MEDUSA pour l’identification des gènes régulateurs de la mort dans les données de profilage chimio-génétique

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser la méthode analytique MEDUSA pour quantifier l’effet régulateur de la mort de chaque gène knock-out. Il comprend des instructions sur la détermination des conditions expérimentales qui optimisent la sensibilité et un tutoriel étape par étape sur la réalisation de l’analyse.

Résumé

Le dépistage systématique des perturbations génétiques de gain ou de perte de fonction peut être utilisé pour caractériser les dépendances génétiques et les mécanismes de régulation pour essentiellement n’importe quel processus cellulaire d’intérêt. Ces expériences impliquent généralement le profilage à partir d’un ensemble de perturbations génétiques uniques et la façon dont chaque perturbation génétique affecte la valeur adaptative relative des cellules. Lorsqu’elles sont appliquées dans le contexte d’études d’efficacité des médicaments, souvent appelées profilage chimiogénétique, ces méthodes devraient être efficaces pour identifier les mécanismes d’action des médicaments. Malheureusement, les études de profilage chimiogénétique basées sur la condition physique sont inefficaces pour identifier tous les composants d’une réponse médicamenteuse. Par exemple, ces études ne parviennent généralement pas à identifier les gènes qui régulent la mort cellulaire induite par les médicaments. Plusieurs problèmes contribuent à obscurcir la régulation de la mort dans les dépistages basés sur la valeur adaptative, notamment les effets confondants de la variation du taux de prolifération, la variation de la coordination induite par le médicament entre la croissance et la mort et, dans certains cas, l’incapacité à séparer l’ADN des cellules vivantes et mortes. MEDUSA est une méthode analytique permettant d’identifier les gènes régulateurs de la mort dans les données de profilage chimio-génétique conventionnelles. Il fonctionne en utilisant des simulations informatiques pour estimer les taux de croissance et de mortalité qui ont créé un profil de fitness observé plutôt que de noter la condition physique elle-même. L’utilisation efficace de la méthode dépend de la détermination optimale des conditions expérimentales, y compris la dose de médicament, la taille de la population de départ et la durée du test. Ce manuscrit décrira comment mettre en place une étude de profilage chimio-génétique pour l’analyse basée sur MEDUSA, et nous montrerons comment utiliser la méthode pour quantifier les taux de mortalité dans les données de profilage chimio-génétique.

Introduction

Dans le profilage chimio-génétique, des perturbations génétiques systématiques sont utilisées pour comprendre la contribution de chaque gène à une réponse médicamenteuse donnée ^1,2,3. Ces expériences sont précieuses et peuvent révéler des informations importantes sur les réponses aux médicaments, y compris la cible de liaison du médicament et les mécanismes d’afflux et d’efflux de médicaments. Cependant, comme ces expériences sont généralement réalisées de manière regroupée qui évalue tous les gènes simultanément, il peut être difficile de gé....

Protocole

1. Optimisation de la dose de médicament pour induire la mort cellulaire

REMARQUE : Le protocole ci-dessous permet d’optimiser une combinaison de lignée cellulaire, de médicament et de dose à l’aide du test FLICK ^7,8. Les données d’exemple pour ce protocole décrivent l’optimisation et le criblage de l’étoposide 5 μM dans les cellules U2OS, mais les mêmes étapes d’optimisation pourraient être appliquées à toute autre combinaison souhaitée de lignée cellulaire et de médicament/dose. Ce protocole ne nécessite pas le prélèvement ou l’anal....

Résultats

À l’aide de ce protocole, nous avons exploré les dépendances génétiques de la mort induite par l’étoposide dans les cellules U2OS. L’étoposide est une chimiothérapie qui endommage l’ADN^{couramment utilisée 15}. Cette expérience de profilage chimio-génétique a été réalisée à l’aide de la banque GeCKOv2¹⁶ dans Cas9 exprimant les cellules U2OS⁵. Dans ces types d’expériences, la fonction du gène est généralement déduite de l’abondance relative d’un clone k.......

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation de la méthode analytique MEDUSA pour quantifier les données de profilage chimio-génétique afin de déterminer comment les perturbations génétiques modifient les taux de croissance et de mortalité induits par les médicaments. Étant donné que le résultat principal d’une expérience de profilage chimiogénétique est lié à la taille de la population, et non aux taux, les taux sous-jacents sont déduits à l’aide de simulations. Ainsi, les étapes cri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	Pour la croissance des cellules et l’optimisation de la taille de la population
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	Pour la croissance des cellules et l’optimisation de la taille de la population
DESeq2	R Package	v1.44.0	Pour le calcul du DMEM à changement de pliage
	Corning	10017CV	Pour l’ensemencement et la pharmacie cellules
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	Pour l’ensemencement et le traitement des cellules
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	Pour l’ensemencement et le traitement des cellules (pin plate)
Greiner Bio-One  ; CELLSTAR &mu ; Greiner à microplaques à fond plat transparent 96 puits, traité par culture cellulaire,		655090	Pour l’ensemencement et le traitement des cellules
MATLAB	Mathworks  ;	R2024a	Pour effectuer FLICK, GRADE et MEDUSA
Lecteur de fluorescence de microplaques	Tecan	Spark	Pour les mesures de cellules mortes
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	Pour les mesures de cellules mortes
TKOV3 Bibliothèque CRISPR	Addgene	125517	Pour réaliser un écran CRISPR
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	Pour la perméabilisation des cellules
Trypan bleu  ;	Corning	MT25900CI	Pour mesurer les cellules vivantes/mortes