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Article de méthode

Détection de la ténacité endoplasmique associée aux mitochondries à la membrane du réticulum à l’aide de biocapteurs FRET inductibles

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DOI :

10.3791/67914

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7 août 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode pour mesurer les valeurs de fréquences de fretage de biocapteurs inductibles ciblant le RE (marqué CFP) ou mitochondrie (marqué YFP ) in vitro afin d’évaluer l’étancheté des membranes RE associées aux mitochondries (MAMs), qui influence la génération d’Aβ, et cette méthode peut être utilisée pour le dépistage initial d’agents modulateurs synthétiques ou naturels de la MAM en tant que thérapeutiques potentiels contre la MA.

Résumé

De nombreuses études ont démontré que le nombre, la longueur et la largeur de l’écart (épaisseur) des contacts des MITOCHONDRIES RE, ou des membranes associées aux mitochondries (MAMs), influencent leur rôle biologique. Nos travaux précédents ont montré que la stabilisation des MAM serrées, caractérisées par une largeur d’écart d’environ 7 nm, entraîne une augmentation des niveaux de β amyloïde (Aβ), tandis que la présence de MAMs lâches, avec une largeur d’espace d’environ 40 nm, réduit la production d’Aβ dans un modèle neuronal tridimensionnel (3D) de la maladie d’Alzheimer (MA). Pour étudier les effets des MAM avec différentes largeurs d’écart, des biocapteurs FRET (Förster Resonance Energy Transfer) ciblés vers les ER et les mitochondries — respectivement ER-CFP (protéine fluorescente cyane) et Mito-YFP (protéine fluorescente jaune) — ont été développés pour quantifier les MAM serrées (largeur d’écart de <10 nm) par opposition aux MAMs lâches ou non-MAM. La FRET survient lorsque le fluorophore donneur (CFP) et le fluorophore accepteur (YFP) sont à moins de 10 nm l’un de l’autre, ce qui rend ce système adapté à l’évaluation de la proximité des MAM. Ce protocole décrit l’utilisation de la fréquence fretaire ratiométrique spectrale pour mesurer l’étendue de la formation serrée de la MAM.

Introduction

Les contacts du réticulum endoplasmique associé aux mitochondries (MERC), isolés biochimiquement sous forme de membranes RE associées aux mitochondries (MAMs), sont impliqués dans plusieurs troubles neurodégénératifs, dont la maladie d’Alzheimer (MA)1. L’hypothèse récemment proposée « MAM » suggère que les MAM jouent un rôle central dans la génération de β amyloïde (Aβ), initiant ainsi la cascade pathogène de la MA. Cette cascade inclut la formation d’emmêlements neurofibrillaires (NFT), la dyshoméostasie calcique et la neuroinflammation2. Les MAMs sont composés de microdomaines riches en cholestérol, en forme de radeau lipidique, situés dans le réticulum endoplasmique et la membrane mitochondriale externe (OMM), reliés par des protéines spécifiques de reliement qui contribuent à leur diversité structurelle etfonctionnelle 3. La stabilisation des contacts entre les mitochondries ER influence divers processus cellulaires, notamment la signalisation calcique du RE et l’apoptose 4,5. On estime que 5 % à 20 % des mitochondries forment des contacts physiques avec le RE pour établirun MA 6. Plusieurs études ont indiqué que le nombre, la longueur et la largeur de l’écart (épaisseur) entre le RE et les mitochondries sur les sites de MAM sont des déterminants importants de leur rôle fonctionnel. La cryomicroscopie électronique et les analyses in vivo du foie de souris ont démontré que l’état métabolique des hépatocytes module à la fois l’épaisseur (allant de 14 nm à 20 nm) et la longueur (allant de 145 nm à 270 nm) desMAMs 7.

Les MAMs émergent également comme cibles thérapeutiques potentielles pour divers troubles, notamment le cancer et les troubles métaboliques. L’épaisseur ou la largeur de l’écart de la MAM régule la survie cellulaire. Les stabilisateurs constitutifs MAM, MAM 1X et MAM 9X, conçus respectivement pour stabiliser des MAMs serrés (6 nm ± largeur d’écart de 1 nm) et des MAMs lâches (24 nm ± largeur d’écart de 3 nm), ont démontré que la stabilisation de MAMs serrés augmentait considérablement la génération d’Aβ dans un nouveau modèle de culture neuronale 3D de la MA. En revanche, la stabilisation des MAM lâches n’a eu aucuneffet 8. Ainsi, convertir la stabilisation des MAMs serrées en MAMs lâches peut être bénéfique pour réduire la pathologie amyloïde. Les complexités structurelles et fonctionnelles ainsi que l’absence d’une analyse quantitative précise du degré de stabilisation des MAM rendent difficile le ciblage des MAM pour la découverte de médicaments. Une nouvelle analyse d’imagerie cellulaire vivante et de kymographie de la vitesse axonale des mitochondries liées au RE a démontré que la vitesse axonale des mitochondries peut être utilisée comme mesure quantitative de la stabilisation de la MAM, car un contact plus étroit avec le RE a significativement réduit la vitesse axonale mitochondriale comparée aux mitochondrieslibres 8,9. En utilisant un stabilisateur inductible des MAM dans les cellules Neuro 2A (N2AAPP) exprimant deshAPP 8, nous avons constaté que le resserrement des largeurs d’écart des MAM augmente la génération d’Aβ de manière dépendantede la dose 8. Les stabilisateurs inductibles de la MAM sont des plasmides d’expression codant pour les biocapteurs ciblant les MITOCHONDRIES (protéine de fluorescence cyan) (protéine de fluorescence cyan) et les biocapteurs MITOCHONDRIES marqués par la protéine YFP (protéine de fluorescence jaune) et les cellules ciblant les mitochondries, fusionnés aux domaines de liaison à la rapamycine inducible FK506 (FRB) ou aux domaines de liaison à la protéine FK506 (FKBP) à 12-kDa (12-kDa). Les biocapteurs étaient désignés respectivement ER-CFP et Mito-YFP. Le CFP est un fluorophore donneur qui transfère de l’énergie au fluorophore accepteur YFP lorsqu’ils sont séparés par >10 nm. Les cellules (N2A APP) exprimant les biocapteurs inductibles augmentent la génération d’Aβ lors du traitement8 avec la rapamycine, ce qui suggère qu’une augmentation des MAM serrées augmente la génération d’Aβ. Ces méthodes seront bénéfiques pour le dépistage des modulateurs de petites molécules des MAM et leur concentration effective nécessaire pour atteindre la stabilisation d’un niveau optimal de MAM serrées qui convertiront les MAM pathogènes (« augmentation de l’Aβ ») en thérapeutiques (« abaissant l’Aβ ») sans déstabiliser complètement les contacts du RE et des mitochondries, ce qui est important pour la survie cellulaire.

Modèle expérimental
Cette étude a utilisé des cellules Neuro2A(N2A) exprimant constitutivement APP751 (N2A APP). Ces cellules libèrent des niveaux détectables d’Aβ dans le milieu conditionné (CM) par rapport aux cellules N2A naïves. Les cellulesN2A APP ont été maintenues dans le DMEM complétées avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 2 mM de L-glutamate complété avec 200 μg/mL de G418, comme décritprécédemment 10.

Plasmide d’expression
Un plasmide d’expression a été généré en fusionnant la séquence de ciblage mitochondriale marquée YFP (protéine fluorescente jaune) de la protéine ancre A-kinase 1 [AKAP1(34-63)] et de la séquence de ciblage ER marquée par CFP (protéine fluorescente cyan) de phosphatidylinositol-3-phosphatase Sac1 [Sac1(521-587)] avec une séquence Tav2A autoclivante codant codant pour la séquence peptidique EGRGSLLTCGDVEENPGP, notée pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. Le plasmide d’expression fusionné par Tav2A est également flanqué de séquences nucléotidiques codant pour le domaine de liaison de la rapamycine FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] ou du domaine de liaison à la protéine FK506 (FKBP) à 12 kDa (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGTVTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFFSFQIGKGGGAVIKDEGVIGMQ IGEVARLRCSSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). Le plasmide de fusion FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, noté ici MAM-Tav2A, a été généré pour obtenir les niveaux d’expression équimolaire de FRB-YFP-AKAP1(34-63) et Sac1(521-587)-CFP-FKBP pour l’analyse ratiométrique des frets. Le Sac1(521-587)-CFP-FKBP, noté ER-CFP, est le fluorophore donneur, tandis que Mito-YFP-FRB, noté Mito-YFP, est le fluorophore accepteur qui génère la fréquence de fréquence lorsqu’il est séparé par ~10nm 8. Ainsi, les biocapteurs basés sur FRET détectent des MAMs serrés (6-10 nm, largeur d’espace). Le FRB et le FKBP ont été introduits pour induire le resserrement des largeurs d’écart de la MAM lors de l’ajout de rapamycine de manière dépendante de la dose, quantifiable en mesurant l’augmentation du signalFRET 8.

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Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Transfection

  1. Transfecter les cellulesN2A APP avec le plasmide d’expression MAM-Tav2A (14-18 h).
    1. Avant de commencer, la plaque 1 × 10cellules N2A6 cellules APPparpuits de plaques à 6 puits contenant des gaines de verre et maintient les cellules dans le milieu de croissance pendant 12 à 16 heures.
    2. Transfecter 1-3 μg de plasmide MAM-Tav2A (fichier supplémentaire 1) en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine selon le protocole du fabricant.
    3. Après 12 à 16 heures de transfection, effectuez un traitement médicamenteux.
      REMARQUE : Faites toujours transfecter les cellules avec un plasmide d’expression codant uniquement pour le donneur (ER-CFP) ou l’accepteur (Mito-YFP) pour être utilisées comme fond de fret (FRET).

2. Traitement de la toxicomanie

  1. Traiter les cellulesN2A exprimant APP de MAM-Tav2A avec de la rapamycine (Rapa) ou du Rapalog (Log) (3-6 h).
    1. Avant le traitement, préparez des solutions d’origine (10 mM) de Rapa et Log.
    2. Changez le support par un support frais contenant 0 nM, 100 nM ou 250 nM Rapa ou Log.
    3. Après 3 heures de traitement, ajoutez du paraformaldéhyde (PFA) à 3,3 % pour fixer les cellules.
    4. Préparez les lames pour la microscopie confocale à fluorescence en déposant une goutte de réactif antifondu.
    5. Montez les couvertures sur la gouttelette et appuyez doucement avec la pince.
      REMARQUE : Les bâtons de protection en verre sont fragiles et nécessitent une prudence. En alternative aux couvercles en verre, utilisez des plaques inférieures en verre. Le principal inconvénient de l’utilisation de plaques à fond de verre est que le réactif antifondu ne peut pas être utilisé, ce qui rend l’imagerie difficile en raison du blanchiment des fluorophores. NE PAS utiliser un réactif antifade contenant du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) car sa fluorescence bleue interfère avec la fréquence entre la CFP et la YFP.

3. Microscopie confocale pour transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET)

  1. Placez les lames sous un microscope inversé et ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que les cellules deviennent visibles.
  2. Excitez le fluorophore à l’aide d’un laser de 440 nm et capturez des images en utilisant une émission de 468-503 nm pour le CFP DONNEUR (FKBP-CFP-ER) ou 525-565 nm pour l’accepteur YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Ajustez l’intensité du signal à l’aide du filtre fluorescent intégré jusqu’à ce que le signal de fond soit dissipé (il devrait être presque noir fixe).
    REMARQUE : Un microscope confocal a été utilisé pour capturer des images fluorescentes à l’aide du logiciel NIS Element AR. Un grossissement de 60x était utilisé à une résolution de 512 pixels.
  4. Enregistrez les images sous forme de fichiers .nds.
  5. Effectuer une analyse spectrale ratiométrique des FRET.

4. Analyse ratiométrique des FRET (6 - 12 h)

REMARQUE : L’émission de fluorescence du donneur ER-CFP (468-503 nm) et de l’accepteur Mito-YFP (525-565 nm) a été détectée à l’aide d’un microscope confocal. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour quantifier l’intensité moyenne de fluorescence des pixels après soustraction de fond. Le rapport entre l’intensité d’émission YFP et CFP a été calculé et utilisé comme lecture pour l’analyse spectrale des fréquences frétiques.

  1. Image ouverte J (Fidji).
  2. Soit glisser le fichier .nds sur l’Image J, soit appuyer sur Fichier -> Ouvrir et sélectionner l’Image.
  3. À l’écran suivant, sélectionnez la case Séparer les canaux .
  4. Cliquez sur le panneau C = 0 .
  5. Cliquez sur Analyser -> mesurer.
    REMARQUE : Notez la Valeur Moyenne pour un calcul ultérieur.
  6. Cliquez sur Processus -> Mathématiques -> Soustraire.
  7. Entrez la valeur moyenne.
  8. Répétez l’étape 4 pour la case C = 1.
  9. Cliquez sur l’outil de sélection à main levée .
  10. Encerclez une cellule d’intérêt, puis appuyez sur Ctrl+T pour l’enregistrer dans le ROI.
  11. Cliquez sur Afficher tout en bas du ROI pour afficher ce que vous avez déjà sélectionné.
  12. Sélectionnez toutes les cellules sélectionnées et cliquez sur Mesurer, enregistrez ces valeurs dans Excel.
  13. Cliquez sur la case C = 1 et cliquez sur Afficher tout.
  14. Sélectionnez toutes les cellules, cliquez à nouveau sur Mesurer, puis notez ces valeurs dans une colonne séparée dans Excel.
  15. Dans Excel, créez une fonction pour placer les valeurs du signal donneur sur celles du receveur (C0/C1). Voici le ratio FRET.

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Résultats

Analyse ratiométrique des FRET des cellulesN2A enrichies en FACS exprimant MAM-Tav2A a démontré une augmentation dépendante de la dose des niveaux d’Aβ40 après un traitementà la rapamycine 8. La rapamycine agit en inhibant la voie de signalisation mammifère cible de la rapamycine (mTOR), qui à son tour régule à la baisse l’expression de TREM2 (Récepteur Déclencheur Exprimé sur les Cellules Myéloïdes 2) dans la microglie,...

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Discussion

La modulation des MAMs est un domaine de recherche émergent avec des implications potentielles pour divers troubles, notamment le cancer, les troubles métaboliques et les maladiesneurodégénératives 13. De nombreux agents pharmacologiques, dont le LDC-3/Dynarrestine, l’antidiabétique metformine et l’agent anticancéreux sulforaphane, perturbent les MAMs et sont actuellement en essais précliniques et cliniques pour le cancer et les troubles métaboliques. Ces agents p...

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Remerciements

Nous remercions sincèrement le Dr Rudolph E. Tanzi, professeur au Massachusetts General Hospital (MGH), pour ses commentaires perspicaces sur le manuscrit. Nous remercions le Dr Masato Maesako, professeur assistant au MGH, pour avoir partagé son expertise dans les tests FLIM. Nous remercions le Dr Gyorgy Hajnoczky, professeur à l’Université Thomas Jefferson de Philadelphie, pour nous avoir généreusement fourni des plasmides d’expression codant ER-CFP ou Mito-YFP. Cette étude a été soutenue par le Cure Alzheimer’s Fund à RB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BSAFisher Scientific501781532
Microscope confocal Olympus FV3000RS (Tokyo, Japon)N/A
DMEM avec supplément de GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
Anticorps polyclonal GAPDHThermo Fisher ScientificPA1-988
Gélatine VWR International9000-70-8
Geneticin (sulfate de G418)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
Anticorps monoclonal GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
HéparineSigma-Aldrich H0200000
Logiciel ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Microscope confocal inversé Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
Gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
Pénicilline/Streptomycine/Amphotericine B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsine-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Références

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