Administration d’anesthésiques volatils à des larves de poisson-zèbre pour l’observation comportementale

Résumé

Ce protocole présente une méthode accessible pour créer un environnement étanche aux gaz afin d’administrer des anesthésiques volatils aux larves de poisson-zèbre pour des expériences comportementales.

Résumé

Cette étude décrit une méthode unique d’administration d’anesthésiques volatils, tels que l’isoflurane et le sévoflurane, aux larves de poisson-zèbre au cours d’expériences comportementales. Bien que le poisson-zèbre offre de nombreux avantages en tant qu’organisme modèle de vertébré - y compris des comportements complexes, une traçabilité génétique, des embryons transparents et un développement rapide - leur utilisation dans l’étude des anesthésiques volatils a été limitée. L’administration d’anesthésiques volatils nécessite souvent des appareils complexes ou encombrants qui peuvent ne pas être largement accessibles, créant des obstacles à l’étude pharmacologique des anesthésiques volatils dans des organismes modèles aqueux. Cette méthode présente une technique simple utilisant des feuilles de silicone adhésives pour créer un joint étanche au gaz sur des plaques de verre à 96 puits. La validation a été effectuée par l’évaluation du mouvement spontané, qui n’a montré aucune différence significative entre les puits scellés et ouverts sur une période de 90 minutes. De plus, la concentration de l’anesthésique est restée stable au fil du temps, telle que mesurée par HPLC. Les résultats représentatifs comprennent la détermination expérimentale des valeurs de concentration efficace médiane (EC₅₀) pour le sévoflurane. Cette étude fournit une approche simple et accessible pour les expériences pharmacologiques utilisant des anesthésiques volatils, qui peut être facilement adaptée pour étudier d’autres agents volatils et paramètres expérimentaux.

Introduction

Les modèles d’animaux non aquatiques (vers, mouches, rongeurs, lapins, primates, etc.) ont toujours été les modèles les plus couramment utilisés pour étudier la pharmacologie anesthésique. Chez chacune de ces espèces, les anesthésiques volatils (administrés par inhalation de gaz) sont beaucoup moins difficiles que l’administration d’anesthésiques intraveineux (administrés par voie intraveineuse ou intrapéritonéale)¹. En plus du défi technique que représente la simple administration des médicaments par voie intraveineuse, il est beaucoup plus facile d’obtenir un état d’anesthésie stable avec des agents volatils qu’avec des agents intraveineux².

L’administration d’anesthésiques par voie intraveineuse aux espèces aquatiques larvaires peut être réalisée par diffusion à partir du milieu aqueux environnant ^3,4, et s’apparente donc davantage à l’administration d’anesthésiques volatils pour les espèces non aqueuses. Pendant de nombreuses années, les têtards (Xenopus laevis) ont été le modèle de choix pour l’étude des anesthésiques en raison de la facilité d’administration des médicaments et de la pharmacocinétique à l’état d’équilibre obtenue par simple ajout de l’anesthésique dans un bain à l’eau de leur étang artificiel ^5,6. Cependant, il y a relativement peu d’exemples d’étude des anesthésiques volatils dans ce modèle en raison de la nécessité d’appareils étanches aux gaz qui sont souvent spécialement conçus et peuvent être lourds à utiliser ^7,8.

Ces dernières années, le poisson-zèbre est devenu un modèle privilégié pour l’étude des anesthésiques intraveineux en raison de la même facilité d’administration des médicaments en plus d’autres avantages tels que leurs comportements complexes bien décrits et la disponibilité d’unités commerciales pour observer ces comportements⁹. De nombreuses études récentes ont utilisé de telles unités d’observation disponibles dans le commerce pour dépister les composés neuroactifs, y compris les anesthésiques, en utilisant des formats de plaques à 96 puits et à 24 puits pour quantifier le comportement des larves de poisson-zèbre 4,10,11,12,13,14,15 . Les stades larvaires sont particulièrement bien adaptés aux études pharmacologiques en raison de leur capacité à évaluer de nombreuses réponses comportementales, de leur petite taille, de leur compatibilité à haut débit et de leurs circuits neuronaux bien caractérisés ^9,16,17. Cependant, une limitation importante de ces études sur les anesthésiques dans le modèle du poisson-zèbre est la difficulté relative d’administrer des anesthésiques volatils. Cette limitation a conduit à de rares exemples de comparaison entre les agents volatils et intraveineux ^4,15,18. La possibilité d’étudier et de comparer facilement les deux classes d’anesthésiques dans un seul modèle animal ajoute un outil important pour faciliter l’étude de la pharmacologie anesthésique dans toutes les classes.

Traditionnellement, l’étude des anesthésiques intraveineux chez une espèce aquatique nécessite un équipement spécialisé, souvent personnalisé, qui peut être difficile à utiliser ou ne pas être suffisamment étanche aux gaz pour empêcher la perte de l’anesthésique pendant la durée de l’expérience. La procédure décrite ici présente un moyen alternatif facilement accessible de produire un joint étanche aux gaz dans une chambre en verre qui convient à l’observation du comportement des larves de poisson-zèbre à l’aide d’une unité d’observation commerciale (voir le tableau des matériaux).

Protocole

Toutes les expériences sur le poisson-zèbre ont été menées conformément aux protocoles d’utilisation des animaux approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les poissons-zèbres adultes ont été maintenus dans l’installation aquatique de l’Université de Pennsylvanie sous la supervision de l’University Laboratory Animal Resources (ULAR). Les poissons-zèbres sauvages à longues nageoires de Tübingen ont été élevés en interne pour toutes les expériences et maintenus dans des conditions d’élevage standard avec un cycle lumière/obscurité de 13/11 h jusqu’à ce qu’ils atteignent 5 jours après la fécondation (dpf). Les expériences ont été menées à l’aide de réplicats biologiques, avec des couvées dérivées de couples d’accouplement distincts pour assurer une diversité biologique adéquate. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Fabrication de feuilles de silicone adhésives

REMARQUE : Les équivalents de ce matériau (feuille de silicone et adhésif) peuvent être d’origine commerciale, mais souvent à un coût plus élevé et une disponibilité moindre.

1. Disposez la feuille de silicone de 0,5 mm sur une surface propre et plane.
2. Inspectez les feuilles pour détecter tout pli et évitez-les dans la mesure du possible.
   REMARQUE : Les feuilles de silicone avec des plis peuvent ne pas adhérer adéquatement au ruban et peuvent entraîner une étanchéité inadéquate des puits et/ou une mauvaise visualisation du poisson-zèbre.
3. Nettoyez les feuilles avec de l’alcool à 70 % pour enlever l’huile ou les débris et laissez-les sécher.
4. À l’aide d’un applicateur, tel qu’un pinceau, appliquez une couche mince et uniforme d’apprêt adhésif sur la feuille de silicone. Pour éviter une application excessive, travaillez par sections plus petites car le promoteur de colle sèche rapidement (durcit en 1 à 5 s).
   REMARQUE : Sans ce promoteur d’adhérence, le ruban n’adhérera pas correctement à la feuille de silicone.
5. Une fois le promoteur d’adhésif appliqué, alignez le ruban adhésif double face avec la feuille de silicone avec le support en papier vers le haut.
6. Appliquez progressivement le ruban sur le silicone à l’aide d’un rouleau pour lisser la surface et éliminer les bulles d’air (après l’application initiale, le travail du côté silicone vers le haut aidera à visualiser et à éliminer les bulles d’air).
7. Laisser le promoteur de l’adhésif durcir complètement pendant 24 h sur une surface plane.
8. Coupez le silicone adhésif en bandes d’au moins 10 mm de large (7,5 mm de diamètre de puits plus chevauchement de chaque côté).
   REMARQUE : Lorsque vous utilisez une rangée sur deux de la plaque de puits, une plus grande variance des bandes n’aura pas d’impact négatif sur les puits des rangées adjacentes, ce qui peut non seulement faciliter l’application, mais aussi être nécessaire pour obtenir une étanchéité sur toute la circonférence du puits.
   1. Assurez-vous que les bandes sont suffisamment longues pour couvrir au moins la largeur d’une rangée de la plaque de puits.
      REMARQUE : Si vous utilisez une plaque de puits qui n’est pas de 96 puits, telle qu’une plaque de 24 puits ou de 48 puits, les tailles de bande peuvent être ajustées ou coupées pour s’adapter aux dimensions spécifiques de la plaque, assurant ainsi une couverture appropriée quelle que soit la taille de la plaque.

2. Préparation des solutions

REMARQUE : Toutes les solutions mères et d’essai d’anesthésiques volatils ont été préparées juste avant l’expérience pour éviter la perte de concentration des composés volatils.

1. Pour chaque solution (mère ou solution de travail), ajoutez un volume de solvant non volatil (eau d’embryon E3, DMSO, etc.) à un flacon HPLC ou à scintillation qui, combiné à la dilution finale de l’anesthésique volatil, remplira suffisamment le flacon en laissant un espace libre minimal (voir Figure 1A).
2. Ajoutez un anesthésique volatil à l’aide d’une seringue étanche au gaz Hamilton et scellez rapidement le flacon.
   REMARQUE : Des solutions mères dans des flacons avec des couvercles de septum peuvent être utilisées pour faciliter les dilutions ultérieures via le transfert de la solution avec des seringues étanches aux gaz.
3. Ensuite, mélangez les flacons (vortex, sonication) au besoin et stockez-les temporairement pendant la préparation des assiettes de poisson-zèbre.

3. Mise en place de l’expérience comportementale

REMARQUE : Cette étape du protocole peut demander un peu de pratique. Il est recommandé de travailler sans poissons ou solutions contenant des matériaux précieux jusqu’à ce qu’ils soient à l’aise avec la technique.

1. Transférez une larve de poisson-zèbre (5 dpf) dans toutes les autres rangées de la plaque de verre à 96 puits.
   REMARQUE : Le fait de laisser une rangée sur deux vide permet de réduire le risque de contamination des puits adjacents par débordement, car les puits sont scellés à l’étape 3.4.
2. Retirez délicatement la solution E3 de chaque puits. Cela peut être fait une rangée à la fois ou sur toute la plaque s’il est capable de travailler rapidement.
   REMARQUE : La durée pendant laquelle les larves sont sorties de la solution a été réduite au minimum afin de réduire le stress potentiel. D’autres procédures peuvent être utilisées en fonction de différents besoins expérimentaux, y compris l’élimination partielle de la solution avant l’ajout de la solution contenant le médicament pour minimiser le stress. Le protocole doit être adapté pour répondre aux besoins de l’expérience, y compris le temps d’équilibrage accordé aux animaux pour compenser tout stress potentiel, l’efficacité du mélange de la solution et la précision des concentrations d’une solution contenant du médicament, si la totalité de l’E3 n’est pas éliminée avant l’ajout de la solution de travail.
3. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour remplir chaque puits de la rangée avec la solution expérimentale. Veillez à ne pas introduire de bulles. Remplissez trop chaque puits (figure 1B).
4. À l’aide des bandes de silicone adhésives fabriquées à l’étape 1, appuyez rapidement sur la bande vers le bas (Figure 1C). Cela permet d’éviter la formation de bulles et d’empêcher les poissons de déborder dans les puits adjacents.
5. Appuyez fermement sur le dessus de la plaque pour vous assurer que chaque puits est scellé.
6. Répétez les étapes 2 à 5 jusqu’à ce que la solution soit remplacée et que les puits de chaque rangée sur deux de la plaque de puits soient scellés (figure 1D).
7. Retournez doucement la plaque et vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air.
   REMARQUE : La présence de bulles d’air obscurcira la visualisation du mouvement du poisson-zèbre.
8. Placez la plaque dans l’unité d’observation du comportement (adhésif silicone vers le bas) et effectuez l’expérience comportementale (voir la section Résultats pour plus de détails).

Résultats

Comparaison avec l’observation traditionnelle en puits ouverts
Afin d’évaluer si l’étanchéité adhésive a un effet sur les mouvements spontanés, une comparaison a été faite entre les témoins dans les puits ouverts et les puits scellés. Comme le montre la figure 2A, aucune différence statistiquement significative dans le mouvement n’a été observée entre ces groupes pour la durée standard de ~30 minutes utilisée dans les expériences décrites dans cet article. Reconnaissant q...

Discussion

Cet article décrit une méthode permettant d’administrer facilement des anesthésiques volatils, comme le sévoflurane, aux larves de poisson-zèbre, qui a été utilisée pour quantifier le pouvoir anesthésique volatil chez les poissons de type sauvage. Bien que cette technique soit simple sur le plan conceptuel, il faut de la pratique pour assurer une rangée de puits correctement scellée et sans bulles dans un court laps de temps afin de minimiser la perte d’agents volatils. Étant donné que c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microplaques en verre à 96 puits	Zinsser Amérique du Nord	3600500	« Ces microplaques de verre sont fabriquées à partir de verre borosilicate spécial de haute pureté et résistant à la température, et les surfaces sont polies à l’acide. Les plaques sont rectangulaires dans l’empreinte standard des microplaques SBS (85 x 127 mm). Ces microplaques de réacteur en verre sont conçues principalement pour être utilisées dans des applications chimiques et résistent à des températures allant jusqu’à 530° ; C. Ils peuvent être autoclavés. Ils sont usinés à partir d’une feuille de verre homogène et présentent une géométrie et une forme uniformes pour fournir des températures constantes d’un puits à l’autre (à moins de 0,2 degré C typiquement).
Flacons transparents de 2,0 ml, grande ouverture, filetage de 9 mm.	Chemglass Sciences de la vie	Référence : CV-1150-1232	« Avec une ouverture 40 % plus grande, ces flacons sont spécialement conçus pour fonctionner dans des échantillonneurs automatiques à bras robotisé. Ils intègrent également la conception unique du flacon étagé qui centre avec précision un insert de volume limité dans le col du flacon. "
Ruban adhésif double face 3M 9490LE	AbbVie Inc	Réf. 24WG90	« Le ruban double face 9490LE 3M avec adhésif de laminage 3M 300LSE offre une force d’adhérence élevée sur la plupart des surfaces, y compris de nombreux plastiques à faible énergie de surface tels que le polypropylène et les peintures enduites de poudre. L’adhésif acrylique offre également une excellente adhérence aux surfaces légèrement contaminées par de l’huile généralement utilisée avec les pièces de machines. Le ruban double face 9490LE de 3M offre la caractéristique supplémentaire de l’adhésif de laminage 300MP 3M d’un côté pour offrir une excellente force d’adhérence à une variété de matériaux en mousse et en tissu (6 po x 5 vg).
Chambre d’observation DanioVision	Noldus	DVOC-0041	« DanioVision est un système complet, conçu pour les tests à haut débit de larves de poisson-zèbre dans des plaques multi-puits. Il comprend la chambre d’observation et le célèbre logiciel de suivi vidéo EthoVision XT.
Unité de contrôle de la température DanioVision	Noldus	DVTCU-0011	« L’unité de contrôle de la température DanioVision est un système à flux continu : l’eau s’écoule uniformément sous la plaque du puits à la température de votre choix. La température est la même sur toute la plaque du puits.
Logiciel Ethovision XT16	Noldus	NSE-EV-BASE	« EthoVision XT est le logiciel de suivi vidéo le plus largement utilisé qui suit et analyse le comportement, le mouvement et l’activité de tout animal, marque déposée par Noldus »
L’isoflurane	Soins intensifs Piramal	CDN # 66794-017-10	Liquide pour inhalation, un anesthésique d’inhalation non explosif ininflammable, contenant 100 mL d’isoflurane. Stocké à température ambiante contrôlée 20º ; à 25º ; C
Scotch-Weld Apprêt adhésif instantané AC79 transparent	3M	« 62-3916-0860-1 (ID du produit) C2103N (Lot) »	« L’apprêt adhésif instantané 3M Scotch-Weld AC79 est conçu pour être utilisé sur des élastomères à faible énergie de surface difficiles à coller, tels que l’EPDM, le silicone et d’autres caoutchoucs. La préparation et l’application de la surface sont simples et l’apprêt adhésif sèche rapidement pour que les travaux se déroulent rapidement.
Feuilles de silicone de 0,5 mm d’épaisseur	Fournisseurs variés	N/A	Des feuilles de silicone translucides ont été achetées auprès de plusieurs fournisseurs
Speedball Pop-in Hard Rubber Brayer avec cadre en plastique, 4 pouces"	Speedball	793728	"Le Speedball Pop-In Hard Brayer est doté d’un rouleau qui s’enclenche pour un nettoyage facile. Cadre en plastique d’une seule pièce avec rouleau amovible de 4 pouces de large. Fabriqué à partir de caoutchouc de gomme naturel pur avec une finition rectifiée. Le brayeur en caoutchouc dur mesure 4 pouces de large avec un cadre en plastique robuste et est idéal pour l’application de colle.
Bouchons à vis SureSTART 9 mm, applications à haut débit de niveau 2, type : Bouchon à vis AVCS PP noir, silicone blanc/PTFE rouge Septa 1,0 mm	Thermo Scientific	6ASC9ST1B	« Utilisez des bouchons à vis Thermo Scientific SureSTART de 9 mm avec des flacons à vis dotés d’une ouverture de 9 mm. Les capuchons de performance de niveau 2 sont fabriqués et testés pour garantir un faible saignement, une robustesse et une reproductibilité des résultats pour les analyses GC-MS et LC-MS de routine. Choisissez parmi des capuchons en polypropylène avec des septa tout usage en silicone/PTFE de différentes valeurs de dureté conçus pour réduire les problèmes d’aiguille de l’échantillonneur automatique. Nos bouchons AVCS intègrent la technologie Advanced Vial Closure System pour assurer une compression optimale du joint lors de la fermeture d’un flacon.
Ultane Sevoflurane	AbbVie Inc	NDC # 0074-4456-04	Le liquide volatil pour inhalation est emballé dans des flacons de couleur ambrée contenant 250 ml de sévoflurane. Stocké à température ambiante contrôlée 15º ; à 30º ; C
Wheaton Flacons à scintillation liquide, bouchons fixés aux flacons, verre, feuille / pulpe métallique, 24-400, 20 mL  ;	DWK Sciences de la vie	986561	Flacons à scintillation de 20 ml convertis à partir de tubes en verre borosilicaté de type I, de PET ou de PEHD. Disponible avec capuchon attaché.