Ici, nous décrivons les protocoles permettant d’obtenir des cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HRTEC) à partir du cortex rénal pour développer des monocouches et des cultures tridimensionnelles sur une matrice extracellulaire (3D-HRTEC).
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Article de méthode
Développement de cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines dans des monocouches et des conditions tridimensionnelles
Dans cet article
Résumé
Résumé
Des cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HRTEC) sont isolées à partir de reins prélevés chez des patients pédiatriques subissant des néphrectomies indiquées par l’unité de néphrologie pédiatrique de l’Hôpital général de pédiatrie Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentine. Macroscopiquement, le cortex rénal normal est disséqué de la moelle rénale et coupé en fragments. Les fragments corticaux sont ensuite digérés dans la solution de Hank complétée par 0,1 % de collagénase de type 1 et filtrés à travers un maillage de pores de 70 μm pour séparer les tubules rénaux des glomérules. Les tubules rénaux subissent une seconde digestion avec de la collagénase pour isoler les cellules épithéliales. Enfin, la digestion enzymatique est arrêtée et les cellules épithéliales sont cultivées dans des flacons contenant du RPMI 1640 avec des suppléments inférieurs à 5 % de CO2à 37 °C jusqu’à la confluence. Les cellules HRTEC peuvent être cultivées sous forme de monocouches sur des plaques de 96 puits, de lamelles de verre dans des plaques de 24 puits ou de supports de culture cellulaire recouverts de collagène. De plus, des cultures tridimensionnelles de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (3D-HRTEC) sont obtenues à partir de cellules HRTEC ensemencées sur une matrice de membrane basale (BM). L’agrégation cellulaire et la formation de structures tubulaires sont surveillées. Nous utilisons des cultures primaires HRTEC depuis de nombreuses années pour étudier l’action cytotoxique causée par la toxine Shiga dans le rein pédiatrique, ce qui entraîne des altérations physiopathologiques entraînant un syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les cultures HRTEC et 3D-HRTEC peuvent être utilisées pour évaluer les effets de différentes toxines, drogues synthétiques, facteurs biologiques, hormones, etc., en particulier sur l’épithélium du tubule proximal rénal humain.
Introduction
Dans notre groupe, des cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HRTEC) développées en monocouches et en conditions tridimensionnelles (3D-HRTEC) ont été utilisées pour étudier dans le rein pédiatrique l’action cytotoxique de la toxine Shiga de type 2 (Stx2) provoquée après une infection gastro-intestinale par Escherichia coli productrice de Shiga toxine (STEC).
Stx1 et Stx2 (Stxs) sont les principaux facteurs de virulence de STEC capables de provoquer un syndrome hémolytique et urémique (SHU) post-diarrhéique1. Le SHU est une complication systémique qui touche environ 5 à 10 % des enfants infectés par des STEC et qui consiste en une anémie hémolytique, une thrombocytopénie et une insuffisance rénale aiguë (IRA) pédiatrique, nécessitant un traitement de soutien2. En Argentine, le STEC-SHU est une maladie endémique avec une incidence annuelle de 6,52 cas pour 100 000 enfants de moins de 5 ans (le taux le plus élevé au monde), représentant l’une des principales causes d’insuffisance rénale aiguë3. Bien que la mortalité soit inférieure à 4%3, environ 50 % des patients développent des séquelles rénales, constituant la deuxième cause la plus fréquente de transplantation rénale dans notre pays 4,5.
Avant l’internalisation et l’exercice de son action cytotoxique, Stx2 se lie spécifiquement au récepteur du glycolipide globotriaosylcéramide (Gb3) exprimé à la surface cellulaire des organes cibles6. Le rein est le principal organe endommagé par les Stxs en raison de la présence de cellules sensibles aux Stx, qui expriment de grandes quantités de récepteurs Gb3 biologiquement actifs dans les cellules épithéliales et endothéliales rénales 7,8.
Des travaux antérieurs menés dans des HRTEC cultivés en monocouches ont montré que Stx2 inhibait la synthèse des protéines, diminuait la viabilité cellulaire et la prolifération cellulaire, et induisait l’apoptose et la nécrose 9,10,11,12. De plus, l’exposition de 3D-HRTEC à Stx2 a inhibé la migration cellulaire et le développement de structures tubulaires présentant des caractéristiques des tubules proximaux rénaux12,13.
Les cultures primaires de HRTEC et 3D-HRTEC ont également été utilisées pour évaluer l’effet de l’œstradiol sur la prolifération cellulaire en mesurant l’incorporation de la 5-bromo-2-désoxyuridine (BrdU) dans l’ADN des cellules de la phase S du cycle cellulaire14.
Pour isoler les cellules épithéliales, nous partons de fragments rénaux obtenus à partir de néphrectomies pédiatriques indiquées pour la correction des affections urologiques.
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Protocole
Le Comité d’éthique de l’Hôpital Général de Niños Pedro de Elizalde a approuvé l’utilisation de tissus rénaux humains pour le développement de cultures de cellules primaires à des fins de recherche. Le consentement éclairé écrit des plus proches parents ou des tuteurs au nom des enfants a été obtenu pour l’utilisation d’échantillons de rein à des fins de recherche.
REMARQUE : Les cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HRTEC) sont dérivées de patients pédiatriques subissant des néphrectomies, indiquées pour la correction d’affections urologiques ou de résections tumorales, à l’Hôpital Général de Pédiatrie Pedro de Elizalde à Buenos Aires, en Argentine.
1. Développement de cultures primaires de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HRTEC)
REMARQUE : Les fragments rénaux corticaux sont disséqués à partir de reins prélevés sur des patients pédiatriques subissant une néphrectomie à l’hôpital. La culture primaire du HRTEC est réalisée selon la méthode décrite précédemment11.
Le protocole est décrit dans les étapes suivantes :
- Conservez le fragment de rein au réfrigérateur dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) ou dans une solution saline équilibrée de Hanks (Hanks) jusqu’à ce qu’il soit traité en laboratoire.
- Disséquez la capsule rénale à l’aide d’une pince. Séparez le cortex rénal de la moelle épinière et coupez-le en petits fragments d’environ 1 mm.
- Pour effectuer la digestion, placez les fragments de reins dans une solution stérile de Hanks sans Ca2+ et Mg2+, complétée par 0,1 % de collagénase de type I.
- Incuber les fragments rénaux pendant 30 min à 37 °C en les agitant.
- Pour arrêter la digestion, ajouter un volume de PBS contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et laver l’échantillon trois fois par centrifugation à 160 × g pendant 10 min chacune, dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C. Lors de chaque centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans la même solution.
- Passez le produit de la digestion à travers un maillage de pores de 70 μm pour filtrer les tubules et éliminer les glomérules qui restent retenus dans le filtre.
- Centrifuger les tubules filtrés à 160 × g pendant 10 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution stérile de Hanks, sans Ca2+ et Mg2+, complétée par 0,2 % de collagénase de type I.
- Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 °C en agitant.
- Pour arrêter la digestion, ajoutez un volume de PBS contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).
- Laver l’échantillon trois fois par centrifugation à 160 × g, 10 min chacune, dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C. Lors de chaque centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans la même solution.
- Après la dernière centrifugation, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de milieu de culture complet (RPMI 1640 complété par 5 % de FBS, L-glutamine [2 mmol/L], pénicilline [100 U/mL], streptomycine [100 μg/mL] et supplément de croissance des cellules endothéliales [ECGS, 1 %]).
- Ensemencer la suspension cellulaire dans une fiole deculture de 25 cm 2 avec un couvercle ventilé.
- Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humide et 5 % de CO2.
- Le lendemain, laver la culture cellulaire 3 fois, en jetant le liquide de la fiole, en ajoutant 5 ml de PBS chacun et en ajoutant 5 ml de milieu de culture complet dans la fiole. Ces lavages éliminent les globules rouges et les fragments tubulaires qui n’ont pas été complètement digérés et qui ne sont pas attachés au ballon de culture.
- Incuber les cellules épithéliales dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C, ce qui leur permet de se développer en monocouche jusqu’à la confluence.
- Changez le milieu avec un milieu de culture complet frais tous les 3 jours et observez la culture cellulaire quotidiennement au microscope inversé.
2. Développement de cultures HRTEC tridimensionnelles (3D-HRTEC)
REMARQUE : Cette section présente les étapes à suivre pour développer des cultures tridimensionnelles (3D-HRTEC). Les cultures 3D-HRTEC sont réalisées selon la méthode décrite précédemment12.
- Utilisez une matrice de BM du sarcome murin d’Engelbreth-Holm-Swarm. Cette matrice BM est livrée congelée, et dans cet état, elle reste solide. Décongeler la solution de matrice BM pendant la nuit dans un bain de glace au réfrigérateur à 4 °C, comme indiqué par le fabricant.
- Refroidissez les pointes au congélateur avant de placer la matrice BM et laissez la plaque multi-puits sur de la glace pour éviter la solidification de la matrice pendant le processus.
- Prenez une aliquote de matrice BM liquide (150 mL/cm2) et placez-la dans chaque puits de la plaque pour couvrir le fond du puits. Incuber la plaque dans l’incubateur de cellules à 37 °C pendant 1 h pour transformer la matrice BM en un état gel.
- Pendant ce temps, pour détacher les cultures primaires confluentes de HRTEC, jeter le milieu de culture du ballon et ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % et une solution d’EDTA à 0,02 %.
- Répartissez le liquide sur toute la surface du ballon et incubez pendant 5 min à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Observez au microscope inversé si toutes les cellules se sont détachées.
- Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu de culture ou de PBS, les passer dans un tube de 15 mL et centrifuger à 160 × g pendant 10 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture complet contenant les mêmes suppléments que ceux utilisés pour les cultures primaires HRTEC.
- Comptez le nombre de cellules dans une chambre de Neubauer.
- Semez 4 × 104 cellules/150 μL par puits sur la matrice BM. Incuber la culture cellulaire pendant plusieurs jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, dans une atmosphère humide et à 5 % de CO2.
- Changez le milieu tous les 2 jours avec du milieu frais.
- Surveillez l’agrégation cellulaire et la formation de structures de forme tubulaire à l’aide d’un microscope optique inversé.
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Résultats
Les cultures primaires confluentes HRTEC ont montré une morphologie similaire observée en microscopie optique (Figure 1). Les cellules ont été caractérisées par immunofluorescence comme décrit dans nos publications précédentes en utilisant des anticorps contre l’aquaporine 1 (AQP1) et PECAM CD31 9,12,13. Des études d’immunofluorescence ont montré que plus de 90 % des HRTEC étaient positifs pour AQP1...
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Discussion
Les cultures primaires doivent être effectuées le jour même de la néphrectomie. Les cultures primaires HRTEC peuvent être utilisées entre 1 et 5 passages pour garantir la stabilité morphogénétique des cellules. Après le cinquième passage, les cellules commencent à changer de morphologie, montrant une apparence de fibroblaste ou une augmentation des vacuoles, et peuvent devenir quiescentes.
Si un fragment de rein plus gros est utilisé, l’ADN libéré par la lyse ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à l’équipe d’urologie pédiatrique de la « Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde », Buenos Aires, Argentine, pour avoir fourni des échantillons de rein. Ce travail a été soutenu par des subventions accordées à C. Silberstein de l’Université de Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) et à C Ibarra et C Silberstein du Conseil national de la recherche scientifique et technique (CONICET : PUE 0041). Ce travail a été partiellement soutenu par le Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (par l’intermédiaire de Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Collagénase de type I | Sigma Merck, St Louis, MO, États-Unis | 637958 | |
| Supplément de croissance des cellules endothéliales | Sigma Merck, St Louis, MO, États-Unis | E2759 | |
| Matrice de membrane basale Matrigel | BD Biosciences, États-Unis ; Sigma Merck, St Louis, MO, États-Unis | 356234 | |
| 70 &mu ; Filtre à mailles de pores M | BD Bioscience, MA, États-Unis | CSS010070 | |
| RPMI 1640 moyen avec L-glutamine ; | Sigma Merck, St Louis, MO, États-Unis | R8758-500ml | |
| Celui de Hanks Solution saline équilibrée ; Sans Ca2+ et Mg2+ | Gibco Invitrogen, NY, États-Unis | 14175046 | |
| Solution trypsine-EDTA | Sigma Merck, St Louis, MO, États-Unis | Réf. T4049 |
Références
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Réimpressions et autorisations
