Article de méthode

Étude de la mort cellulaire programmée induite par les nanoparticules de cuivre chez les bactéries

DOI :

10.3791/67951

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16 mai 2025

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1Department of Laboratory Medicine and Biotechnology, College of Medicine, Tzu Chi University, 2Graduate Institute of Microbiology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Department of Biological Sciences, Missouri University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les nanoparticules de cuivre agissent comme des agents antimicrobiens en générant des espèces réactives de l’oxygène. Ici, des procédures sont présentées démontrant que les nanoparticules de cuivre sont efficaces contre trois agents pathogènes cliniquement pertinents et que certaines voies de mort cellulaire programmées sont impliquées dans ce processus bactéricide.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Récemment, les préoccupations concernant les agents pathogènes multirésistants et les infections incurables ont augmenté en raison de la surutilisation et de la mauvaise utilisation des antibiotiques. Les nanomatériaux, tels que les nanoparticules métalliques et d’oxyde métallique, ont gagné en popularité dans le domaine biomédical en tant que nouvelles stratégies potentielles pour lutter contre les agents pathogènes multirésistants. Cette étude a examiné l’utilisation de nanoparticules de cuivre (CuNPs) comme bactéricide contre trois agents pathogènes opportunistes courants contractés en milieu hospitalier - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) et Staphylococcus aureus (S. aureus) - qui développent de plus en plus de résistance aux médicaments. Des protocoles détaillés sont présentés pour synthétiser des CuNP de deux tailles (20 nm et 60 nm) et évaluer leur efficacité bactéricide par des essais en colonie. Les mécanismes d’action antimicrobienne sous-jacents aux CuNP ont été explorés en évaluant les changements dans la production d’espèces réactives de l’oxygène. De plus, quatre modulateurs qui inhibent les fonctions des protéines humaines ont été appliqués pour étudier l’implication potentielle des voies de mort cellulaire programmée (PCD) dans la destruction bactérienne. Grâce à cette approche, l’émergence potentielle de souches résistantes au cuivre est suggérée, en s’appuyant sur la recherche sur les protéines d’homéostasie du cuivre, y compris les régulateurs transcriptionnels dépendants du cuivre. Ces résultats fournissent une méthodologie complète pour étudier les effets bactéricides des CuNP et leur rôle potentiel dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques.

Introduction

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Les bactéries résistantes aux médicaments sont une grave source de préoccupation en médecine. Leur émergence rapide a réduit l’efficacité des antibiotiques conventionnels, entraînant davantage de complications cliniques. Ils représentent une menace majeure pour la santé publique et créent un besoin urgent de nouveaux agents antimicrobiens. Les nanomatériaux sont une piste de recherche. Les nanomatériaux possèdent des propriétés physicochimiques uniques qui leur permettent d’interagir avec les microbes d’une manière qui compromet leur viabilité. Par exemple, les nanoparticules d’argent (AgNPs) induisent un stress oxydatif chez les bactéries, entraînant un dysfonctionnement des protéines, une rupture membranaire, des dommages à l’ADN et, finalement, la mort cellulaire1. Les nanoparticules d’or (AuNP), quant à elles, sont connues pour leurs propriétés antifongiques et peuvent renforcer l’effet bactéricide des antibiotiques en servant de vecteurs2.

De plus, les nanoparticules de cuivre (CuNP) ont également attiré beaucoup d’attention en raison de leur puissant effet antimicrobien et de leur faible coût de production. Des études suggèrent que les CuNP présentent une activité bactéricide à large spectre par perturbation de l’activité enzymatique et génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)3. La charge positive des CuNPs facilite leur pénétration dans les bactéries, améliorant ainsi leur absorption cellulaire4. Ce mécanisme fait des CuNPs une option prometteuse pour le revêtement de surface, par exemple sur les implants, afin de prévenir les infections3. Une découverte intéressante, cependant, est que l’effet bactéricide des CuNP semble dépendre de la taille. Certaines études ont montré que les CuNP plus petits présentent une activité antibactérienne plus élevée, probablement en raison de leur rapport surface/volume supérieur5.

La génération de ROS cause des dommages généralisés aux cellules et aux bactéries, notamment la peroxydation des lipides, le dysfonctionnement des protéines, la fragmentation de l’ADN et l’inhibition de la gluconéogenèse/glycogénolyse, et est impliquée dans la nécrose ou la mort cellulaire programmée (PCD)6,7,8. Des études récentes ont révélé que les systèmes PCD existent chez les bactéries, avec des modes d’action et des effecteurs similaires à ceux des systèmes eucaryotes9. Les communautés bactériennes peuvent induire la PCD en réponse au stress, y compris le stress oxydatif, par le biais d’un système toxine-antitoxine (TA)10. En termes simples, le système toxine-antitoxine se compose de toxines qui peuvent perturber les processus cellulaires essentiels et d’antitoxines qui peuvent former des complexes stables avec les toxines pour inhiber leur toxicité dans des conditions de croissance normales. La plupart des bactéries et des archées contiennent des loci TA dans leurs génomes, souvent présents dans plusieurs copies d’ADN extrachromosomique et chromosomique. Il existe plusieurs types de systèmes TA, le TA de type II (connu sous le nom de module MazE/MazF) étant particulièrement intéressant. Dans des conditions de stress, les antitoxines sont dégradées, ce qui permet aux toxines d’inhiber leurs cibles cellulaires. Chez E. coli et S. aureus, la toxine MazF est activée en réponse à des conditions de stress telles que le stress oxydatif, les températures élevées et la privation d’acides aminés. Par conséquent, l’expression de l’antitoxine MazE est réduite, libérant la toxine MazF10. Des études ont montré que MazF permet la synthèse de protéines qui permettent à une petite sous-population de survivre dans des conditions défavorables, tandis que la majeure partie de la population subit la mort cellulaire médiée par mazEF. Cette mort cellulaire peut être soit dépendante des ROS, où les ROS induisent une inhibition transcriptionnelle ou traductionnelle, soit indépendante des ROS, où les dommages à l’ADN déclenchent les voies de mort11.

Cette étude explore les mécanismes par lesquels les CuNPs induisent la mort bactérienne. Plutôt que de se concentrer uniquement sur le système TA, quatre modulateurs PCD, précédemment utilisés dans notre recherche 7,12, ont été utilisés pour étudier les voies potentielles des PCD chez les bactéries.

En examinant les effets bactéricides des CuNP de deux tailles différentes (20 et 60 nm) à des concentrations variables, et en utilisant des méthodes telles que les essais de colonie, la détection des ROS et les modulateurs de la PCD (SBI, Z-VAD, NSA et Wortmannin), cette recherche souligne que la PCD n’est pas exclusive aux organismes multicellulaires, mais qu’elle est également présente dans les communautés bactériennes soumises à un stress. En fournissant des protocoles détaillés, ce travail vise à permettre aux chercheurs d’évaluer l’efficacité de CuNP et les mécanismes bactéricides dans leurs propres systèmes. De plus, ces résultats font progresser la compréhension de la DCP bactérienne et soutiennent le développement de thérapies à base de CuNP pour lutter contre les bactéries résistantes aux antibiotiques.

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Protocole

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Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de nanoparticules de cuivre

  1. Obtenir des nanopoudres de cuivre commerciales (25 nm et 60-80 nm) à partir d’une source commerciale.
  2. Utilisez du dodécylsulfate de sodium (SDS) de 1,0 mM comme dispersant pour deux tailles de nanoparticules de 1 mg/mL.
  3. Dispersez les nanoparticules à l’aide d’un bain à ultrasons pendant au moins 30 min à température ambiante. Les nanoparticules entièrement dispersées sont ensuite prêtes à être utilisées dans des expériences ultérieures.

2. Préparation des bactéries

  1. Procurez-vous E . coli (Migula) de la souche 25922 de Castellani et Chalmers et de la souche Bouvet et Grimont d’A . baumannii de l’American Type Culture Collection. Obtenez S. aureus du Centre de recherche et de collecte de bioressources.
  2. Cultivez les bactéries dans un bouillon Luria-Bertani (LB) dans des conditions aérobies à 37 °C.
  3. Diluer les cultures bactériennes dans le milieu LB jusqu’à une densité optique à 600 nm (OD600) d’environ 0,5.

3. Évaluation de la viabilité cellulaire

  1. Essai de colonie
    1. Utiliser des solutions mères de CuNP (1 mg/mL) pour préparer diverses concentrations de deux tailles de CuNP, soit 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL et 100 μg/mL.
    2. Divisez les cultures bactériennes préparées à l’étape 2.3 en tubes de microcentrifugation et centrifugez à 3300 × g pendant 10 min à température ambiante.
    3. Conservez les pastilles bactériennes et ajoutez différentes concentrations de deux tailles de CuNP, respectivement, avec un pipetage doux.
    4. Traitez les granulés bactériens avec du PBS et de l’alcool à 70 % comme témoins négatifs et positifs, respectivement.
    5. Incuber toutes les bactéries traitées en agitant à 200 tr/min à 37 °C pendant 24 h.
    6. Après l’incubation, laver toutes les bactéries traitées avec du PBS et les étaler sur des plaques de gélose LB. Placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
    7. Comptez le nombre de colonies dans chaque groupe de traitement le lendemain et effectuez une analyse statistique. Il est recommandé d’effectuer cette opération en trois exemplaires pour des raisons d’exactitude statistique.
  2. Etude du mécanisme bactéricide
    1. Préparez les bactéries comme décrit à l’étape 3.1.2 et traitez-les avec soit 5 μM de SBI-0206965 (SBI) pendant 2 h, 0,5 μM de nécrosulfamide (NSA) pendant 1 h, 100 nM de wortmannin (Wort) pendant 30 min, ou 100 nM de Z-VAD-FMK (Z-VAD) pendant 30 min.
    2. Cotraiter les bactéries avec des concentrations différentes de deux tailles de solutions de CuNP, comme décrit à l’étape 3.1.1, en présence ou en l’absence de 5 μM de SBI, 0,5 μM de NSA, 100 nM de moût et 100 nM de Z-VAD.
    3. Centrifuger les bactéries après les traitements modulateurs (étape 3.2.1) et éliminer les surnageants.
    4. Remettre les granulés bactériens en suspension dans les solutions préparées à l’étape 3.2.2 et les incuber en agitant à 200 tr/min à 37 °C pendant 24 h.
    5. Traitez les bactéries avec de l’éthanol à 70 % et du PBS comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Utiliser une solution sans CuNP comme témoin à blanc de CuNP (0 μg/mL ; simulacre) dans les mêmes conditions d’inhibiteur pour chaque groupe. Incuber tous les échantillons pendant 24 heures supplémentaires.
    6. Après l’incubation, ajouter le réactif de viabilité cellulaire aux cultures à un rapport de volume de 1:10. Incuber les cultures pendant encore 2 h en agitant à 37 °C.
    7. Centrifuger les cultures (étape 3.1.2) après les 2 h d’incubation. Transférez les surnageants fluorescents dans des plaques à 96 puits. Mesurez la fluorescence à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 560 nm et d’une longueur d’onde d’émission de 590 nm avec un lecteur de microplaques.
    8. Diluez le surnageant restant à 10-5 et 10-4 et étalez-le sur des plaques de gélose LB pour la culture.
    9. Comptez les colonies individuelles le lendemain.

4. Détection des espèces réactives de l’oxygène

  1. Préparez les cultures bactériennes comme décrit à l’étape 2.3 et divisez-les en tubes de microcentrifugation.
  2. Traiter les bactéries présentant diverses conditions de stress en tant que groupes témoins positifs induisant des ROS (données non présentées dans les résultats). Les traitements sont décrits aux étapes 4.2.1 à 4.2.4.
    1. Exposez les bactéries à une lumière UV de 405 nm pendant 3 h. Incuber les bactéries à 45 °C pendant 2 h.
    2. Ensuite, incubez les bactéries à 4 °C pendant 2 h.
    3. Traiter les bactéries avec 3 % H2O2 pendant 30 min.
    4. Maintenez les bactéries à 37 °C dans le bouillon LB comme témoin négatif.
  3. Préparez diverses concentrations de CuNP comme décrit à l’étape 3.1.1 et traitez les bactéries avec des CuNP de 20 nm ou de 60 nm à des concentrations de 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL et 100 μg/mL pendant 24 h.
  4. Lavez les bactéries incubées deux fois avec du PBS pour éliminer les nanoparticules restantes.
  5. Préparer le colorant diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA) dans du PBS à une concentration finale de 5 μM.
  6. Remettre en suspension les pastilles bactériennes dans 5 μM de DHFDAH2et mesurer l’intensité de fluorescence à une émission de 520/30 nm à l’aide d’un cytomètre en flux.
    REMARQUE : L’intensité de la fluorescence verte FL1 est en corrélation avec le niveau de ROS dans la culture traitée. Il est recommandé d’effectuer cette opération en trois exemplaires pour plus de précision statistique.

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Résultats

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Activités antimicrobiennes de CuNP de deux tailles chez trois agents pathogènes
Trois agents pathogènes opportunistes (E. coli, S. aureus et A. baumannii) ont été utilisés pour tester les activités bactéricides des CuNP. Les bactéries ont été traitées avec des concentrations de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL et 100 μg/mL de CuNP de 20 nm ou de 60 nm, et les activités bactéricides ont été déterminées à l’aide de la concentration bactéricide minimale (MBC) dériv...

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Discussion

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Cette étude a examiné les effets antimicrobiens et les mécanismes des CuNP de deux tailles et de concentrations variées contre E. coli, S. aureus et A. baumannii. En utilisant les protocoles établis, il a été observé que les effets bactéricides induits par CuNP impliquent un stress oxydatif et une activation potentielle de la PCD. Cependant, l’interaction entre l’homéostasie des métaux et les réponses bactériennes au stress reste largement inexplorée. Des étude...

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Déclarations de divulgation

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L’auteur ne déclare aucun conflit d’intérêts, financier ou autre.

Remerciements

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Nous sommes reconnaissants du soutien du Core Facility Center de l’Université Tzu Chi, à Taïwan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acinetobacter baumannii souche Bouvet et Grimont  ;American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, États-Unis17978Bactéries pour l’expérience de toxocité CuNP
Bio-Rad iMark Lecteur de microplaquesBio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis168-1130Utilisé pour mesurer l’absorbance dans les essais de viabilité bactérienne.
diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine perméable aux cellules  ; (H2DCFDA)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, États-UnisD6883Utilisé pour détecter les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules bactériennes traitées.
Nanoparticules de cuivre (CuNPs) 25 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis774081Utilisé pour préparer une solution mère de CuNP
Nanoparticules de cuivre (CuNPs) 60-80 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis774103 Utilisépour préparer une solution mère de CuNP
Escherichia coli (Migula) Castellani and ChalmersAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA25922Bactérie pour l’expérience de toxocité CuNP
Cytomètre en flux GalliosBeckman Coulter, Brea, CA, États-UnisUtilisé pour l’analyse cytométrique en flux dans de multiples expériences, y compris la détection d’espèces réactives de l’oxygène.
LBagar FocusBio, Miaoli, TaïwanLBA500Utilisé pour la culture de bactéries
Luria-Bertani (LB)bouillon Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA244620Utilisé pour la culture
de bactéries Necrosulfonamide (NSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA480073Utilisé comme modulateur pour le prétraitement dans les études de voie de mort bactérienne.
PrestoBlue Réactif de viabilité cellulaireInvitrogen, Carlsbad, CA, USAP50200Utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire par fluorescence.
SBI-0206965 (SBI)BioVision, Milpitas, CA, USA9580Utilisé comme modulateur pour le prétraitement dans les études sur la voie de mort bactérienne.
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAL4509Utilisé comme dispersant pour les nanoparticules de cuivre afin de réduire l’agrégation.
Staphylococcus aureusAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, États-Unis
Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taïwan		13567Bactéries pour l’expérience de toxocité CuNP
Lecteur de microplaques multimode Varioskan LUXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisVLBLATGD2Utilisé pour mesurer la fluorescence dans les tests de viabilité cellulaire
Wortmannin (Wort)Abcam, MA, USAab120148Utilisé comme modulateur pour le prétraitement dans les études de voie de mort bactérienne.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisV116Utilisé comme modulateur pour le prétraitement dans les études de voies de mort bactérienne.

Références

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Mots-clés

Nanoparticules de cuivreEsp ces r actives de l oxyg neAutophagie bact rienneEssai de colony forming unitNanomat riaux antimicrobiensEscherichia coliStaphylococcus aureusAcinetobacter baumanniiR sistance aux antibiotiques

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