Mesure du potentiel de la membrane mitochondriale in vivo à l’aide d’un indicateur de tension génétiquement codé

Résumé

Ce protocole décrit l’application d’indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI) ciblant les mitochondries. Ces GEVI offrent un avantage significatif par rapport aux colorants de potentiel de membrane mitochondriale traditionnels en permettant une surveillance spécifique, in vivo et en temps réel du potentiel de membrane mitochondriale.

Résumé

Le potentiel membranaire mitochondrial (MMP, ΔΨ_m) est essentiel pour les fonctions mitochondriales, notamment la synthèse de l’ATP, le transport d’ions, la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’importation de protéines codées par le noyau. Les méthodes existantes de mesure de ΔΨ_m utilisent généralement des colorants cationiques lipophiles, tels que la rhodamine 800 et l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM), mais ceux-ci sont limités par leur faible spécificité et ne sont pas bien adaptés aux applications in vivo . Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un nouveau protocole utilisant des indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI). Les indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI), qui génèrent des signaux fluorescents en réponse aux changements de potentiel membranaire, ont démontré un potentiel significatif pour la surveillance de la membrane plasmique et des potentiels neuronaux. Cependant, leur application aux membranes mitochondriales reste inexplorée. Ici, nous avons développé des GEVI mitochondriaux à base de protéines capables de détecter les fluctuations de ΔΨm dans les cellules et le cortex moteur des animaux vivants. L’indicateur de potentiel mitochondrial (MPI) offre une approche non invasive pour étudier la dynamique de ΔΨ_m en temps réel, fournissant une méthode pour étudier la fonction mitochondriale dans des conditions normales et pathologiques.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels dans les cellules eucaryotes, servant de principales sources d’énergie par la génération d’adénosine triphosphate (ATP) tout en remplissant une variété d’autres fonctions cruciales, telles que la synthèse des métabolites, le tampon des ions calcium, la production de chaleur et la régulation de la survie cellulaire¹. Leurs rôles sont particulièrement critiques dans les tissus hautement métaboliques comme le cerveau et le cœur, où ils aident à maintenir l’homéostasie cellulaire. Le potentiel de membrane mitochondriale (MMP, Ψ_m) est au cœur de ces processu....

Protocole

Tous les soins et expériences sur les animaux ont été effectués conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Zhengzhou. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux avant utilisation. Suivez des techniques d’asepsie pour prévenir l’infection. Après que toutes les données aient été acquises, les animaux ont été euthanasiés à l’aide d’une surdose d’anesthésie inhalée suivie d’une décapitation.

1. Applications in vitro

1. Construction plasmidique
   1. Obtenir les gènes du capteur accéléré de potentiels d’action 1 (ASAP1) et ASAP3 à partir d’....

Résultats

Après la construction du plasmide CMV-MPI-1, sa capacité à cibler les mitochondries a été testée dans des cellules Hela à l’aide du marqueur mitochondrial Rhodamine 800 pour la coloration. Les expériences de colocalisation ont montré un degré élevé de chevauchement entre le signal de fluorescence de MPI-1 et le signal de Rhodamine 800, indiquant que MPI-1 a été localisé avec succès dans les mitochondries (Figure 3).

Discussion

La tension de la membrane mitochondriale est maintenue à -120--180 mV dans des conditions de repos et fluctue avec les changements d’état métabolique. Actuellement, la mesure du potentiel de membrane mitochondriale peut être effectuée à l’aide de méthodes électrophysiologiques et de méthodes de colorant de fluorescence. Le clampage du patch mitochondrial nécessite l’isolement des mitochondries et la destruction des structures cellulaires¹³. Cette approche peut con.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BamHI	Thermo	FD0054
Chlorure	de calcium Sigma	C4901
CCCP  ;	Sigma	C2759
Centrifugeuse	eppendorf	5430R
Centrifugeuse (culture cellulaire)	eppendorf	5810R
CO2 incubateur de cellules	ESCO	170L IR Sensor
Coverslips	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co.KG	92100100030
Ciment résine dentaire adhésive	Sun société médicale, LTD.	Super-Bond C& B Kit
D-glucose	Sigma	G7021
Kit de ligature de l’ADN Ver. 2.1	Takara	6022
Dulbecco’s modified Eagle medium	Gibco	11965092
Perceuse électrique  ;	RWD Instruments	78001
Sérum fœtal bovin	Gibco	A5670701
Canule à fibre optique	RWD Instruments	R-FOC-L200C-39NA
Détecteur photométrie à fibre	Thinker	Thinker QAXK_FPS-TC-MC-LED
Microscope à fluorescence  ;	Olympe  ;	IX83
Pipette en verre (pour injection)	Drummond Scientific company	3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293t	ATCC	Cat# CRL-3216
Hela cells	ATCC	Cat# CCL-2
HEPES	Sigma	H3375
Pompe d’injection	Drummond Scientific company	3-000-207
Isoflurane	RWD Instruments	R510-22
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	LSM980
MluI	Thermo	FD0564
NheI	Thermo	FD0974
Fibres optiques	RWD Instruments	R-FC-L-N3-200-L1
Huile de paraffine	Sangon	B500301
PCR thermal Cycler	analytik jena	Biometra Tone 96G
Pentobarbital sodium	Sinopharm Réactif chimique Co.LTD	57-33-0
Chlorure de potassium	Sigma	P5405
PrimeSTAR HS DNA Polymerase	Takara	R010A
Extracteur de micropipettes programmable	Sutter Instruments	P2000
Quick résine acrylique autopolymérisante  ;	Yamahachi	V-PINK
Thermocycleur d’analyse en temps réel	d’analyse	qTOWER³ ; auto
Rhodamine 800	Sigma	83701
SalI	Thermo	FD0644
Chlorure	de sodium Sigma	S9888
Phosphate de sodium dibasique	Sigma	S9763
Appareil stéréotaxique	RWD Instruments	E06354
Pommade ophtalmique vétérinaire	Puralube	NA
XhoI	Thermo	FD0694