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Article de méthode

MEDUSA pour l’identification des gènes régulateurs de la mort dans les données de profilage chimio-génétique

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DOI :

10.3791/67892

⸱

7 février 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser la méthode analytique MEDUSA pour quantifier l’effet régulateur de la mort de chaque gène knock-out. Il comprend des instructions sur la détermination des conditions expérimentales qui optimisent la sensibilité et un tutoriel étape par étape sur la réalisation de l’analyse.

Résumé

Le dépistage systématique des perturbations génétiques de gain ou de perte de fonction peut être utilisé pour caractériser les dépendances génétiques et les mécanismes de régulation pour essentiellement n’importe quel processus cellulaire d’intérêt. Ces expériences impliquent généralement le profilage à partir d’un ensemble de perturbations génétiques uniques et la façon dont chaque perturbation génétique affecte la valeur adaptative relative des cellules. Lorsqu’elles sont appliquées dans le contexte d’études d’efficacité des médicaments, souvent appelées profilage chimiogénétique, ces méthodes devraient être efficaces pour identifier les mécanismes d’action des médicaments. Malheureusement, les études de profilage chimiogénétique basées sur la condition physique sont inefficaces pour identifier tous les composants d’une réponse médicamenteuse. Par exemple, ces études ne parviennent généralement pas à identifier les gènes qui régulent la mort cellulaire induite par les médicaments. Plusieurs problèmes contribuent à obscurcir la régulation de la mort dans les dépistages basés sur la valeur adaptative, notamment les effets confondants de la variation du taux de prolifération, la variation de la coordination induite par le médicament entre la croissance et la mort et, dans certains cas, l’incapacité à séparer l’ADN des cellules vivantes et mortes. MEDUSA est une méthode analytique permettant d’identifier les gènes régulateurs de la mort dans les données de profilage chimio-génétique conventionnelles. Il fonctionne en utilisant des simulations informatiques pour estimer les taux de croissance et de mortalité qui ont créé un profil de fitness observé plutôt que de noter la condition physique elle-même. L’utilisation efficace de la méthode dépend de la détermination optimale des conditions expérimentales, y compris la dose de médicament, la taille de la population de départ et la durée du test. Ce manuscrit décrira comment mettre en place une étude de profilage chimio-génétique pour l’analyse basée sur MEDUSA, et nous montrerons comment utiliser la méthode pour quantifier les taux de mortalité dans les données de profilage chimio-génétique.

Introduction

Dans le profilage chimio-génétique, des perturbations génétiques systématiques sont utilisées pour comprendre la contribution de chaque gène à une réponse médicamenteuse donnée 1,2,3. Ces expériences sont précieuses et peuvent révéler des informations importantes sur les réponses aux médicaments, y compris la cible de liaison du médicament et les mécanismes d’afflux et d’efflux de médicaments. Cependant, comme ces expériences sont généralement réalisées de manière regroupée qui évalue tous les gènes simultanément, il peut être difficile de générer des informations mécanistes à partir de données de profilage chimiogénétique.

Les mécanismes de contrôle et les dépendances génétiques de la mort cellulaire induite par les médicaments ont tendance à être difficiles à résoudre dans les données de profilage chimiogénétique. Il y a plusieurs raisons à ce problème, mais beaucoup d’entre elles découlent de l’impact de la variation de la prolifération cellulaire4. Par exemple, parce que les cellules prolifèrent de manière exponentielle, l’effet d’une perturbation génétique sur le taux de prolifération a un impact plus important sur la taille de la population que la modification des taux de mortalité cellulaire. De plus, parce que cette sensibilité biaisée est exacerbée avec le temps et que ces expériences sont généralement réalisées sur plusieurs semaines, la plupart des études sont optimisées pour être très sensibles aux défauts de prolifération et essentiellement insensibles aux changements dans la mort cellulaire induite par les médicaments. D’autres problèmes liés à la prolifération comprennent la coordination variée entre la prolifération et la mort (p. ex., à quelle vitesse chaque clone se développe-t-il pendant qu’il meurt, et cela varie-t-il entre les perturbations génétiques) et les variations des taux de prolifération pour chaque clone en l’absence de médicament, ce qui modifie le nombre prévu de cellules qui auraient dû ou auraient pu être récupérées si le médicament n’avait pas été efficace. En fin de compte, les expériences de profilage chimio-génétique notent généralement l’impact des perturbations génétiques à l’aide de mesures proportionnelles à la taille relative des populations, en comparant les populations traitées et non traitées. Parce que la taille de la population est le produit à la fois de la croissance cellulaire et des taux de mort cellulaire, du point de vue de la mort cellulaire, la prolifération représente une influence confondante.

Pour remédier à ces problèmes, nous avons créé une méthode d’évaluation de la mort à l’aide d’une approche assistée par simulation (MEDUSA)5. MEDUSA interprète les données relatives sur la taille de la population observée à l’aide de simulations informatiques afin de déduire la combinaison de la croissance et des taux de mortalité induits par les médicaments qui a généré la réponse médicamenteuse observée pour chaque clone génétique. Des données antérieures suggèrent que la méthode peut déduire avec précision comment les perturbations génétiques affectent le taux de mortalité induite par le médicament, mais la précision de cette méthode dépend d’une compréhension détaillée de la façon dont la prolifération cellulaire et la mort cellulaire sont coordonnées par un médicament et comment ces taux varient dans le temps 5,6. De plus, les inférences basées sur MEDUSA nécessitent qu’un médicament soit testé à une dose qui provoque une mort cellulaire importante. Il est important de noter que ces conditions de traitement créent des préoccupations supplémentaires concernant la taille de la population de départ et la durée des essais, qui doivent être soigneusement prises en compte et optimisées. Dans ce protocole, nous décrivons comment mettre en place une étude de profilage chimio-génétique pour l’analyse basée sur MEDUSA et fournissons une utilisation détaillée de cette méthode analytique. L’objectif global de MEDUSA est de déterminer l’impact de chaque délétion de gène sur les taux de croissance et de mortalité induits par les médicaments.

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Protocole

1. Optimisation de la dose de médicament pour induire la mort cellulaire

REMARQUE : Le protocole ci-dessous permet d’optimiser une combinaison de lignée cellulaire, de médicament et de dose à l’aide du test FLICK 7,8. Les données d’exemple pour ce protocole décrivent l’optimisation et le criblage de l’étoposide 5 μM dans les cellules U2OS, mais les mêmes étapes d’optimisation pourraient être appliquées à toute autre combinaison souhaitée de lignée cellulaire et de médicament/dose. Ce protocole ne nécessite pas le prélèvement ou l’analyse de cellules mortes. Ce protocole peut être utilisé pour les cultures en suspension, à condition d’éliminer les cellules mortes. Pour les cultures en suspension, les cellules mortes peuvent être triées/séparées à l’aide d’un marqueur de viabilité ou d’un marqueur spécifique de la mort cellulaire.

  1. Avant d’effectuer un test FLICK, optimisez le nombre de cellules, la perméabilisation de Triton-X, la concentration de SYTOX et les paramètres d’acquisition du lecteur de plaques à l’aide du protocole détaillé décrit aupoint 8.
  2. Cellules de plaque en plaques noires, à fond transparent de 96 puits. Les densités d’ensemencement typiques sont de 1500 à 5000 cellules par puits, et ce nombre doit être optimisé par lignée cellulaire. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 et d’humidité pendant 16-24 h.
  3. Préparer les dilutions du médicament dans des milieux contenant la concentration de SYTOX qui a été identifiée comme optimale à l’étape (1.1). Les médicaments sont généralement testés sur une série de dilutions logarithmiques contenant 8 à 12 doses biologiquement ou cliniquement pertinentes.
    REMARQUE : Certains médicaments peuvent émettre une fluorescence à la même longueur d’onde que SYTOX, ce qui rend la quantification avec ce test impossible. Dans de tels cas, l’utilisation de variants SYTOX qui émettent de la fluorescence à différentes longueurs d’onde peut être bénéfique. De plus, ce test ne peut pas évaluer la réaction aux médicaments qui affectent la fluorescence de SYTOX ou empêchent SYTOX de se lier à l’ADN.
  4. Lyser une plaque (T0) à l’aide de Triton-X à la concentration optimisée à l’étape (1.1). Après la lyse cellulaire, à l’aide d’un lecteur de plaques, mesurer la fluorescence de SYTOX et déterminer le nombre total de cellules de départ en fonction de la relation empiriquement établie entre la fluorescence et le nombre de cellules (voir protocole FLICK 7,8).
  5. Mesurer la fluorescence de SYTOX dans les plaques expérimentales à T0 à l’aide d’un lecteur de plaques, avec des réglages optimisés à l’étape (1.1).
  6. Surveillez le signal SYTOX au fil du temps pendant trois jours. Pour contraindre les données cinétiques résultantes, utilisez au moins trois points de temps par jour, tous espacés de 4 heures.
    REMARQUE : Ce protocole évalue la mort et la croissance cellulaires sur 3 jours. Cette durée est généralement suffisante pour les drogues causant la mort ; Cependant, le test peut être raccourci ou allongé pour s’adapter aux médicaments ayant une cinétique de mort alternée.
  7. Après le dernier point temporel, lysez la ou les plaques expérimentales avec Triton-X pour déterminer la taille finale de la population de chaque condition.
  8. Calculer la viabilité fractionnelle (FV) et ajuster les données du paramètre aux courbes de dose, comme décrit dans le protocole FLICK 7,8.
  9. Identifiez les doses de médicaments qui induisent environ 50 % de mort cellulaire en évaluant les courbes de dose de FV.
    REMARQUE : L’identification des cellules mortes par SYTOX nécessite à la fois la rupture de la membrane plasmique et la dégradation de l’enveloppe nucléaire. Ces membranes ont besoin d’un entretien continu, de sorte que SYTOX identifiera les cellules mortes quel que soit le mécanisme de mort cellulaire induit par le médicament. Cependant, ces processus ne se produisent pas avec la même efficacité pour toutes les formes de mort cellulaire, ce qui pourrait influencer la capacité de SYTOX à mesurer avec précision les cellules mortes. De plus, différents mécanismes de mort cellulaire produiront des cadavres cellulaires de stabilités variables. Cependant, nous avons constaté que toutes les formes de mort cellulaire testées jusqu’à présent aboutissent à un ADN lié à SYTOX (soit à l’intérieur d’un noyau perméabilisé, soit dans le milieu de culture cellulaire). Ce signal SYTOX est généralement stable tout au long d’un test de 72 heures, mais peut être surveillé en évaluant le nombre total de cellules au début et à la fin du test.

2. Sélection de la longueur du test

  1. À l’aide des données FLICK recueillies à l’étape 1, calculez la fraction létale (FL) de chaque affection au fil du temps, comme décrit dans le protocole FLICK 7,8. Ajustez les données LF cinétiques à un modèle de mort exponentielle décalée (LED), comme décrit précédemment9.
  2. Tracer la LF dans le temps pour chaque dose létale identifiée à l’étape 1. Sélectionnez une dose et un point temporel qui produisent ~50 % LF.
    REMARQUE : Une fraction létale de ~50 % enrichit les signaux forts et spécifiques à la mort dans les données de criblage CRISPR tout en laissant suffisamment de cellules vivantes pour maintenir la représentation de la bibliothèque5. Cependant, certains médicaments seront limités par la jurisprudence ou une gamme étroite de doses qui induisent un phénotype spécifique souhaité. Si la dose est restreinte, le critère d’évaluation du test doit être raccourci ou prolongé pour s’assurer que la dose souhaitée atteint ~50 % de LF. Si une létalité de 50 % n’est pas possible, il peut être nécessaire d’augmenter la taille de la population de départ.

3. Détermination de la taille de la population de départ

  1. Sélectionnez la dose de médicament souhaitée pour optimiser davantage le dépistage en fonction de l’optimisation ci-dessus.
  2. Plaquez les cellules sur des plats de 10 cm en support complet. Chaque condition doit être recouverte de triplets techniques et d’un nombre suffisant de répétitions biologiques pour que les cellules puissent être comptées toutes les 12 à 24 heures sur toute la longueur de l’écran, y compris le point temporel T = 0.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’optimiser séparément le nombre de cellules non traitées et les cellules traitées, compte tenu du taux de croissance net de la population et de la taille des cellules. Les cellules doivent généralement être plaquées à des densités qui entraînent une confluence qui ne compromet pas la santé cellulaire au point final de l’essai (c.-à-d. pour de nombreux types de cellules < 80 % de confluent). Les cellules traitées et non traitées peuvent également être replaquées pendant l’écran, si nécessaire, tant que la représentation de la bibliothèque est maintenue.
  3. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
  4. Ajouter le médicament à la concentration désirée dans les plaques de traitement. En parallèle, prélevez des cellules sur 3 plaques non traitées et comptez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre. Colorez les cellules mortes avec du bleu trypan (ou un colorant de viabilité comparable) pour vous assurer que seules les cellules vivantes sont comptées. Ces données établissent le nombre de cellules au point temporel T = 0.
  5. Après 12 à 24 h, prélevez des cellules sur 3 plaques non traitées et 3 plaques traitées et comptez le nombre de cellules vivantes. Répéter la récolte jusqu’à ce que le point final de l’essai soit atteint. Pour bien comprendre la cinétique du médicament et de la mort cellulaire, il est recommandé de surveiller les cellules vivantes pendant 24 à 48 heures après le point temporel identifié à l’étape (2.2).
  6. Visualisez les changements de viabilité en traçant la taille de la population (axe des y) au fil du temps (axe des x).
    REMARQUE : D’après le nombre maximal de cellules observées et la taille finale de la population, il est possible de faire une estimation approximative de la fraction létale au point final. Ces données doivent être comparées aux données de viabilité fractionnelle et de fraction létale générées à l’aide du test FLICK (étapes 1.9 et 2.2) pour s’assurer que le degré attendu de mort cellulaire est atteint.
  7. Identifiez le point temporel avec la plus petite taille de population. En fonction de la quantité de croissance qui se produit en présence du médicament, ce sera au début ou à la fin de l’écran CRISPR.
  8. Sélectionnez une taille de population de départ. Assurez-vous que le nombre de cellules de départ est optimisé pour maintenir une couverture de bibliothèque minimale de 500x-1000x sur l’ensemble de l’écran.
    REMARQUE : Par exemple, la banque TKOv3 contient 70 948 ARNsg. Pour représenter cette bibliothèque à une couverture de 500x, pas moins de 35 474 000 cellules par réplication et par condition doivent être maintenues tout au long du test. Cette taille de population de goulot d’étranglement est souvent rencontrée au début de l’essai ou après la trypsinisation et le sous-échantillonnage pour des conditions non traitées ou proliférantes. En revanche, la taille de la population du goulot d’étranglement est souvent dictée par la taille de la population au point final du test pour les traitements médicamenteux qui induisent une létalité substantielle.
  9. Si vous le souhaitez, répétez l’optimisation ci-dessus sur les plaques qui seront utilisées pour l’écran CRISPR (par exemple, des plaques de 15 cm) pour confirmer que l’efficacité du médicament est correctement évaluée.

4. Réalisation d’un écran CRISPR

REMARQUE : Les cellules peuvent être criblées à l’aide de méthodes de criblage CRISPR établies après optimisation de la dose de médicament et de la durée du test. Les protocoles établis, tels que le protocole de criblage TKO du laboratoire Moffat10,11, peuvent être utilisés pour préparer la banque de criblage CRISPR, produire des virus, effectuer le criblage CRISPR et préparer les banques pour le séquençage (Figure 1A-B). Le protocole ci-dessous décrit les étapes spécifiques à l’analyse MEDUSA, qui doit être effectuée sur des données au niveau du comptage après séquençage.

  1. Calculez les changements de pliage observés expérimentalement pour chaque ARNsg (Figure 1C) comme décrit ci-dessous.
    1. Générez une table de comptage au niveau de l’ARNsg pour préparer les données de séquençage pour l’analyse. Découpez et mappez les bibliothèques de séquençage à l’aide de pipelines standard, comme décrit 5,12.
    2. Normalisez la profondeur de la bibliothèque de séquençage. Normalisez les bibliothèques manuellement ou à l’aide de fonctions intégrées telles que celles de DESeq2, comme dans 5,12. Effectuez une normalisation par rapport à tous les guides ou en utilisant la distribution des guides non ciblés.
    3. Attribuez au hasard des ARNsg non ciblés à des gènes non ciblés. Par exemple, une bibliothèque avec quatre ARNsg par gène devrait avoir quatre ARNsg non ciblés par gène non ciblant.
    4. Pour chaque comparaison d’intérêt (non traitée/T0 et/ou traitée/non traitée), calculez le log2 (fold-change). Il est recommandé de le calculer à l’aide d’un ajustement paramétrique dans DESeq2, bien qu’un calcul manuel du changement de pli puisse également être effectué.
    5. Coupez les ARNsg avec un faible nombre de comptes. La bonne stratégie de découpage dépendra du niveau de bruit entre les répétitions et de la façon dont il varie au fil des comptes. Ces fonctionnalités varieront en fonction de la bibliothèque CRISPR et testeront plusieurs coupures en parallèle pour de nouvelles données. Les stratégies de coupure courantes fondées sur les précédents de la littérature comprennent l’élimination des 5 % inférieurs des guides ou le retrait des guides en dessous d’un certain seuil nominal13.
  2. Déterminez l’impact de l’inactivation de chaque gène sur le taux de croissance comme décrit ci-dessous.
    1. Calculer le taux de croissance nette de la population (NPG) des cellules non traitées (c.-à-d. le temps de doublement de la population observé, figure 1D). Cela peut être extrait des données FLICK à l’étape 1, du nombre de cellules vivantes au fil du temps à l’étape 3 ou des mesures expérimentales antérieures pour la lignée cellulaire d’intérêt.
    2. MEDUSA nécessite trois paramètres pour modéliser l’état non traité : NPG : Taux de croissance nette de la population, en doublements/h ; T start : Point de départ en h. La valeur par défaut est 0 ; Tendunt : Point temporel final pour l’état non traité, en h.
    3. Simulez toutes les perturbations possibles du taux NPG. Utilisez une boucle for pour évaluer une plage de valeurs NPG possibles. Pour chaque taux de croissance relatif, calculer le log2 (changement de multiplication) qui serait observé au point final de l’essai.
    4. Pour chaque ARNsg expérimental à l’étape 4.1.5, identifier le changement de pli simulé le plus proche des données observées. Attribuez le taux de croissance relatif qui a entraîné le changement de pli simulé à cet ARNsg.
  3. Caractérisez la coordination entre la croissance et la mort comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Les paramètres requis pour MEDUSA peuvent être extraits de données de type FLICK lorsqu’ils sont analysés avec la méthode d’analyse GRADE14. Les données de (1) et (2) peuvent être utilisées à cet effet, ou une expérience de paramétrage supplémentaire peut être effectuée.
    1. MEDUSA utilise quatre paramètres pour caractériser la coordination entre la croissance et la mort en présence de médicament : GRmédicament1 : Taux de croissance induit par le médicament avant le début de la mort, en doubles/h ; DO : Temps d’apparition de la mort, en h ; Médicament GR2 : Taux de croissance induit par le médicament après le début de la mort, en doubles/h ; Médicament RD : Taux de mortalité induit par le médicament, en unités de fraction létale/h. Pour paramétrer DO, utilisez la cinétique LF. Extrayez le temps d’apparition de la mort à partir de l’ajustement de la LED.
  4. Déterminer lemédicament DR à l’aide de la cinétique LF. Déterminez le taux de mortalité moyen en divisant la LF finale par le temps qui suit le début du décès (en h).
  5. Déterminez lemédicament GR1 à partir des données de comptage des cellules vivantes à l’étape 3. Avant le début de la mort, déterminez le taux de croissance induit par le médicament en ajustant les données à une équation exponentielle simple.
    1. Déterminerle RG médicament2 à l’aide d’une combinaison de données de l’étape 3 et du médicament GRADE14. Calculez et tracez le GRADE pour la dose de médicament sélectionnée sur un graphique GRADE. Si GRADE = 0, supposer que GRdrug2 est égal à 0 ; Si GRADE > 0, utilisez GRADE pour déterminer le taux de croissance moyen de la population. Sur la base de la valeur déterminée expérimentalement pourle médicament GR1, déterminez la valeur pour lemédicament GR2 qui donne le taux de croissance moyen observé.
      REMARQUE : Le taux de croissance moyen induit par le médicament peut être déduit d’un graphique GRADE en calculant la distance par paire entre le point de données observé (c’est-à-dire une paire de données RG et FV pour un médicament) et chaque point qui compose l’espace GRADE et en identifiant le point le plus proche. Pour des instructions détaillées, voir réf14. Les taux de croissance et de mortalité induits par les médicaments ne sont pas des valeurs fixes par médicament et sont spécifiques à un médicament à une dose donnée dans un contexte cellulaire donné.
  6. Générez des changements de pli simulés pour toutes les combinaisons possibles de taux de croissance et de taux de mortalité, comme décrit ci-dessous.
    1. À l’aide de la coordination expérimentale du taux de croissance et du taux de mortalité induits par les médicaments, construisez un modèle qui simule la taille de la population induite par les médicaments au fil du temps (figure 1D). Ce modèle peut être construit comme une fonction par pièce qui combine deux phases indépendantes de la réponse médicamenteuse (avant et après la mort).
    2. Pour un modèle MEDUSA complet, incluez ces huit paramètres : NPG : Taux de croissance nette de la population, en doubles/h ; RG drug1 : Taux de croissance induit par le médicament avant le début de la mort, en doubles/h ; DO : Temps d’apparition de la mort, en h ; Médicament GR2 : Taux de croissance induit par le médicament après le début de la mort, en doubles/h ; Médicament RD : Taux de mortalité induit par le médicament, en unités de fraction létale/h ; T start : Point de départ en h. La valeur par défaut est 0 ; Tendunt : Point temporel final pour l’état non traité, en h ; Tendtr : Point temporel final pour l’état traité, en h.
    3. Pour le modèle de base, simulez toutes les perturbations possibles du taux de croissance et de mortalité. Pour chaque combinaison, calculez le log2(fold-change) qui serait observé.
      REMARQUE : Dans MEDUSA, les perturbations du taux de croissance sont supposées être proportionnelles entre NPG, GRmédicament1 etGR médicament2. Par exemple, une réduction de 80 % du taux de NPG entraîne également une réduction de 80 % des taux de croissance induits par les deux médicaments.
  7. Déduisez le taux de mortalité de chaque KO (Figure 1D-E) comme décrit ci-dessous.
    1. Pour chaque ARNsg, triangulez le taux de mortalité induit par le médicament qui aurait produit le changement de pli observé. Tout d’abord, extrayez le taux de croissance relatif déterminé à l’étape (4.2.4).
    2. Déterminer les doses pourle médicament RG1 et lemédicament RG2. Appliquez le taux de croissance relatif de NPG pour calculer un taux de croissance proportionnel pourGR drug1/GR drug2.
    3. En utilisant les contraintes de NPG, GRmédicament1 et GRmédicament2, identifiez le changement de pli simulé le plus proche du changement de pli observé pour chaque ARNsg (traité/non traité). Utilisez une combinaison de ces observations pour recalculer le taux de mortalité induite par la drogue.
  8. Calculez les taux de croissance et les taux de mortalité au niveau des gènes comme décrit ci-dessous.
    1. Déterminez les taux au niveau des gènes pour chaque gène de la bibliothèque. Calculez la moyenne de chaque taux de croissance et de mortalité pour tous les ARNsg associés à un gène donné (généralement 4-10).
    2. Pour calculer des valeurs p empiriques, amorcez les données au niveau de l’ARNsg. Effectuez une correction FDR avec la procédure Benjamini-Hochberg.
      REMARQUE : Des instructions complémentaires, ainsi que des exemples de données pour l’analyse des données de criblage CRISPR à l’aide de MEDUSA, sont inclus dans notre référentiel GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

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Résultats

À l’aide de ce protocole, nous avons exploré les dépendances génétiques de la mort induite par l’étoposide dans les cellules U2OS. L’étoposide est une chimiothérapie qui endommage l’ADNcouramment utilisée 15. Cette expérience de profilage chimio-génétique a été réalisée à l’aide de la banque GeCKOv216 dans Cas9 exprimant les cellules U2OS5. Dans ces types d’expériences, la fonction du gène est généralement déduite de l’abondance relative d’un clone k...

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation de la méthode analytique MEDUSA pour quantifier les données de profilage chimio-génétique afin de déterminer comment les perturbations génétiques modifient les taux de croissance et de mortalité induits par les médicaments. Étant donné que le résultat principal d’une expérience de profilage chimiogénétique est lié à la taille de la population, et non aux taux, les taux sous-jacents sont déduits à l’aide de simulations. Ainsi, les étapes cri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du Lee Lab, anciens et actuels, pour leurs contributions au point de vue de notre laboratoire sur l’évaluation des réponses aux médicaments. Ce travail a été soutenu par le financement du MJL et du MEH par les National Institutes of Health (U01CA265709, R21CA294000 et R35GM152194 au MJL, et F31CA268847 au MEH), le financement du MJL par la Fondation Jayne Koskinas Ted Giovanis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012924Pour la croissance des cellules et l’optimisation de la taille de la population
150mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012925Pour la croissance des cellules et l’optimisation de la taille de la population
DESeq2R Packagev1.44.0Pour le calcul du DMEM à changement de pliage
Corning10017CVPour l’ensemencement et la pharmacie cellules
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCPour l’ensemencement et le traitement des cellules
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher ScientificFB012932Pour l’ensemencement et le traitement des cellules (pin plate)
Greiner Bio-One  ; CELLSTAR &mu ; Greiner à microplaques à fond plat transparent 96 puits, traité par culture cellulaire,655090Pour l’ensemencement et le traitement des cellules
MATLABMathworks  ;R2024aPour effectuer FLICK, GRADE et MEDUSA
Lecteur de fluorescence de microplaquesTecanSparkPour les mesures de cellules mortes
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Pour les mesures de cellules mortes
TKOV3 Bibliothèque CRISPRAddgene125517Pour réaliser un écran CRISPR
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APPour la perméabilisation des cellules
Trypan bleu  ;CorningMT25900CIPour mesurer les cellules vivantes/mortes

Références

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