Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Dosage du biofilm pour Clostridioides difficile avec applications pour la découverte de médicaments

981 vues

⸱

DOI :

10.3791/67913

⸱

8 juillet 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les biofilms de l’agent pathogène bactérien Clostridioides difficile et leur importance dans la maladie ne sont pas bien compris. Des résultats récents ont suggéré un rôle dans la récurrence, soulignant leur importance. Ici, nous décrivons l’adaptation d’un test de biofilm couplé à une lecture métabolique avec des applications pour la découverte de médicaments contre les biofilms.

Résumé

Clostridioides difficile est un pathogène bactérien gastro-intestinal capable de profiter d’un environnement de microbiote dysbiotique pour proliférer, sécréter des toxines et endommager l’épithélium intestinal. Un sous-ensemble de patients atteints d’une infection à C. difficile (ICD) connaîtra un échec du traitement par antibiotiques (15 % à 30 %) ou par greffe de microbiote fécal (TMF) (<10 %). Par conséquent, le développement d’interventions thérapeutiques supplémentaires est d’une importance cruciale. Le rôle des biofilms de C. difficile dans la récidive n’est pas clair. Cependant, les biofilms dans d’autres organismes sont responsables de maladies chroniques et récurrentes, ce qui suggère que cela pourrait également être le cas dans les ICD récurrentes. Nous émettons l’hypothèse que les biofilms de C. difficile constituent une cible thérapeutique précieuse. L’objectif du protocole présenté ici est d’adapter un test de formation de biofilm pour l’identification de composés repositionnables ayant une activité contre les biofilms établis de C. difficile . Le protocole affine un test robuste et reproductible pour la formation de biofilms, le couple à un test métabolique et l’applique à la découverte de médicaments. Ce protocole décrit le test de formation du biofilm, les lectures de la biomasse et de l’activité métabolique, les tests de sensibilité aux médicaments, le criblage d’une bibliothèque de repositionnement et les résultats représentatifs.

Introduction

Clostridioides difficile est un pathogène bactérien anaérobie sporulé capable d’infliger de graves dommages au tractus gastro-intestinal humain (GI) en produisant des toxines. C. difficile est responsable de près d’un demi-million de cas par an, avec ~30 000 décès (CDC, 2015). Le traitement de l’infection à C. difficile (ICD) ajoute un coût important au système de santé déjà mis à rude épreuve (~4,8 milliards de dollars)1,2,3. Les personnes les plus à risque sont les personnes immunodéprimées, exposées aux antibiotiques et/ou les personnes âgées, toutes des populations qui continuent de croître de manière significative aux États-Unis et dans le monde entier 4,5,6,7.

C. difficile dépend fortement de l’état du microbiote gastro-intestinal de l’hôte et, à ce titre, le traitement antibiotique est un facteur prédisposant clé à l’ICD. L’identification d’isolats cliniques de C. difficile résistants aux antibiotiques complique davantage le traitement 8,9,10. De plus, entre 15 % et 30 % des patients traités par antibiotiques pour une ICD échoueront au traitement initial 5,11,12,13,14,15,16. Lorsqu’un patient subit un épisode de récidive, la probabilité d’épisodes de récidive augmente à 45 % à 64 % (facteur de récidive) et s’accompagne d’un risque accru d’autres échecs du traitement16,17. Il est important de noter que la plupart des cas de rechute de l’ICD sont causés par la souche originale qui a établi le premier épisode d’infection chez l’hôte18,19, ce qui suggère une colonisation continue par C. difficile même après un traitement réussi. Bien qu’il ait été démontré que les spores persistent dans le tractus gastro-intestinal et entraînent une rechute dans des modèles ex vivo et murins20, les biofilms de C. difficile et leur rôle dans la maladie et la rechute sont sous-explorés. Les biofilms sont des communautés microbiennes protégées par une matrice extracellulaire autoproduite, une caractéristique qui les rend très récalcitrants aux agressions environnementales telles que le traitement antibiotique et les réponses immunitaires21. De plus, la formation de biofilms est un facteur de virulence important 22,23,24,25 et dans les infections bactériennes, telles que celles causées par Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, les biofilms sont essentiels dans la récidive et les manifestations chroniques 26,27. Récemment, les biofilms de C. difficile ont été suggérés comme réservoir d’infections récurrentes 28,29,30 et représentent donc une cible de grande valeur pour le traitement et/ou la prévention de la récidive de l’ICD.

Les modèles actuels pour étudier les biofilms de C. difficile comprennent les modèles de biofilms de colonies31,32, les microfermenteurs33, les modèles de chimiostats intestinaux34,35 et les systèmes de culture liquide utilisant des flacons ou des plaques à puits36,37. Tous ces modèles ont fourni des informations clés sur les biofilms de C. difficile à des stades de développement distincts et dans des environnements distincts. Cependant, certains de ces modèles (c’est-à-dire les microfermenteurs, les modèles intestinaux de chimiostat, les biofilms de colonie) ne conviennent pas aux efforts de découverte de médicaments. À ce jour, la plupart des études impliquant des efforts de découverte de médicaments se sont concentrées sur le mode de vie planctonique de C. difficile 38,39,40,41. Par conséquent, le protocole décrit ici vise à adapter, normaliser et valider le modèle existant de biofilm sur plaque à 96 puits dans le but de développer une plate-forme pour les bibliothèques de criblage afin d’identifier les molécules repositionnables capables de tuer les biofilms de C. difficile établis (âgés de 24 heures). La validation du protocole a été effectuée en comparant les capacités de formation de biofilms entre une souche adaptée en laboratoire (630 δerm) et un isolat clinique épidémique (souche UK1 isolée lors d’une épidémie en 2006 à l’hôpital de Stoke-Mandeville au Royaume-Uni42). La formation de biofilms a été quantifiée à l’aide du test classique du violet cristallin pour mesurer la biomasse et d’un test métabolique pour mesurer la viabilité des biofilms. Des différences significatives dans les capacités de formation de biofilm entre les souches ont été identifiées, suggérant des implications cliniques potentielles. De plus, le test a été utilisé pour déterminer les profils de sensibilité aux antibiotiques des biofilms établis. Enfin, à titre de preuve de concept, le coffret Global Health Priority de Medicines for Malaria Venture (MMV), une organisation à but non lucratif axée sur la découverte de nouvelles thérapies contre des maladies négligées telles que le paludisme, a été passé au crible pour identifier des composés ayant une activité contre les biofilms établis de C. difficile. Le protocole décrit ici adapte et valide un test de biofilm classique pour une utilisation comme plateforme de criblage de médicaments ciblant les biofilms matures.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des cellules pour le dosage du biofilm

ATTENTION : Clostridioides difficile est un agent pathogène humain et nécessite un confinement BSL-2.

REMARQUE : Les spores utilisées pour cette étude ont été acquises auprès du Dr Carol Kumamoto de la faculté de médecine de l’Université Tufts. Les stocks de spores de C. difficile ont été préparés comme décrit précédemment 43,44,45. Les spores sont ensuite aliquotes sous forme de volumes de 10 μL dans des tubes PCR pour le striage des plaques. Tous les milieux et le tampon salin phosphate (PBS) requis pour l’expérience doivent être pré-réduits dans la chambre anaérobie 24 h avant l’utilisation. Ceci est accompli en desserrant le bouchon de la bouteille contenant le média ou le PBS à l’intérieur de la chambre.

  1. Pré-réduire une plaque de gélose pour perfusion cerveau-cœur complétée par 0,1 % (p/v) de taurocholate et 0,1 % (p/v) de L-cystéine (BHIS) dans la chambre anaérobie, de préférence pendant la nuit ou pendant au moins 3 h pour permettre une réduction complète. Réglez la température de la chambre anaérobie à 37 °C.
  2. Chauffer le tube de PCR contenant 10 μL de spores pendant 20 min à 70 °C. Cela peut être fait dans un bain-marie ou un thermocycleur.
  3. Introduisez les spores dans la chambre anaérobie, mélangez en pipetant doucement 5x-6x et pipetez 10 μL sur la plaque BHIS pré-réduite. Effectuer une traînée à quatre quadrants comme décrit précédemment46, et incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C (température de la chambre anaérobie).
  4. Après 24 h de croissance, les colonies isolées devraient être visibles. Sélectionnez une seule colonie et, à l’aide d’une boucle jetable, transférez-la dans un tube contenant 10 mL de liquide BHIS. Incuber toute la nuit (14-18 h).
  5. Déterminez la densité cellulaire en diluant en série la culture de nuit dans la chambre.
    1. Effectuez des dilutions 10 fois de la culture pendant la nuit. La dilution 103 donne un échantillon dénombrable pour chacune des souches utilisées dans ce protocole. Cependant, la normalisation de cette étape pourrait être nécessaire pour les isolats cliniques présentant des différences de croissance.
    2. Sortez les tubes de la chambre anaérobie, placez 10 μL de chaque échantillon dans un hémocytomètre et comptez à l’aide d’un microscope à fond clair tel que décrit par le fabricant de l’hémocytomètre.
    3. Suivez les instructions du fabricant pour déterminer la concentration des cellules après le comptage.

2. Formation du biofilm

REMARQUE : Bien que ce protocole soit adaptable à des tailles de puits distinctes, il a été optimisé pour la plate-forme de 96 puits. Si la taille du puits est modifiée, la concentration des cellules devra être ajustée en fonction de la surface du puits.

  1. Après avoir déterminé la concentration cellulaire à partir de la culture nocturne, ajustez la concentration cellulaire à 1 x 107 cellules/mL dans le BHIS (complété par 10 % (p/v) de L-cystéine et 0,1 M de glucose).
    REMARQUE : Il a déjà été démontré que la supplémentation en glucose de 0,1 M augmente la formation de biofilm par la souche47 de C. difficile 630 δerm. Pour ce protocole, la concentration de 1 x 107 cellules/mL a été choisie après avoir testé des concentrations de départ distinctes (figure 1). Une formation robuste de biofilm peut encore être obtenue sans supplémentation en glucose.
  2. Distribuer 100 μL de cellules dans les puits d’une plaque de microtitration à 96 puits (fond plat et culture tissulaire traitée), en laissant les colonnes témoins (cellules seulement) et vierges (milieux seulement). Incuber pendant 24 h dans la chambre anaérobie (37 °C).
    1. Si l’évaporation du média devient un problème, placez les plaques de biofilm loin de toute unité de chauffage. Vous pouvez également placer les biofilms à l’intérieur d’un récipient supplémentaire ou les couvrir de membranes à plaques perméables à 96 puits.
  3. Retirez délicatement le média de tous les puits, en commençant par l’ébauche. Cela éliminera les cellules non adhérentes et laissera derrière lui un biofilm. Cette étape est cruciale car seules les cellules du biofilm sont intéressantes.
  4. Laver délicatement les biofilms 2x avec 200 μL de PBS pré-réduit. Pour effectuer ce lavage en douceur, inclinez légèrement la plaque à 96 puits, insérez les pointes de pipette contre la paroi du puits, glissez les pointes près du fond du puits sans racler le fond et aspirez lentement. Si le PBS est laissé en bas, répétez le processus à nouveau. À ce stade, les cellules non adhérentes peuvent être éliminées, et c’est normal. Retirez le PBS avant de retirer la plaque de la chambre anaérobie.
  5. À ce stade, utilisez des biofilms pour : les mesures de la biomasse (voir l’étape 3) ; mesures de l’activité métabolique (voir étape 4) ; les tests de sensibilité aux drogues et de dépistage des drogues (voir l’étape 5).
    REMARQUE : Ce protocole a été validé pour la souche 630 Δerm adaptée en laboratoire et la souche épidémique UK1. Des isolats et des souches cliniques distincts peuvent présenter de faibles capacités de formation de biofilms. Pour minimiser la rupture du biofilm, lavez avec du PBS 1x au lieu de 2x et réduisez le volume de lavage à 100 μL.

3. Mesure de la biomasse du biofilm à l’aide du test du violet cristallin

REMARQUE : La coloration au violet cristallin a été basée sur un protocole48 décrit précédemment.

  1. Après avoir lavé les biofilms dans la chambre anaérobie (voir étape 2.4), retirez la plaque et transférez-la dans une hotte chimique.
  2. Pour fixer les biofilms, ajoutez doucement 150 μL de méthanol dans chaque puits. Couvrez la plaque avec le couvercle pendant 10 min.
  3. Retirez le méthanol et laissez les puits sécher complètement avec le couvercle retiré. Cela devrait prendre entre 30 min et 45 min.
  4. Ajoutez 100 μL de violet cristallin à 0,3 % dans tous les puits et colorez pendant 10 min. Retirez soigneusement le violet cristal pour éviter de tacher le bord et les parois du puits, car cela peut avoir un impact sur la lecture.
  5. Laissez sécher la plaque avec le couvercle retiré. Cela devrait prendre entre 30 min et 45 min.
  6. Lavez les puits 3 fois avec 200 μL d’eau distillée et laissez la plaque sécher complètement. Cela devrait prendre 30 à 45 minutes.
  7. Une fois secs, utilisez un microscope à fond clair pour imager les biofilms (Figure 2A). Bien que cette étape soit facultative, elle permet une observation plus approfondie des cellules du biofilm.
    1. Placez la plaque à 96 puits sur un microscope à fond clair inversé à l’aide d’un adaptateur de plaque. Identifier des puits représentatifs pour chaque souche testée.
    2. Prenez des images pour chaque puits au grossissement souhaité. Les images présentées dans ce protocole ont été prises à un grossissement de 40x.
  8. Une fois les images souhaitées acquises, transférez la plaque dans une hotte chimique pour la décoloration.
  9. Pour décolorer le biofilm, ajoutez 150 μL d’acide acétique à 33 % et placez-le sur un agitateur à vitesse moyenne pendant 10 min.
  10. Retirer 90 μL de chaque puits et transférer sur une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits. Lecture de l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de plaques (Figure 2B).

4. Mesure de la viabilité du biofilm à l’aide du colorant métabolique PrestoBlue

  1. Effectuer la mesure de l’activité métabolique en suivant le protocole du fabricant pour le test avec les principales modifications. Réchauffez le lecteur de plaques à 37 °C avant de préparer les biofilms pour le dosage. Il est recommandé de disposer d’un lecteur de plaques capable de mesurer la fluorescence.
    REMARQUE : Alternativement, l’activité métabolique peut être lue àOD 600 ; Cependant, nous n’avons pas trouvé que cette approche était suffisamment sensible pour ces essais. Il est recommandé aux utilisateurs de consulter le protocole du fabricant et de le normaliser si nécessaire.
  2. Après avoir lavé les biofilms avec du PBS dans la chambre anaérobie comme décrit ci-dessus (voir étape 2.4), retirez la plaque de la chambre.
  3. Avec la plaque, prélever 9 ml de BHIS pré-réduit (complété par 10 % (p/v) de L-cystéine et 0,1 M de glucose).
  4. Ajouter rapidement 1 mL de réactif PrestoBlue à 9 mL de BHIS pré-réduit et de vortex. Ne pré-réduisez pas le réactif car cela peut affecter la coloration du réactif (voir la discussion).
  5. Ajouter 100 μL de mélange BHIS-PrestoBlue dans chaque puits. Placez la plaque dans un lecteur de plaques avec les réglages suivants : Température à 37 °C, type de test cinétique ; temps de lecture de 30 min ; fréquence de lecture toutes les 2 min ; intensité de fluorescence en fonction du type de lecteur de plaques disponible. Les mesures décrites dans ce protocole ont été effectuées en utilisant des longueurs d’onde d’excitation/émission de 560 nm / 590 nm, respectivement.
  6. Après lecture, jetez les plaques.
  7. Une fois les valeurs de fluorescence acquises à partir des lectures de plaques, utilisez des puits à blanc (support uniquement) pour soustraire le bruit de tous les puits d’échantillon. Après cela, divisez les puits de biofilm traités avec chaque composé par le puits témoin contenant un biofilm non traité (100 %) pour obtenir une activité métabolique.

5. Ajout de médicaments aux biofilms

REMARQUE : La configuration décrite ci-dessous peut être modifiée pour les tests de sensibilité aux médicaments et le dépistage de drogues à concentration fixe. Pour les deux méthodes décrites ci-dessous, le test PrestoBlue est recommandé.

  1. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de différents antibiotiques
    REMARQUE : Les biofilms sont manipulés sur une période de 48 heures, ce qui augmente le risque de contamination. Il est très important de traiter d’abord les puits vierges et de suivre des procédures aseptiques. Les valeurs de CMI signalées dans la littérature pour d’autres souches de C. difficile et les essais dose-réponse ont été utilisés pour éclairer les concentrations initiales d’antibiotiques pour les essais de CMI présentés dans le présent protocole. Cette approche sera utile pour déterminer les concentrations initiales d’antibiotiques lors de l’utilisation d’isolats cliniques.
    1. Lavez les biofilms matures (âgés de 24 h) avec du PBS dans la chambre anaérobie comme décrit ci-dessus (voir étape 2.4).
    2. Ajouter 200 μL de milieu BHIS pré-réduit (complété par 10 % (p/v) de L-cystéine et 0,1 M de glucose) contenant des dilutions doubles de l’antibiotique d’essai dans chaque puits, à l’exception des colonnes témoin (cellules seulement) et des colonnes vierges (milieu seulement) dans la plaque.
    3. Incuber pendant 24 h supplémentaires. Dans cette étude, la vancomycine (concentration initiale de 200 μg/mL), le métronidazole (concentration initiale de 16 μg/mL) et la fidaxomicine (concentration initiale de 4 μg/mL) ont été utilisés pour valider l’essai. Les valeurs de la CMI sont indiquées dans le tableau 1.
    4. Pour éviter le dessèchement des plaques, tenez-vous à l’écart de l’unité de chauffage dans la chambre anaérobie ou utilisez une membrane perméable aux gaz.
      REMARQUE : Alternativement, un PBS pré-réduit ou un fossé de média (300 μL) peut être utilisé sur les puits extérieurs de la plaque.
    5. Après 24 h d’incubation avec les médicaments, retirez le milieu et lavez doucement les biofilms 1x avec du PBS. Traitez des biofilms à l’aide du test Crystal violet ou du test PrestoBlue.
  2. Criblage des bibliothèques de médicaments
    1. Lavez les biofilms matures (âgés de 24 h) avec du PBS dans la chambre anaérobie comme décrit ci-dessus (voir étape 2.4).
    2. Ajouter 200 μL de milieux contenant une concentration fixe de composés de la bibliothèque de médicaments dans chaque puits, à l’exception des colonnes témoins (cellules dans les milieux sans antibiotiques) et blanches (milieux sans antibiotiques) dans la plaque. Incuber pendant 24 h supplémentaires. Pour éviter le dessèchement des plaques, tenir à l’écart de l’unité de chauffage dans la chambre anaérobie.
    3. Après 24 h d’incubation avec les médicaments, retirez le milieu et lavez doucement les biofilms 1x avec du PBS. Traitez des biofilms à l’aide du test Crystal violet ou du test métabolique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L’objectif du protocole décrit ci-dessus est d’adapter et de valider le modèle de formation de biofilms sur plaque à 96 puits en tant que plate-forme de criblage de médicaments pour l’identification de composés repositionnables ayant une activité contre les biofilms établis de C. difficile. L’impact de densités cellulaires distinctes (104, 105, 106 et 107 cellules/mL) sur la formation du biofilm a été déterminé, et la formation du biofi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La formation du biofilm de C. difficile et le rôle qu’il joue dans la maladie ne sont pas bien compris. Des résultats récents suggèrent un rôle des biofilms dans la rechute de la maladie28,34. La formation de biofilms est un facteur de virulence important 22,23,24,25 et dans les infections bactériennes, telles que ce...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

J.A.R. a conçu l’étude et le protocole et a rédigé le manuscrit. A.S. et P.Z. ont mené les expériences et ont aidé à affiner le protocole. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université du Texas à San Antonio (UTSA) à J.A.R., et A.S. a été soutenu par le programme UTSA MARC (T34GM145507). Les auteurs tiennent à remercier Medicines for Malaria Venture (MMV, Suisse) pour la mise à disposition de la bibliothèque Global Health Priority Box.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ACIDE ACÉTIQUE SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BACTÉRIOLOGIQUE GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 lecteur de plaqueFisher ScientificBTH1MG
BOUTEILLE EXTRAIT DE LEVURE 500GFisher ScientificDF0127179
BOUILLON D’INFUSION CERVEAUCŒUR Fisher Scientific
Crystal Violet grade USP 100GVWR97061-850Pour la coloration des biofilms pour les dosages de biomasse
CytoOne Plaque TC à 96 puits, fond plat, transparent, individuellement enveloppé avec couvercles, 50/caisseUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glucose, anhydreFisher Scientific50712744
Dimethyl Sulfoxide for Molecular Biology (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICINE 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CYSTÉINE 98+ % 1KGFisher ScientificAAA104350BPour C. difficile
METHANOL 99.8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOLE, 99 % 5GRFisher ScientificAC210340050
Tampon phosphate salin (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Réactif de viabilité cellulaireFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Utilisé pour sceller les plaques de médicament mère et fille avant le stockage
TAUROCHOLATE DE SODIUM 100MG  ;VWR100291-598
VANCOMYCINFisherScientific BP29581
CM1135R

Références

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Formation de biofilmessai métaboliquesensibilité aux médicamentslecture de la biomassecriblage de médicamentsinfection récurrentecible thérapeutique

Cet article a été publié

Vidéo bientôt disponible

Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.