches ont la capacité intrinsèque de détecter, d’intégrer et de répondre aux signaux systémiques et locaux, y compris les gradients demorphogènes 3, les frontièresmécaniques 4, la prolifération cellulaire et le remodelageenvironnemental 5. Les indices spatiotemporels externes favorisent également des réponses multicellulaires, initialement, dans des tissus homogènes, afin d’assurer la formation précise de structures complexes. Les cellules souches, distinguées par leur auto-renouvellement 6,7 et leurs capacités de différenciation, jouent un rôle crucial dans le développement embryonnaire et la réparation des tissus adultes, les principaux types incluant les cellules souches embryonnaires (ESC), les cellules souches adultes (CAS) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

Les CES sont extraits de la masse cellulaire interne (MCI) d’un blastocyste et sont généralement cultivés dans un environnement bidimensionnel (2D) sur des cellules nourricières ou une matrice extracellulaire en utilisant des milieux de culture spécifiques pour maintenir leurpluripotence 8. Ces dernières années, le besoin de conditions et technologies de culture cellulaire plus réalistes a considérablement augmenté, ainsi, des modèles cellulaires et tissulaires tridimensionnels (3D) ont été établis pour étudier les processus biomédicauxfondamentaux 9. En particulier en biologie du développement, ces modèles 3D tels que les organoïdes offrent une méthode robuste pour modéliser la morphogenèse tissulaire et l’organogenèse exvivo 9. Les organoïdes se forment par l’auto-organisation de cellules souches proliférantes qui se développent spontanément en structures 3D complexes par bris de symétrie et formation de motifs. Ce processus est similaire, bien que pas identique à ce qui est observé in vivo, et se produit principalement sans orientation extérieure mais entraîné par des dynamiques et interactionsinternes 10. Puisque les organoïdes imitent étroitement la structure et la fonction des organes réels, ils peuvent fournir une représentation plus précise de la biologie des mammifères comparé aux cultures cellulaires 2Dtraditionnelles 11. De plus, l’un des principaux avantages est l’aspect éthique, car les organoïdes réduisent le besoin de modèles animaux, répondant ainsi aux préoccupations liées à la testation animale12,13. De plus, les organoïdes offrent une plateforme pour le dépistage à haut débit des médicaments, améliorant la prédiction de l’efficacité et de la toxicité des médicaments. Cependant, il existe également plusieurs défis liés à l’utilisation des organoïdes. Bien qu’elles soient plus réalistes que les cultures 2D, elles ne reproduisent pas pleinement la complexité et les interactions d’organes entiers au sein d’un organismevivant 14. De plus, une variabilité significative peut être observée entre organoïdes, même lorsqu’ils sont dérivés du même type de cellule, ce qui entraîne des incohérences dans les résultatsexpérimentaux 15. Ainsi, la culture des organoïdes de manière robuste et reproductible est essentielle et nécessite des compétences techniques avancées, un équipement spécialisé et des protocoles détaillés.

Le système nerveux est un réseau complexe chargé de coordonner les actions et de traiter les informations sensorielles en envoyant et recevant des signaux à travers tout le corps, contrôlant ainsi et coordonnant toutes les fonctions requises, y compris le mouvement, la sensation, la pensée et les fonctions autonomes telles que le rythme cardiaque et la digestion. Le précurseur du système nerveux central, composé du cerveau et de la moelle épinière, est le tube neural. Il est crucial de comprendre comment les structures neuronales se forment et fonctionnent dans le développement précoce du tube neural afin d’obtenir des informations sur divers troubles neurologiques et anomalies du développement. Les troubles neurodéveloppementaux sont difficiles à étudier in vivo, surtout lorsqu’ils proviennent de sujets humains en raison de préoccupations éthiques. Les organoïdes neuronaux, tels que les organoïdescérébraux 16,17, ont considérablement amélioré la compréhension du développement du système nerveux et des maladies en fournissant des modèles polyvalents et accessibles qui imitent étroitement le tissu cérébral humain. Ces structures tridimensionnelles, dérivées de cellules souches pluripotentes (PSC), reproduisent divers aspects du développement cérébral, notamment la formation de régions cérébrales distinctes, la diversité cellulaire et des réseaux neuronauxcomplexes 16,18,19. En permettant aux chercheurs d’observer les étapes du développement en temps réel et d’étudier les mécanismes de régulation clés, ces organoïdes offrent des perspectives approfondies sur le développement normal du cerveau. Les organoïdes cérébraux permettent également de modéliser les maladiesneurodéveloppementales 19 etneurodégénératives 20, telles que la microcéphalie16,21, l’infection au virusZika 22, les troubles du spectreautistique 23, et d’autres, élucidant les mécanismes de la maladie et identifiant des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les organoïdes cérébraux servent de plateformes précieuses pour les tests et le développement de drogues, facilitant l’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des médicaments dans un environnement similaire à celui du cerveau humain et accélérant les approches de médecine personnalisée. De plus, ils offrent un cadre contrôlé pour étudier les interactions gène-environnement, enrichissant la compréhension des maladies complexes résultant de l’interaction entre facteurs génétiques et environnementaux. Cependant, comme les organoïdes neuronaux, comme les organoïdes cérébraux, sont généralement formés à partir d’agrégats de cellules, ils présentent souvent une hétérogénéité cellulaire et une variabilité significatives dans les résultats expérimentaux, ce qui influence à son tour l’interprétabilité des données générées, posant un défi considérable pour les chercheurs17. Pour cette raison, l’optimisation des protocoles et des critères précis de contrôle qualité sont essentiels pour atténuer les données précieuses qui représentent adéquatement la condition in vivo.

Meinhardt etses collègues 24 ont eu un impact crucial en rapportant d’abord un protocole organoïde neuronal clonal imitant le développement précoce du tube neural, formé à partir de cellules souches embryonnaires uniques (ESC) qui minimise drastiquement l’hétérogénéité interorganoïde. Cette innovation permet aux chercheurs d’étudier les processus et mécanismes du développement, ainsi que la structuration neuronale, dans un environnement précis et défini avec une résolution exceptionnelle. Jusqu’à présent, de nombreux laboratoires ont développé des organoïdes neuronaux, principalement d’origine souris ou humaine, qui imitent différentes parties du tube neural et son développement, comme résumé dans25. Cependant, d’après les informations disponibles, le protocole établi par Meinhardt et al.24 est la seule méthode où les NTO se forment de manière fiable à partir d’une seule cellule, s’auto-organisent et se modelent efficacement en destins dorsoventraux après une seule impulsion globale d’acide rétinoïque (AR) sans l’ajout d’autres facteurs ventralisants tels que l’agoniste Sonic Hedgehog (SAG)26, ou l’utilisation de chambres microfluidiques fournissant des informations spatiales dues à la formation de gradients. Le protocole fourni ici a été adapté de Meinhardt et al.24 tel que fourni dans Krammer et al.26. Dans ce protocole, les CES d’une seule souris sont ensemencées dans une matrice de culture cellulaire et exposées à des conditions de neurodifférentiation définies. En deux jours, ces cellules s’étendent et épithélisent clonalement, formant une structure 3D arrondie à ellipsoïde avec un seul lumen et des cellules apique-basiquement stratifiées autour d’elle. Au deuxième jour, une impulsion globale de 18 heures de la molécule de signalisation AR améliore la différenciation neuronale, postériorise les NTO du mésencéphale aux niveaux de l’encéphale postérieur/moelle cervicale, et induit la formation d’une plaque de sol fonctionnelle unique au 6e jour, qui modele le NTO du ventral au dorsal.

Le protocole optimisé offre plusieurs avantages clés. Il permet une épithélialisation robuste dans les trois premiers jours et génère des tissus sphériques relativement petits d’environ 200 μm de diamètre, chacun contenant un seul lumen. Les organoïdes proviennent de cellules uniques et sont maintenus dans un milieu de culture sans sérum, défini chimiquement. En six jours, une différenciation neuronale progressive à partir des cultures pluripotentes est obtenue, aboutissant à des organoïdes présentant une identité antérieure du mésencéphale au 6e jour et des structures dorsoventrales ressemblant à des moelles épinières postérieures ou cervicales après une impulsionglobale de PR 26.

Plusieurs aspects ont été adaptés et diffèrent du protocoleoriginal 22,25 afin d’améliorer la reproductibilité et le débit. Cela inclut des conditions de culture ESC modifiées, un nombre réduit de cellules d’entrée, un milieu de différenciation amélioré et un protocole de différenciation ajusté qui omet la supplémentation en Noggin pendant les jours 0 à 2 (déjà utilisé en26). De plus, la densité d’ensemencement a été optimisée pour une utilisation dans des plaques à 96 puits, permettant une analyse à haut débit. Ensemble, ces améliorations ont conduit à une augmentation de 40 % de l’efficacité de formation et de configuration des NTO, passant initialement de ~40 % à ~80 % dans la version mise à jour.

Ici (Figure 1), une description détaillée d’un protocole optimisé permet une génération robuste et reproductible d’OTN dans la matrice de culture cellulaire. Le protocole englobe toutes les étapes de la gestion des NTO, depuis l’ensemencement initial des ESC pour les essais de différenciation jusqu’à la maintenance, la fixation et l’analyse ultérieures. Il inclut également des directives pour le contrôle qualité par une évaluation visuelle quotidienne de la morphologie des NTO, ainsi qu’une caractérisation critique de l’identité organoïde à l’aide de coloration par anticorps afin de vérifier la bonne configuration et la différenciation neuronale. De plus, des approches complètes de dépannage sont proposées, permettant une évaluation critique à chaque étape du protocole, nécessaire pour garantir la reproductibilité et la fiabilité des protocoles expérimentaux. Ces instructions détaillées aident à identifier et résoudre les problèmes potentiels, à minimiser les erreurs et à optimiser les résultats. Cela est crucial pour préserver l’intégrité des expériences scientifiques et permettre aux autres scientifiques de reproduire avec succès les travaux et de tirer des conclusions complètes des données générées, faisant ainsi progresser le domaine.

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Figure 1 : Aperçu du protocole. (A) Passage des ESC (voir étape 1.1). (B) Fractionnement de la matrice de culture cellulaire et ensemencement de ESC individuels pour différenciation en NTO (voir étape 1.2). (C) Aliquote de la PR et du traitement de l’AR (voir étape 2). (D) Retrait de la PR et routine du remplacement quotidien du moyen (voir étape 3). Cette figurine a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Protocole

REMARQUE : Vérifiez quotidiennement les cellules et les NTO pour évaluer la qualité avant toute procédure supplémentaire (remplacement du milieu, traitement, fixation, etc.). Toutes les procédures nécessitant une exposition directe des cellules à l’air doivent être effectuées dans un cabinet de biosécurité afin d’assurer la stérilité et d’éviter la contamination de la culture.

1. Maintenance, passage et ensemencement des ESC de souris pour la différenciation des NTO

  1. Passage
    1. Maintenez les ESC sur des plats ou puits de culture cellulaire sur une plaque à 6 puits pré-enduite de gélatine à 0,15 % pendant 30 minutes à 37 °C.
    2. Passage ESC tous les 2-3 jours, avec remplacement quotidien du moyen à partir du deuxième jour.
    3. Préchauffez tous les réactifs (Medium, PBS, solution enzymatique) à un minimum de 21 °C et un maximum de 37 °C avant utilisation.
    4. Vérifier les cellules au microscope à contraste de phase (voir images représentatives, Figure 2). Assurez-vous que les colonies ont une taille et une morphologie appropriées (Figure 2A), tout en confirmant qu’elles adhèrent au fond du plat.
      REMARQUE : Rejetez la culture si plus de 10 % des CES de souris sont différenciés (Figure 2B), et préparez une culture fraîchement décongelée, que vous devriez adopter au moins deux fois avant de semer les CES pour un essai de différenciation. Les chercheurs expérimentés peuvent juger par évaluation visuelle (voir aussi Mulas et al.28) ou par coloration par anticorps pour l’expression des marqueurs (par exemple, OCT4, voir aussi Ying et al.29).
    5. Ouvrez le couvercle de la plaque/assiette de culture, inclinez-la légèrement et aspirez soigneusement le médium. Gardez les cellules hors de l’incubateur le plus court possible possible. Conservez les cellules sans substrat aussi brièvement que possible pour éviter que la culture ne sèche.
    6. Lavez les colonies avec 500 μL de PBS préchauffé (ajoutez aux cellules dans un seul puits d’une plaque à 6 puits), puis aspirez immédiatement à nouveau.
      REMARQUE : Cette étape est cruciale car : i) le transfert du milieu ESC (2iLIF) doit être évité avant que le test de différenciation ne soit freiné (sinon la formation du NTO sera entravée), ii) le FBS ou le BSA dans le milieu de culture peuvent stopper la dissociation. Cela s’applique aux ESC cultivés dans un autre milieu ESC, contenant FBS ou BSA.
    7. Ajoutez 500 μL de solution enzymatique pré-chauffée et transférez les cellules dans l’incubateur.
    8. Incubez les cellules à 37 °C pendant 3 minutes en utilisant un minuteur.
    9. Après le temps d’incubation, retirez la plaque et vérifiez les cellules sous le microscope à contraste de phase.
      REMARQUE : Les ESC auraient dû se détacher de la plaque de culture ; sinon, tapotez fermement mais soigneusement sur le plat (Figure 2C).
    10. Ajoutez 1 mL de milieu N2B27 (Tableau 1) en le pipettant directement sur les cellules.
      REMARQUE : Lors de la préparation du milieu (N2B27), la glutamine est conservée au maximum 5 à 10 minutes à 37 °C, de préférence à température ambiante. Les ESC doivent être lavés de l’assiette, laissant des zones « vides » dans le plat de culture.
    11. Utilisez une pipette P1000 et inclinez légèrement la plaque pour que toutes les colonies collées au plat de culture puissent être lavées.
    12. Pour dissocier les amas de cellules, inclinez légèrement la plaque, placez la pointe de la pipette (P1000) au centre de la plaque, pressez la pointe contre le fond de la plaque mais légèrement en dehors de l’axe perpendiculaire, puis évacuez les cellules. Répétez cinq à dix fois pour casser les amas cellulaires.
    13. Vérifiez que les cellules sont correctement dissociées en cellules individuelles au microscope à contraste de phase (Figure 2D) et répétez s’il reste des amas de groupe.
    14. Après une dissociation complète, transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge conique stérile propre de 15 mL, lavez le puits vide où les cellules ont été cultivées avec 1 mL de milieu N2B27, puis transférez dans le même tube centrifugeuse conique que la suspension cellulaire.
    15. Centrifugez les cellules pendant 5 minutes à 453 x g dans une ultracentrifugeuse.
    16. Aspirez soigneusement le surnageant.
    17. Resuspendez les cellules dans une quantité appropriée de milieu N2B27 (par exemple, 1 mL) et comptez les cellules (voir le tableau 2 pour les nombres cellulaires recommandés pour le test de différenciation en NTO).
  2. Différenciation des CES en organoïdes de tubes neuraux (NTO)
    1. Fragmentation de la matrice de culture cellulaire
      1. Décongelez la bouteille de matrice de culture cellulaire toute la nuit sur de la glace à 4 °C (jamais à température ambiante ni en décongélation manuelle). Ne laissez pas la matrice de culture cellulaire à 4 °C plus longtemps que nécessaire ; Aliquot et gelez dès que possible pour préserver sa fonctionnalité.
      2. Dans l’armoire de biosécurité, placez des tubes de microcentrifuge de 1,5 à 2 mL sur de la glace pour les prérefroidir tout en conservant la bouteille de matrice de culture cellulaire sur de la glace fraîche.
      3. Mélangez soigneusement la matrice de culture cellulaire décongelée pour éviter la formation de bulles, car les bulles peuvent provoquer un détachement du puits ou du plat après la gelification.
      4. Matrice de culture cellulaire aliquote au volume désiré (0,5-1 mL est recommandé) et congéle à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. Évitez de remplacer la pointe entre les aliquotes, car les pointes à température ambiante peuvent solidifier la matrice de culture cellulaire à l’intérieur, entraînant une perte significative. À la place, refroidissez les pointes de la pipette à 4 °C en les conservant au réfrigérateur avant utilisation.
    2. Ensemencement de cellules individuelles dans une matrice de culture cellulaire
      1. Quantifiez le nombre de cellules nécessaires (matrice de culture cellulaire de 100 cellules/μL, voir Tableau 2).
      2. Transférez le numéro de cellule approprié (suspension de cellule) dans un tube centrifuge conique propre de 15 mL et complétez avec 1 mL de N2B27.
      3. Centrifugez les cellules pendant 5 minutes à 453 x g dans la centrifugeuse.
      4. Aspirez le surnageant et placez le tube conique de centrifugeuse sur la glace.
      5. Suspendez soigneusement la granule cellulaire sur de la glace dans une quantité appropriée de matrice de culture cellulaire décongelée et liquide tout en évitant la formation de bulles.
      6. Étalez la quantité appropriée de suspension matrice-cellule de culture cellulaire, en une fine couche, sur un plat à fond en verre ou en plastique optimal pour l’imagerie (voir Tableau 2, Figure 3A-C), sans toucher les parois des plaques multi-puits. En raison de la forte tension superficielle, la gouttelette de la matrice de culture cellulaire peut se déplacer du centre du puits vers les parois si elle a été préalablement touchée, ce qui entraîne une distribution inadéquate des cellules / NTO.
        REMARQUE : Si vous utilisez des plaques multi-puits : dessinez d’abord un cercle de matrice de culture cellulaire à l’aide d’une pointe de pipette P20 (plaque à 96 puits) ou P200 avant de le « remplir » avec la suspension matrice-cellules de culture cellulaire (Figure 3B).
      7. Placez la plaque/plat multi-puits dans l’incubateur à 37 °C pour laisser la matrice de culture cellulaire se solidifier. Estimez 1 min par μL de matrice de culture cellulaire pour des quantités plus petites et un maximum de 15 min pour 40 μL ou plus.
      8. Après le temps d’incubation, retirez la plaque et ajoutez un volume approprié de substrat (voir Tableau 2). Les CES dans la matrice de culture cellulaire ne doivent pas sécher lors de l’ensemencement pour le test de différenciation en NTO ou lors du remplacement du milieu. Après la gelification, le médium doit être appliqué dès que possible. La gellification est généralement complète en 1 minute à 37 °C par matrice de culture cellulaire de 1 μL et un maximum de 15 minutes pour une matrice de culture cellulaire de 40 à 100 μL lorsqu’elle est étalée en couche fine.
        REMARQUE : Pour éviter que les ESC ne sèchent dans la matrice de culture cellulaire, manipulez un maximum de 8 puits d’une plaque de 96 puits avec une pipette multicanal ou un plat/puits à fond de verre de 35 mm de toute autre plaque multi-puits. Gardez les cellules hors de l’incubateur le plus court possible possible.
      9. Vérifiez la densité de mise en forme et la distribution cellulaire dans la matrice de culture cellulaire au microscope à contraste de phase (Figure 3C,D). La densité optimale de semis est recommandée (tableau 2 et figure 3). Cependant, pour certaines applications, comme l’analyse précoce, une densité d’ensemencement jusqu’à 10 fois supérieure peut être avantageuse.
        REMARQUE : Mélangez soigneusement la suspension matrice-cellules de culture cellulaire en la resuspendant avec une pointe de pipette P300 ou P1000 avant de semer pour le test de différenciation afin de contrer la variabilité du nombre cellulaire entre puits ou antennements. Cette étape n’est pas recommandée avant de semer chaque puits pour protéger contre la perte de la matrice de culture cellulaire, car cela peut se solidifier et adhérer à la pointe de la pipette.

Tableau 1 : Composants moyens (base N2B27, 2iLIF, N2B27diff). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Informations sur le nombre de cellules par antenne, la quantité de matrice de culture cellulaire, le volume du milieu et le temps de gélification. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Traitement de la PR des NTO afin d’améliorer la différenciation neuronale et d’induire la postérisation et la ventralisation

  1. Aliquotation de l’acide rétinoïque (PR)
    1. Apportez de la poudre entièrement trans à température ambiante (stockée à -20 °C).
    2. Reconstituer la poudre dans un volume approprié de DMSO pour atteindre une concentration finale de 100 mM.
    3. Aliquote 1 μL de 100 mM d’AR dans un flacon à couvercle de 1,5 mL chacun.
    4. Ajoutez du gaz argon jusqu’à ce que le tube soit « plein ».
      REMARQUE : Comme le gaz argon est plus lourd que l’oxygène, il s’enfonce au fond du tube pour couvrir et préserver la RA de l’air. Cela se ressent sur les aiguilles lorsque la bouche s’échappe lorsque le tube est plein.
    5. Ferme bien la fiole. La PR est très sensible à la lumière et à l’air.
    6. Conservez les aliquotes dans le noir à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. Alternativement, la RA reconstituée peut être stockée dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL dans le liquide N2.
      REMARQUE : La polyarthrite reconstituée et diluée peut être conservée au réfrigérateur lorsqu’elle est couverte de papier aluminium pendant un maximum de 2 jours.
  2. Traitement de la PR des NTO pendant 18 heures (Figure 4A)
    1. Retirez 1 μL de l’aliquote avec une concentration de 100 mM de -80 °C et laissez-le dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit décongelé à température ambiante (par exemple, dans la paume de la main ou dans un support à tubes dans une armoire de biosécurité sans lumière).
      REMARQUE : Si les aliquotes de la RA sont stockées dans le liquide N2, ouvrez immédiatement le couvercle du tube de la microcentrifuge pour éviter l’explosion du tube, puis refermez-la et passez à l’étape 2.2.2.
    2. Une fois décongelé, ajoutez 400 μL de milieu N2B27diff préchauffé pour une concentration de 250 μM à l’aide d’une pipette P1000. Mélangez soigneusement pour obtenir une homogénéité.
      REMARQUE : Alternativement, la PR peut être reconstituée et diluée dans du DMSO pur au lieu du milieu N2B27diff, bien que cela augmente la concentration de DMSO dans la culture. Lors de la préparation du milieu (N2B27diff), la glutamine est conservée au maximum 5 à 10 minutes à 37 °C, de préférence à température ambiante.
    3. Sortez les assiettes/plats qui cultivent des NTO de l’incubateur et placez-les dans un cabinet de biosécurité stérile.
    4. Examinez les NTO en croissance au microscope à contraste de phase. La morphologie des NTO est cruciale pour fournir des informations sur la viabilité de la culture et l’efficacité de l’expérience (Figure 4B-D).
    5. Retirez le couvercle de l’assiette ou du plat et inclinez légèrement l’assiette sur le côté. Aspirez le milieu avec précaution, soit à l’aide d’une pipette P200, soit d’un aspirateur, sans perturber la matrice de culture cellulaire. Conservez les NTO sans substrat aussi brièvement que possible pour éviter que la culture et/ou le mélange de cultures cellulaires ne dessèchent.
    6. Ajouter un volume approprié de N2B27diff complété par une solution de 250 nM de RA (voir Tableau 2), couvrir avec le couvercle, puis transférer les NTO dans l’incubateur.
      REMARQUE : Parfois, surtout si la PR n’a pas été complètement mélangée, des précipités peuvent se former plus difficiles à dissoudre dans le N2B27diff normal. Dans ce cas, il faut éliminer l’aliquote et fabriquer de nouvelles aliquotes de PR car ces précipités ont une concentration inconnue et incontrôlée de PR.

3. Retrait de la PR et routine du remplacement quotidien du médium des NTO

  1. Transférez la plaque de culture de l’incubateur vers l’armoire stérile de biosécurité.
  2. Retirez le couvercle et inclinez légèrement la plaque sur le côté.
  3. Aspirez soigneusement le N2B27diff contenant la PR, soit à l’aide d’une pipette P200, soit d’un aspirateur, sans toucher à la matrice de culture cellulaire.
  4. Ajoutez du PBS préchauffé (utilisez assez de volume pour couvrir la gouttelette de la matrice de culture cellulaire ou comme indiqué dans le tableau 2), puis inclinez à nouveau la plaque et retirez-la délicatement pour laver la PR restante.
  5. Ajoutez un volume approprié de N2B27diff (comme mentionné dans le tableau 2), en pipettant le milieu le long de la paroi du puits/antenne pour éviter d’endommager la gouttelette de la matrice de culture cellulaire.
  6. Remplacez le substrat quotidiennement en suivant les étapes 3.1-3.3, puis ajoutez doucement du N2B27diff frais pré-chauffé en pipettant le milieu sur la paroi du puits / de la plaque avant de remettre les NTO dans l’incubateur. Une pipetage directe et vigoureuse ou l’ajout de milieu froid/PBS sur la gouttelette de la matrice de culture cellulaire peut provoquer sa casse et son détachement de la plaque/plat.
    REMARQUE : Lors de perturbations de voies en utilisant de petites molécules ou des protéines recombinantes, il est important de remplacer le milieu quotidiennement. Si les médicaments doivent être appliqués plus d’une journée, les solutions médicamenteuses doivent être préparées fraîchement chaque jour ou au moins tous les deux jours afin d’assurer la stabilité des protéines/médicaments et la présence continue des concentrations correctes.

4. Fixation des NTO

REMARQUE : Les NTO sont fixés comme décrits par Krammer et al.26. Selon l’anticorps à utiliser ultérieurement, un PFA provenant de différentes sources (acheté en magasin, en interne, etc.) peut être nécessaire.

  1. Dégel de l’aliquote PFA à 4 °C pendant la nuit.
  2. Apportez le PFA à température ambiante avant utilisation.
  3. Si vous utilisez une concentration de PFA plus élevée en stock, diluez le PFA à 4 % dans un milieu N2B27diff ou du PBS dans une hotte chimique.
  4. Sortez les NTO de l’incubateur et transférez-les dans une hotte chimique.
  5. Ouvrir le couvercle et ajouter 4 % de PFA dans un ratio de 1:1 directement aux NTO pour obtenir une concentration finale de 2 % (par exemple, 100 μL de 4 % de PFA ajoutés aux 100 μL de N2B27diff dans la plaque à 96 puits).
  6. Remettez le couvercle et incubez les NTO pendant 30 minutes à température ambiante. Fixez un minuteur, car une fixation plus longue peut nuire à la performance de certains traitements anticorps.
    REMARQUE : Le PFA est toxique et ne doit pas être inhalé. Travaillez prudemment et avec prudence sous la hotte chimique. Certains anticorps nécessitent l’utilisation d’un PFA spécifique ou un temps de fixation plus court/optimisé.
  7. Après 30 minutes, retirez le couvercle et inclinez légèrement la plaque sur le côté, puis suivez les étapes 3.3-3.4.
  8. Ajoutez soigneusement du PBS préchauffé (utilisez assez de volume pour couvrir la gouttelette de la matrice de culture cellulaire ou comme indiqué dans le tableau 2), puis faites couver pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez cette étape 3 fois pour éliminer tout le PFA restant.
  9. Après le lavage final, ajoutez une quantité appropriée de PBS (voir Tableau 2), scellez la plaque avec du parafilm, et conservez à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

5. Coloration par anticorps des NTO

  1. La coloration par anticorps est un outil précieux pour évaluer l’identité correcte des NTO ainsi que le succès de l’analyse/expérimentation. La coloration par anticorps peut être réalisée comme décrit par Meinhardt et al.24 et Krammer et al.26.
    REMARQUE : Si les NTO semblent sous-optimaux (Figure 4E-G) ou ne montrent pas la bonne expression des marqueurs spatiotemporels (Figure 5 à Figure 7), jetez le matériau car il ne respecte pas les normes de qualité.
  2. Gardez la solution de bloc/perméabilisation (1x PBS avec 1 % de BSA et 0,5 % de Triton-X) à 4 °C et adaptez-vous à la température ambiante avant utilisation.
  3. Pour une reconstitution et une analyse 3D complètes, gardez les anticorps (1re et2e) à 4 °C pendant au moins 1, mais de préférence 2 à 3 nuits, afin d’assurer une bonne pénétration des anticorps.
    REMARQUE : L’anticorps Alexa Fluor anti-5612nd peut fournir un signal de fond plus fort dans la matrice de culture cellulaire durant les trois premiers jours de l’analyse de différenciation.

6. Déminage des NTO

  1. Préparez-vous à la dégagement26
    1. Terminez le processus de coloration des anticorps avant de commencer la procédure de dégagement (assurez-vous que les1er et2e anticorps soient incubés et bien lavés).
    2. Ajoutez du propylgallate à la solution de déblaiement (2 mg de propylgallate par ml de solution de déblaiement) pour minimiser le photoblanchiment des NTO.
      REMARQUE : Effectuez le nettoyage 1 à 2 heures avant l’imagerie afin d’éviter l’oxydation (le liquide passe du jaune clair/crème à un jaune foncé vif ou même au brun) ou la cristallisation de la solution de déblaiement. Si la cristallisation a lieu, dissoudrez-vous en ajoutant du PBS au puits.
  2. Précautions pour le pH de la solution et le mélange
    1. Maintenir le pH correct de la solution de défrichage pour éviter une oxydation rapide ou la dissolution de la matrice de culture cellulaire.
    2. Évitez les secousses vigoureuses ou les mélanges agressifs de la solution pour éviter la formation de bulles d’air.

7. Analyse des NTO

  1. Préparation à la microscopie
    1. Après avoir effectué la coloration par anticorps et le nettoyage des tissus entiers, utilisez un microscope confocal avec des objectifs de 10 à 40x pour l’imagerie.
  2. Évaluation visuelle
    1. Utilisez une évaluation visuelle et une quantification manuelle pour déterminer efficacement si les NTO présentent une expression appropriée des marqueurs neuronaux et une organisation dorsoventrale.
  3. Logiciels d’analyse 3D
    1. Pour l’analyse 3D, utilisez des logiciels tels que CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) ou un outil similaire pour évaluer les marqueurs spatiaux et les détails structurels.
  4. Vérification de l’identité de l’NTO
    1. Confirmez l’identité correcte des NTO en évaluant l’expression temporelle des marqueurs neuronaux et l’expression spatiotemporelle de marqueurs spécifiques de motifs dorsoventraux. Cette étape est essentielle pour s’assurer que le test de différenciation a réussi avant de poursuivre les recherches.
  5. Aspects de caractérisation : Consultez la Figure 4, ainsi que la Figure 6 et la Figure 7 pour vérifier les aspects critiques suivants du succès culturel :
    1. Voir la figure 4 et la coloration ZO-1 montrée dans Meinhardt et al.24 pour vérifier une épithélialisation réussie et la formation de la lumière.
    2. La différenciation neuronale réussie se caractérise par la régulation à la baisse d’OCT4 et la hausse de SOX1, suivie d’une expression de β3TUBULINE (détaillée dans24). Consultez les figures 6 et 7 pour vérifier la réussite de la différentiation neuronale.
    3. Le motif dorsoventral est confirmé par la présence d’une plaque de sol ventrale FOXA2+/SHH+ et une expression PAX3+ au pôle dorsal opposé (motif ventral détaillé dans26). Voir les figures 6 et 7 pour vérifier le succès du schéma dorsoventral.

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Résultats

Les ESC de souris R1 ont été utilisées pour tous les exemples représentatifs dans les figures présentées dans ce manuscrit. D’autres CES de souris mentionnées peuvent présenter de légères différences dans le timing de l’épithélialisation, la différenciation neuronale ou l’efficacité de la patterning lorsqu’elles sont ensemencées pour les NTO, cependant, les résultats ne devraient pas différer significativement des données présentées ici.

Seules les ESC de bonn...

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Discussion

Ici, plusieurs adaptations optimisantes et améliorations du protocole original pour générer des NTO de haute qualité sont présentées afin de faciliter la normalisation entre les laboratoires. Les modifications clés incluent des conditions de culture ESC différentes, une réduction du nombre de cellules d’entrée, un milieu de différenciation amélioré, un protocole de différenciation modifié, et des ajustements de densité de semis pour une analyse à haut débit utilisant des plaques multi-pu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du laboratoire Tanaka pour leur soutien et leurs discussions dans l’élaboration de ce protocole. Nous remercions tout particulièrement A. Pelzl pour avoir lu de manière critique le manuscrit, donné ses contributions et aidé aux schémas, ainsi qu’E. Chatzidaki pour sa lecture critique du manuscrit, son édition, son soutien aux schémas ainsi que pour avoir obtenu le financement du PUD 25 avec Juergen A. Knoblich. Cette publication a été financée par le Fonds autrichien pour la science (FWF) : « Projet de publication autonome numéro PUD 25 ». De plus, ce projet a reçu des financements du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention ERC AdG 742046), ainsi que du Fonds autrichien pour la science (FWF) [10.55776/ F7803-B] (modulation des cellules souches). Pour l’Open Access, les auteurs ont appliqué une licence de copyright public CC BY à toute version de manuscrit accepté par l’auteur (AAM) issue de cette soumission.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antenne 35 mm | Enveloppe n° 1.5 | 14 mm de diamètre en verre | Non enduitMatTek CorporationCat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenCat# 00-4555-56
Fraction V de l’albumine (BSA) (pH 7,0)Panreac AppliChemCat# A1391
Acide rétinoïque All-TransMerckCat# R2625
Supplément de B-27 (50X), sans sérumGibcoCat# 17504044
Matrice membranaire du socle (Matrigel)CorningCat# BDL354234Concentration en protéines 10 mg/ml  ;
Microplaques CellCarrier-96 UltraPerkinElmerCat# 6055302
CellProfiler 4Stirling et al. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisCat# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto et al., 2019N/A
DiméthylsulfoxydeSigma AldrichCat# D2650
DMEM/F-12, pas de glutamineGibcoCat# 21331020
Dulbecco » s Solution physiologique tamponnée phosphate (DPBS, 1X)GibcoCat# 14190144
Centrifugeuse Eppendorf 5810 REppendorfCat# 5811000015
Microtube Eppendorf 3810XMerckCat# EP0030125150
Tubes centrifugeuses coniques FalconCorningCat# 352095
GélatineMerckCat# G2500
L-Glutamine (200 mM)GibcoCat# A2916801
Incubateur de CO2 HeracellVIOS 160i, 165 LThermoFisher ScientificCat# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Microscope LED à contraste de phase inversé (CKX53)Olympe
2-Mercaptoéthanol (50 mM)GibcoCat# 31350010
Anti-OCT-3/4 monoclonal de sourisSanta Cruz BiotechnologieCat# SC-5279 ; RRID : AB_628051Utilisez 1:200
Anti-PAX3 monoclonal de sourisDSHBCat# PAX3-C ; RRID : AB_528426Utilisez 1:100
Anti-SHH monoclonal de lapinTechnologies de signalisation cellulaireCat# 2207 ; RRID : AB_2188191Utiliser 1:300
Anti-et bêta monoclonal du lapin ; 3-TubulineTechnologies de signalisation cellulaireCat# 5568 ; RRID : AB_10694505Utilisez 1:500
Anti-ZO-1 monoclonal de sourisInvitrogenCat# 33-9100 ; RRID : AB_2533147Utilisez 1:200
Souris LIFQkineCat# Qk018-1000
Supplément N-2 (100X)GibcoCat# 17502048
Milieu neurobasalGibcoCat# 21103049
Paraformaldéhyde, qualité réactive, cristallinMerckCat# P6148
0325901TocrisCat# 4192
Solution de pénicilline-stramtomycineGibcoCat# 15140130
Microscope à contraste de phase
Anti-FOXA2 polyclonal de chèvreR& DCat# AF2400 ; RRID : AB_2294104Utilisez 1:400
Anti-SOX1 polyclonal de chèvreR& Systèmes DCat# AF3369 ; RRID : AB_2239879Utilisez 1:200
Données ARN-Seq liées à la Figure 6Ishihara et al., 2022GEO : GSE214368
Armoire de sécurité microbiologique Premium SafeFASTGroupe Dasit PLUS RAPIDECat# F00025200000
Pyruvate de sodium (100 mM)GibcoCat# 11360070
Microscope inversé confocal à disque tournant (IX3)Olympe
Triton X-100Sigma AldrichCat# 9036-19-5

Références

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