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Article de méthode

Imagerie super-résolution du biofilm de Proteus mirabilis par microscopie à expansion

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DOI :

10.3791/67932

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18 juillet 2025

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1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole complet pour PmbExM, une technique de microscopie à expansion conçue spécifiquement pour les biofilms de Proteus mirabilis . PmbExM utilise un traitement enzymatique par étapes des échantillons de biofilm pour obtenir une expansion isotrope de 4,3 fois, permettant une analyse en super-résolution de l’organisation spatiale des structures cellulaires et subcellulaires au sein de ces communautés microbiennes sessiles.

Résumé

L’accès à des informations visuelles détaillées et à des données quantitatives à partir d’échantillons microbiologiques à l’aide de la microscopie optique conventionnelle est limité par la barrière de diffraction. L’une des solutions pour améliorer la résolution est la microscopie à expansion (ExM), une technique de super-résolution innovante et rentable qui agrandit physiquement les échantillons d’environ quatre fois leur taille d’origine. Pour une expansion réussie, il est essentiel d’homogénéiser les propriétés mécaniques du matériel biologique. Les biofilms sont des communautés bactériennes, adhérant à une surface et noyées dans une matrice extracellulaire qu’elles produisent ; ils nécessitent que les protocoles ExM soient adaptés pour s’adapter à leurs composants structurels uniques. Cet article présente le biofilm ExM de Proteus mirabilis (PmbExM), une variante spécialisée d’ExM qui permet la visualisation en super-résolution des biofilms de P. mirabilis cultivés pendant 48 h. Le protocole se concentre sur la dégradation ciblée des composants structurels clés des échantillons par des digestions enzymatiques en série, optimisées près de leurs conditions théoriques. PmbExM utilise une combinaison d’enzymes, notamment la α-amylase, la cellulase et les glycoside-hydrolases lyticase pour l’hydrolyse des polysaccharides ; mutanolysine pour l’hydrolyse du peptidoglycane ; et la protéinase K pour l’hydrolyse des protéines. Ces procédures de digestion sont indépendantes du processus de gélification, ce qui permet des modifications pour répondre à des exigences d’homogénéisation spécifiques dans différents modèles de biofilms. Cette adaptabilité offre un grand potentiel d’application à diverses espèces bactériennes et conditions de croissance. ExM a été appliqué à différentes espèces de biofilms avec des facteurs d’expansion globalement sous-optimaux. En revanche, le PmbExM atteint le facteur d’expansion maximal théorique de l’hydrogel standard acrylamide-acrylate ExM, sans distorsion significative de la morphologie ou de la topologie. L’objectif de ce travail est de fournir un protocole de super-résolution accessible pour visualiser l’architecture, l’assemblage et les caractéristiques cellulaires et intracellulaires des biofilms de P. mirabilis .

Introduction

La microscopie à fluorescence est un outil largement utilisé pour étudier l’architecture, la composition et la fonction des biofilms1. Cependant, la capacité de la microscopie optique à résoudre les caractéristiques structurelles, cellulaires et subcellulaires des biofilms est limitée par la barrière de diffraction. La microscopie à expansion (ExM) est une technique de super-résolution innovante, accessible et facile à utiliser qui a un grand potentiel pour révéler la structure du biofilm au-delà de la limite de diffraction 2,3. ExM améliore la résolution en expansant isotropement des échantillons biologiques d’environ quatre fois leur taille d’origine. Le procédé implique la polymérisation in situ d’un hydrogel ionique gonflant dans l’ensemble de l’échantillon et la préservation de l’arrangement spatial relatif des cibles moléculaires lorsqu’il est appliqué avec précaution 4,5.

Pour que l’ExM fonctionne correctement, l’homogénéisation des propriétés mécaniques du matériel biologique est une étape cruciale6. Des variantes standard d’ExM ont été développées sur des cultures et des tissus de cellules de mammifères, où elles ont atteint efficacement l’homogénéisation uniquement par digestion protéolytique protéolytique protéolytique 4,5 ou par dénaturation des protéines molles avec des détergents et l’autoclave7, produisant une expansion isotrope de 4 fois. Cependant, dans le cas des bactéries et des biofilms bactériens, la paroi cellulaire du peptidoglycane et les éléments de la matrice EPS, tels que les polysaccharides structurels, sont des obstacles à l’expansion 2,3,8,9.

Cet article décrit les procédures de la microscopie à expansion du biofilm de Proteus mirabilis (PmbExM), une variante ExM sur mesure conçue pour élargir les biofilms de P. mirabilis, un bacille à Gram négatif cliniquement pertinent associé à une résistance élevée aux antibiotiques et à des infections des voies urinaires associées au cathéter10. PmbExM utilise une combinaison de traitements enzymatiques à base de mutanolysine, de α-amylase, de cellulase, de lyticase et de protéinase K pour hydrolyser la paroi cellulaire du peptidoglycane, les polysaccharides et les protéines, respectivement. Les résultats démontrent que cette méthode permet d’obtenir une expansion isotrope de 4,3 fois des biofilms de P. mirabilis vieux de 48 h. La technique permet de visualiser en super-résolution l’architecture, l’assemblage et les caractéristiques intracellulaires du biofilm de P. mirabilis grâce à la double coloration3. De plus, le PmbExM peut être adapté à d’autres modèles de biofilm en ajustant les traitements enzymatiques pour cibler les composants du biofilm spécifiques à l’espèce.

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée des procédures impliquées dans la gélification, la digestion, l’expansion et le montage d’échantillons de biofilm pour le PmbExM. De plus, ce travail décrit les conditions de croissance bactérienne, les formats d’échantillons et les techniques de coloration fluorescente utilisées par les auteurs, ainsi qu’une routine de traitement et d’analyse des données qui peut être facilement appliquée par des chercheurs ayant une expérience limitée dans le traitement d’images. Pour un guide plus complet et approfondi sur le traitement et l’analyse des images, veuillez vous référer à Castagnini, D. et al.3.

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Protocole

Le processus global de PmbExM est résumé dans la figure 1. Veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 pour connaître la composition de toutes les solutions nommées (c.-à-d. solution monomère, solution de digestion de la protéinase K, etc.) utilisées dans ce travail. De même, reportez-vous au Fichier supplémentaire 2, au Fichier supplémentaire 3 et au Fichier supplémentaire 4 pour une routine simplifiée de traitement et d’analyse des données qui peut être utilisée par des chercheurs sans vaste expérience en traitement d’images. Le protocole peut être réalisé confortablement sur une période de 2,5 à 3 semaines : la première semaine est consacrée au nettoyage et à la stérilisation des lamelles, à la croissance du biofilm et à la fixation de l’échantillon ; la deuxième semaine pour la coloration des échantillons et le protocole PmbExM lui-même, et la troisième pour le montage des échantillons et l’acquisition d’images. De plus, envisagez 1 semaine de préparation préalable pour les matériaux et les solutions nécessaires. Des détails sur les réactifs, les matériaux, l’équipement et les logiciels utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

figure-protocol-1
Figure 1 : Ancrage, polymérisation, digestion et dialyse du protocole PmbExM pour une expansion, une observation et une analyse réussies du biofilm de P. mirabilis. La colonne de gauche identifie six états de l’échantillon aux étapes sélectionnées au cours du protocole d’expansion. Il commence à partir de l’échantillon de biofilm fixe, perméabilisé et coloré, en suivant quatre états intermédiaires jusqu’à l’état final gélifié et expansé, prêt pour la microscopie et l’analyse d’images en super-résolution. La matrice EPS du biofilm est représentée en vert, la paroi cellulaire bactérienne est représentée par des lignes violettes, la structure cellulaire générale des protéines est représentée en gris et le polymère acrylamide-acrylate ExM est représenté par des lignes bleues ondulées. Toutes les enzymes impliquées dans le processus sont représentées par des symboles Pac-Man : 3 glycoside-hydrolases (vert) pour l’hydrolyse des exopolysaccharides : α-amylase, cellulase et lyticase ; mutanolysine (violet) pour la dégradation de la paroi cellulaire du peptidoglycane ; et la protéinase K (grise) pour la digestion générale des protéines. Les couleurs des symboles Pac-Man correspondent aux structures cibles respectives. Tous les objets présentés avec une faible opacité ou des bordures pointillées représentent un état de dégradation enzymatique. Cette figure est modifiée d’après Castagnini, D. et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Nettoyage et stérilisation des lamelles de verre pour la formation de biofilm

  1. Lamelles en verre à ultrasons de 12 mm dans de l’hydroxyde de sodium 1 M pendant 20 min à température ambiante, puis rincer abondamment à l’eau déminéralisée.
  2. Éclipsez les lamelles avec de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 15 min à température ambiante, puis rincez avec de l’éthanol à 95 % (v/v).
  3. Laissez les lamelles sécher à l’air libre à température ambiante.
  4. Stériliser à l’autoclavage.

2. Croissance du biofilm de Proteus mirabilis

  1. Cultivez P. mirabilis dans 10 mL de bouillon Luria Bertani (LB) pendant 24 h à 37 °C sans agiter.
    REMARQUE : Une souche de type P. mirabilis disponible sur le marché (voir le tableau des matériaux) a été acquise et utilisée dans cette étude, mais l’utilisation de toute souche de P. mirabilis qui est facilement disponible est encouragée.
  2. Prélever 1 mL de la culture et l’ajouter à 9 mL de bouillon LB frais et stérile pour générer une suspension bactérienne de dilution 1:10.
  3. Vérifiez que la densité optique (DO) à 600 nm de la suspension bactérienne 1:10 est de 0,1. Ajustez si nécessaire en ajoutant de petits volumes de culture fraîche de LB ou de P. mirabilis jusqu’à ce qu’elle atteigneDO 600 = 0,1.
  4. Introduire des lamelles en verre de 12 mm (préalablement nettoyées et stérilisées) dans une plaque stérile en polystyrène à 24 puits (une lamelle par puits).
    REMARQUE : Assurez-vous que toute la surface de la lamelle touche le fond du puits. Le biofilm se formera sur le côté de la lamelle, qui est tournée vers le haut.
  5. Ensemencez les puits de la plaque avec 350 μL de la suspension bactérienneOD 600 = 0,1.
    REMARQUE : Il est recommandé d’ensemencer uniquement les puits intérieurs de la plaque, tout en remplissant les puits extérieurs (c’est-à-dire les puits des rangées A et D et des colonnes 1 et 6) avec de l’eau stérile ou du bouillon LB. En effet, les puits extérieurs sont sujets à des taux d’évaporation de liquide plus élevés que les puits intérieurs, ce qui affecte la croissance du biofilm.
  6. Placez la plaque ensemencée à l’intérieur d’un incubateur et positionnez-la avec une inclinaison de 45 degrés.
    REMARQUE : Utilisez du matériel de laboratoire courant tel que des tubes à centrifuger de 50 ml ou des boîtes à pointes de micropipettes. La position inclinée permettra la formation d’une interface air-liquide à la surface des lamelles de recouvrement où le biofilm de P. mirabilis établira sa région la plus épaisse.
  7. Laisser se former des biofilms pendant 48 h à 37 °C, sans agiter.
    REMARQUE : Cette configuration de croissance du biofilm ne convient pas aux temps d’incubation supérieurs à 48 h en raison de la dessiccation du biofilm due à l’évaporation du milieu.

3. Fixation et stockage des échantillons de biofilm

  1. Retirer délicatement le milieu de culture des puits et laver délicatement les lamelles porteuses de biofilm à deux reprises avec une solution saline tampon phosphate stérile (PBS) de 300 μL pendant 5 minutes à température ambiante avec une agitation très douce.
    REMARQUE : Évitez la destruction des biofilms avec des échanges de fluides répétitifs en utilisant de petits volumes pour l’incubation ou le lavage. 300 à 400 μL de liquide suffisent pour immerger les biofilms dans une plaque à 24 puits. Un pipetage lent et méthodique est fortement suggéré, ainsi que d’éviter de frapper les biofilms directement avec les solutions échangées.
  2. Retirez soigneusement le PBS et remplacez-le par 400 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (p/v) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante pour la fixation du biofilm.
  3. Retirez le PFA et remplacez-le par 300 μL de PBST à 1 % (Triton X-100 à 1 % v/v dans du PBS) pour la perméabilisation cellulaire. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
  4. Remplacer la solution de PBST à 1 % par 300 μL de PBST à 0,3 % (Triton X-100 à 3 % v/v dans du PBS). Incuber 30 min à température ambiante.
  5. Retirer le PBST à 0,3 % et le remplacer par 300 μL d’un mélange 50:50 de méthanol et de PBST à 0,3 % pour la déshydratation de l’échantillon. Incuber 5 min à température ambiante puis remplacer le mélange par 1 mL de méthanol absolu.
    REMARQUE : Ajoutez lentement 1 ml de méthanol, en le dirigeant contre les parois du puits. Ce volume plus élevé de méthanol est utilisé pour empêcher son évaporation complète pendant le stockage des échantillons.
  6. Conservez les échantillons à -20 °C pendant au moins 1 jour et jusqu’à un mois.
    REMARQUE : Il est recommandé de sceller les plaques à l’aide d’un film de cire flexible pour retarder l’évaporation du méthanol et la dessiccation des échantillons.
  7. Lors de l’utilisation, réhydratez séquentiellement les échantillons en remplaçant le méthanol par 300 μL d’un mélange 50:50 de méthanol et de PBST à 0,3 %, puis par 300 μL à 0,3 % de PBST, à température ambiante.

4. Coloration fluorescente du biofilm

  1. Incuber les échantillons de biofilm réhydratés avec 300 μL de 50 μg/mL de conjugué fluorescent de lectine d’agglutinine de germe de blé (ci-après dénommé conjugué WGA ; voir le tableau des matériaux) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante pour la coloration de la paroi cellulaire/de la capsule/des exopolysaccharides.
    REMARQUE : Veuillez consulter les sujets pertinents concernant la coloration fluorescente dans la section Discussion. Désormais, protégez les échantillons de la lumière.
  2. Retirer la solution conjuguée WGA et laver délicatement deux fois avec 300 μL de PBS pendant 10 min à température ambiante.

5. Étapes PmbExM

  1. Ancrage MA-NHS et polymérisation acrylamide-acrylate
    1. Incuber les échantillons de biofilm coloré avec 400 μL d’ester N-hydroxysuccinimidylique de l’acide méthacrylique 1 mM (MA-NHS) dans du PBS pendant 1 h à température ambiante avec une légère agitation.
      REMARQUE : Le MA-NHS est un ester activé qui est sujet à l’hydrolyse dans un milieu aqueux, traitez donc les échantillons immédiatement après avoir préparé le 1 mM dans une solution de PBS.
    2. Effectuez trois lavages doux de 10 min avec 300 μL de PBS à température ambiante.
    3. Retirez le PBS et remplacez-le par 300 μL de solution monomère. Incuber toute la nuit (O.N.) à 4 °C.
    4. Construisez les préchambres de gélification. Utilisez une lame de verre comme base et placez-y deux morceaux de ruban adhésif double face plié pour servir d’espaceurs de 400 μm. Disposez les entretoises à une distance de 8 à 10 mm l’une de l’autre.
      REMARQUE : Voir la figure 2A pour plus de clarté sur la façon de construire la préchambre de gélification. Le ruban adhésif double face utilisé ici avait une épaisseur d’environ 100 m, il a donc été coupé et plié sur lui-même pour créer des entretoises de 3 mm x 5 mm x 0,4 mm. Mesurez l’épaisseur du ruban adhésif double face disponible et disposez-le en conséquence. L’absorption de la solution gélifiante par les entretoises de ruban est négligeable. Comme alternative au ruban adhésif double face, des lamelles en verre rondes de 12 mm peuvent être collées ensemble avec des gouttes d’eau et empilées jusqu’à la hauteur requise.
    5. Disposez des chambres humides pour protéger les échantillons pendant la polymérisation de la dessiccation.
      REMARQUE : Une boîte commune de pointes de micropipette peut être facilement convertie en une chambre humide en retirant l’échafaudage en plastique des pointes et en le remplaçant par des serviettes en papier humides.
    6. Préparer un volume mère frais de solution gélifiante en mélangeant soigneusement les volumes de solution monomère, 10 % (p/v) de N, N, N', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED), 0,5 % (p/v) de 4-hydroxy-TEMPO (4-HT) et 10 % (p/v) de persulfate d’ammonium (APS) dans une proportion de 47:1:1:1, respectivement. Ne mélangez l’APS avec le reste des réactifs de la solution gélifiante que lorsque les étapes jusqu’à 5.1.5 sont effectuées.
      REMARQUE : Le volume total de la solution gélifiante mère à préparer dépendra de la quantité d’échantillons de biofilm en cours de traitement. Par exemple, pour traiter trois échantillons de biofilm, préparez 900 μL de solution gélifiante en mélangeant 846 μL de solution monomère avec 18 μL de TEMED à 10 % (p/p), 18 μL de 4-HT à 0,5 % (p/p) et 18 μL de 10 % (p/p) APS. Pour éviter une polymérisation prématurée, l’APS doit être ajouté en dernier au mélange et uniquement lorsque les échantillons, les préchambres de gélification et les chambres humides sont prêts à être utilisés. Maintenez tous les réactifs mentionnés et la solution gélifiante récemment préparée refroidie au cours de cette étape.
    7. Immédiatement après avoir préparé la solution gélifiante, retirez délicatement la solution de monomère et remplacez-la par 300 μL de l’ancien. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
    8. Pendant que l’étape 5.1.7 est en cours, retirez le couvercle de protection restant des bandes de ruban adhésif double face disposées sur les lames de verre et, dans l’espace entre elles, placez 40 μL de solution gélifiante.
    9. Une fois l’étape 5.1.7 terminée, retirer chaque lamelle porteuse de biofilm de son puits et la placer sur la goutte de 40 μL de solution gélifiante préalablement déposée sur une lame de verre. Orientez la lamelle de manière à ce que le biofilm à sa surface entre en contact avec la solution gélifiante.
    10. Terminez la construction de la chambre de gélification en appuyant doucement sur la lamelle porteuse de biofilm à l’aide d’une pince à épiler pour garantir son adhérence aux entretoises de ruban double face.
      REMARQUE : Cette configuration en sandwich se compose de ce qu’on appelle la chambre de gélification (Figure 2B).
    11. Laissez les échantillons polymériser à l’intérieur d’une chambre humide et incuber pendant 2 h à 37 °C sans agitation.
    12. Visualisez les échantillons sous microscopie à fluorescence (voir étape 6.2.1) sans démonter les chambres de gélification pour la capture d’image avant expansion.
      REMARQUE : Ne laissez pas les échantillons gélifiés hors de la chambre humide pendant plus d’une heure, car les gels pré-expansés sont sujets à la dessiccation, ce qui rend l’échantillon inutilisable. Veuillez consulter l’étape SF2.3 (Fichier supplémentaire 2) pour les procédures d’acquisition préalables à l’expansion.
    13. Démontez les chambres de gélification et coupez l’excès de gel autour de la région d’intérêt dans l’échantillon de biofilm à l’aide d’une lame chirurgicale.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé de couper les gels pour faciliter la manipulation et le montage d’échantillons expansés. De plus, pour garder une trace de l’orientation spatiale de la région d’intérêt dans les échantillons, coupez les gels en une forme asymétrique ou laissez une découpe caractéristique dans le gel pour une reconnaissance facile de l’orientation correcte.
    14. Placez les lamelles portant les gels coupés à l’intérieur d’une nouvelle plaque à 24 puits, avec le gel vers le haut.
      REMARQUE : À ce stade, les échantillons gélifiés doivent rester collés à leur lamelle en verre d’origine.
  2. Digestion enzymatique I-III et coloration de l’ADN
    REMARQUE : L’homogénéisation des propriétés mécaniques des échantillons de biofilm de P. mirabilis fait suite à une série de digestions enzymatiques que les auteurs ont classées en 3 étapes, en fonction de la structure biologique ciblée pour la dégradation : hydrolyse des polysaccharides (Digestion I), hydrolyse du peptidoglycane (Digestion II) et hydrolyse des protéines (Digestion III).
    1. Digestion I
      1. Immerger les échantillons dans 1 mL de solution de digestion de α-amylase. Incuber O.N. à 50 °C.
        REMARQUE : De grands volumes (c.-à-d. 0,5 à 1 mL) de solution enzymatique sont utilisés pour prévenir la dessiccation de l’échantillon en raison de la température d’incubation élevée.
      2. Retirer la solution de α-amylase et laver les gels pendant 5 min à température ambiante avec 300 μL de tampon de digestion de cellulase.
      3. Retirez le tampon de digestion de la cellulase et remplacez-le par 500 μL de solution de digestion de cellulase. Incuber pendant 2 h à 45 °C.
      4. Retirer la solution de digestion de la cellulase et laver les gels pendant 5 min à température ambiante avec 300 μL de tampon de digestion lyticase.
      5. Retirez le tampon de digestion de lyticase et remplacez-le par 500 μL de solution de digestion de lyticase. Incuber pendant 2 h à 30 °C.
    2. Digestion II
      1. Retirer la solution de digestion de lyticase et laver les gels pendant 5 min à température ambiante avec 300 μL de tampon de digestion de mutanolysine.
      2. Retirez le tampon de digestion de mutanolysine et remplacez-le par 1 mL de solution de digestion de mutanolysine. Incuber O.N. à 55 °C.
    3. Digestion III
      1. Retirer la solution de digestion de mutanolysine et laver les gels pendant 5 min à température ambiante avec 300 μL de tampon de digestion de la protéinase K. Retirez le tampon de digestion de la protéinase K et remplacez-le par 500 μL de solution de digestion de la protéinase K. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
    4. (FACULTATIF) Coloration de l’ADN
      1. Retirer la solution de protéinase K et laver les gels avec 300 μL de 10x PBS pendant 5 min à température ambiante.
      2. Retirez le PBS 10x et remplacez-le par 300 μL de colorant d’acide nucléique fluorescent rouge 5 μM dans 10x PBS pendant 30 min à température ambiante.
        REMARQUE : Voir la section Discussion pour des commentaires sur la coloration de l’ADN pour les procédures ExM.
  3. Expansion
    1. Retirer la solution de protéinase K (ou la solution de coloration de l’ADN si l’étape facultative 5.2.4 a été effectuée) et transférer les gels dans une boîte de Pétri de 60 mm. Placez un gel par boîte de Pétri.
      REMARQUE : Utilisez un petit pinceau plat pour pousser le gel sur sa lamelle en verre. À l’aide d’une pince à épiler de laboratoire, saisissez la lamelle en verre et utilisez-la comme plate-forme pour le gel. Empêchez le gel de tomber de la lamelle à l’aide de la brosse lorsque vous le soulevez du puits de la plaque. Évitez que les gels ne se replient sur eux-mêmes.
    2. Remplissez la boîte de Pétri avec l’excès d’eau déminéralisée, immergez complètement le gel et incubez sous une légère agitation à température ambiante pendant 20 min. Changez l’eau 4 à 5 fois.
      REMARQUE : Notez que le gel expansif devient pratiquement invisible lorsqu’il est immergé dans l’eau. Positionnez la boîte de Pétri contre la lumière pour faciliter le repérage du gel afin d’éviter de l’endommager avec l’aspiration de la pipette Pasteur ou de la micropipette lors des échanges d’eau.

figure-protocol-2
Figure 2 : Chambre de gélification et montage de l’échantillon. (A) Chambre de pré-gélification. Sur une diapositive, placez 2 entretoises de ruban adhésif double face (jaunes). Une lamelle en verre (figure-protocol-3 = 12 mm) se trouve au sommet de la plaque de repère. (B) Chambre de gélification. Le biofilm bactérien (vert) se forme sur la surface inférieure de la lamelle. Les entretoises de 400 m d’épaisseur (orange) sont fabriquées à partir de découpes de ruban adhésif double face de 100 m d’épaisseur. Les entretoises permettent au gel de s’incruster dans l’ensemble de l’échantillon et d’éviter le débordement de la solution gélifiante des bords de la chambre, empêchant ainsi l’échantillon d’être écrasé entre la lame et la lamelle. (C) Chambres d’imagerie imprimées en 3D (visitez le lien suivant pour accéder aux fichiers .stl https://github.com/scianlab/ExM). Un échantillon de gel expansé (à gauche) et un échantillon de gel expansé immergé dans de l’eau déminéralisée (à droite). Les gels expansés deviennent pratiquement invisibles lorsqu’ils sont immergés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Observation et analyse

  1. Montage d’échantillons expansés
    1. Préparez les chambres d’imagerie avec un revêtement en polylysine pour l’immobilisation de l’échantillon pendant l’imagerie11 : Trempez la surface en verre de la chambre d’imagerie (voir le tableau des matériaux) avec 0,1 % (p/v) de poly-L-lysine pendant 20 min à température ambiante.
    2. Retirez la solution de poly-L-lysine et effectuez deux lavages avec l’excès d’eau déminéralisée. Laisser sécher à l’air libre pendant 1 h ou placer dans un incubateur à 37 °C pour accélérer le processus de séchage.
    3. Après le cinquième cycle de dialyse de l’étape 5.3.2, retirez l’eau qui recouvre les gels et utilisez une petite brosse plate pour pousser l’échantillon sur une lamelle en verre de 24 mm x 50 mm. Utilisez la lamelle rectangulaire comme plate-forme pour le gel et retirez-le de la boîte de Pétri.
    4. Retirez l’excès d’eau du gel à l’aide de papier de soie pour éviter que l’eau ne bloque le contact direct entre la surface du gel et le revêtement en polylysine sur la surface en verre de la chambre d’imagerie.
    5. Placez délicatement le gel sur la surface en verre de la chambre d’imagerie, en évitant la rétention de bulles d’air entre le gel et le verre.
      REMARQUE : La surface en verre de la chambre d’imagerie doit être complètement sèche. Si des images de pré-expansion ont été prises, envisagez une orientation correcte du gel expansé pour faciliter la recherche des champs de vision précédemment capturés dans l’échantillon pré-expansé.
    6. Ajoutez de l’eau déminéralisée jusqu’à ce que le gel soit complètement immergé (voir Figure 2C).
      REMARQUE : Les gels expansés doivent rester hydratés pendant toute la durée du processus d’imagerie pour éviter le rétrécissement pendant la capture.
  2. Acquisition d’images
    1. Visualisez et capturez des images des échantillons sur un microscope fluorescent à diffraction limitée disponible.
      REMARQUE : Les auteurs ont utilisé un microscope confocal à disque rotatif, avec un objectif d’immersion dans l’eau 63x d’une ouverture numérique (NA) de 1,2. Pour l’excitation des fluorophores, une ligne laser à l’état solide à 488 et 647 nm a été utilisée. Les captures ont été faites à l’aide d’une caméra CMOS numérique 16 bits contrôlée par un logiciel propriétaire (voir la table des matériaux). La taille du voxel a été fixée à 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (axes XYZ ).
  3. Traitement d'images
    1. Veuillez vous référer au fichier supplémentaire 2 pour trouver une routine de traitement d’images numériques pour la segmentation des bactéries (section SF2.1), la mesure de la largeur des cellules (section SF2.2), la détermination de l’EF (section SF2.3) et la correspondance d’images pour les conditions pré-expansées et expansées (section SF2.4).

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Résultats

PmbExM a multiplié par 4,3 le biofilm de P. mirabilis et a préservé la morphologie et la topologie
La figure 3A-D met en évidence l’amplification physique des cellules du biofilm de P. mirabilis et l’augmentation de la résolution apportée par la technique. De plus, cela n’a pas seulement été observé dans les régions de biofilms minces où les cellules s’organisent en une monocouche, mai...

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Discussion

Étapes critiques de PmbExM
Comme pour toute variante ExM, l’une des étapes les plus critiques du protocole est l’homogénéisation des propriétés mécaniques de l’échantillon. Dans le cas du PmbExM, cela est réalisé grâce à une série de traitements enzymatiques. Une digestion insuffisante peut entraîner de faibles FE et des dommages potentiels à la morphologie et/ou à la topologie du biofilm, ce qui entraîne une résolution sous-optimale et des résultats peu fiables. À l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts financier ou personnel lié à ce travail.

Remerciements

Les auteurs expriment leur gratitude au Dr Juan Eduardo Rodríguez et au Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) pour leur contribution à la mise en œuvre des techniques d’expansion au SCIAN-Lab. Ces travaux ont été financés par les projets ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH) ; Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH), et Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
&alpha ;-Amylase de Bacillus sp.Sigma-Aldrich  ;10070Digestion des polysaccharides
à 0,1 % (p/v) solution aqueuse de poly-L-lysine  ;Sigma-AldrichP8920Immobilisation d’échantillons pour l’imagerie
Lamelles en verre de 12 mmChemglass Life SciencesCLS-1760Composant de la chambre de gélification
Caméra 16 bits C13440-20CU HamamatsuPhotonicsNon disponibleCaméra numérique CMOS pour l’acquisition d’images
Lamelles en verre de 24 mm x 50 mmChemglass Life SciencesCLS-1764Manipulation/manipulation d’échantillons
Chambre d’imagerie impriméeen 3D Conceptioninterne-Optionde chambre d’imagerie
4-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyl (4-hydroxy-TEMPO)Sigma-Aldrich176141Composant de solution gélifiante
Plaque à fond de verre à 6 puits avec parois noiresCelVisP06-1.5H-NOption chambre d’imagerie
Acide acétique  ;Sigma-Aldrich818755Composant tampon enzymatique
Acrylamide  ;Sigma-AldrichA4058Composant de solution de monomère
Persulfate d’ammoniumSigma-AldrichA3678Composant de solution gélifiante
Microscope Axiovert 200ZeissNon disponibleMicroscope confocal
Chlorure de calciumSigma-AldrichC8106Composant tampon enzymatique
C-Apochromat 63x 1,2 NA Objectif à immersion dans l’eauZeissNon disponibleObjectif microscope
Cellulase de Aspergillus nigerSigma-Aldrich  ;22178Digestion polysaccharidique
Chamlide CMB 35 mm chambre d’imagerie magnétiqueantenne parabolique Instrument à cellules vivantesNon disponibleOption chambre d’imagerie
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich472301MA-NHS solution mère de réactif d’ancrage  ;
Phosphate disodiqueSigma-AldrichS3264Composant tampon enzymatique
ÉthanolSigma-AldrichE7023Nettoyage et stérilisation
Acide éthylènediaminetétraacétiqueMerck324503Composant tampon enzymatique
Falcon polystyrène 24 plaques à puitsCorning351147Plate-forme de procédures générales
FIJI SoftwareNational Institutes ofHealth-Logicielde traitement d’images
GlycérolSigma-AldrichG7893Composant tampon enzymatique
Chlorhydrate de guanidineThermo Scientific24115Composant tampon enzymatique
Huygens Software ScientificVolume Imaging-Deconvolutionlogiciel pour la restauration d’images
Acide chlorhydriqueSupelco1.00317Préparation du tampon
Papier de soie KimwipesFisher Scientiffic06-666 Élimination del’excès d’eau
Pince à épiler de laboratoireMicroscopie électronique SciencesM5EManipulation/manipulation générale des échantillons
Luria Bertani BouillonInvitrogen12795-027Milieu de croissance du biofilm
Lyticase de Arthrobacter luteusSigma-Aldrich  ;L4025Digestion des polysaccharides
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichD5652Composant tampon enzymatique
Acide méthacrylique Ester N-hydroxysuccinimidyliqueSigma-Aldrich730300Réactif d’ancrage
MéthanolSigma-Aldrich32213Déshydratation et stockage des échantillons
MicrobeJ  ;--Plugin de logiciel de traitement d’images
Lames de verre de microscopieChemglass Life SciencesCG-8221Composant de la chambre de gélification
Phosphate monosodiqueSigma-AldrichS9638Composant tampon enzymatique
Mutanolysine de Streptomyces globisporusSigma-Aldrich  ;M990Digestion du peptidoglycane
N, N, N', N'-tétraméthyléthylènediamineSigma-AldrichT7024Composant de la solution gélifiante
N,N&prime ;-méthylènebisacrylamideSigma-AldrichM1533Composant de la solution monomère
Nunc 40,4 mm Boîtes de Pétri à fond de verreThermo Fisher12-567-400Option de la chambre d’imagerie
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127Fixation de l’échantillon
Tampon phosphate salinSigma-Aldrich79383Composant de solution monomère, lavage, tampon enzymatique
Protéinase K de Engyodontium albumInvitrogen25530-031Digestion des protéines
Proteus mirabilis ATCC 12453Microbiologie0440PSujet de l’étude
Petit pinceau platQuincaillerielocale-Manipulation/manipulation d’échantillons
Acétate de sodiumSigma-Aldrich241245Composant tampon enzymatique
Acrylatede sodium Sigma-Aldrich408220Composant de solution monomère
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich S5761Composant tampon enzymatique
Chlorurede sodiumSigma-AldrichS9888Composant de solution monomère, composant tampon enzymatique
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich221465Nettoyage des lames de verre
Ligne laser à semi-conducteursOmicronNon disponible488, 568 et 647 nm Ligne laser d’excitation
SYTO 61 Coloration des acides nucléiquesInvitrogenS11343Colorant fluorescent
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane chlorhydrateSAFC108219Composant tampon enzymatique
Triton X-100Sigma-AldrichX100Perméabilisation d’échantillons, composant tampon enzymatique
Volocity 7.0.0 logiciel de captureQuorumTechnologies-Microscoy logiciel de contrôleur d’acquisition
Volocity ViewVox système de disque rotatifPerkin-ElmerNon disponibleSystème de disque rotatif pour confocal microscope
Agglutinine de germe de blé &ndash ; Alexa Fluor 488 conjugué de lectine fluorescenteInvitrogenW11261Colorant fluorescent
à

Références

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