Article de méthode

Isolement rapide de vésicules extracellulaires dérivées du lait maternel humain

805 vues

⸱

DOI :

10.3791/67954

⸱

14 novembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

Dans cet article

Résumé

Ce protocole est conçu pour accélérer et permettre l’isolement efficace des vésicules extracellulaires du lait maternel humain de haute pureté.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE), des particules de taille nanométrique d’environ 20 à 1000 nm, attirent rapidement l’attention pour leur potentiel thérapeutique. Plus précisément, il a été démontré que les vésicules extracellulaires dérivées du lait maternel humain (HBMDEV) confèrent une protection dans des modèles expérimentaux d’entérocolite nécrosante, une maladie intestinale qui affecte principalement les prématurés, entraînant une mortalité pouvant atteindre 50 %. Cependant, les techniques traditionnelles d’isolement des vésicules extracellulaires, telles que l’ultracentrifugation différentielle, la chromatographie d’exclusion stérique, etc., prennent du temps ou nécessitent des instruments spécialisés, ce qui n’est pas pratique en milieu clinique. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point une méthode d’isolement simple qui permettra une administration réactive rapide de HBMDEV aux patients. On propose ici une combinaison de centrifugation du lait maternel humain pour éliminer les graisses et les débris cellulaires, couplée à une ultrafiltration rapide du lait écrémé restant qui produit des vésicules extracellulaires fonctionnelles à haut rendement. L’utilisation de cette technique peut permettre l’utilisation des HBMDEV comme option thérapeutique pratique en milieu clinique.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules omniprésentes d’une taille d’environ 20 à 1000 nm, soit par des voies endosomiques (lorsque les corps microvésiculaires fusionnent avec la membrane plasmique, ce qui facilite la libération de la cargaison cellulaire dans l’espace extracellulaire), soit par des voies de membrane plasmique (c’est-à-dire le bourgeonnement). Les VE contiennent des cargaisons cellulaires hôtes telles que des lipides, des protéines, des acides nucléiques, divers métabolites et d’autres contenus en fonction de leur source. De plus, les VE sont importants dans la communication intercellulaire, l’angiogenèse, l’immunosuppression, le remodelage du microenvironnement tumoral, la progression du cancer, etc.1,2,3,4. Notamment, le lait maternel humain (HBM) est riche en VE et facilement accessible aux mères allaitantes5. Récemment, les VE dérivées du lait maternel humain (HBMDEV) ont attiré l’attention en tant que vecteurs thérapeutiques pour le traitement de la maladie 1,2. Les nouveau-nés prématurés ou de faible poids à la naissance sont sensibles à plusieurs infections, y compris l’entérocolite nécrosante. L’entérocolite nécrosante, caractérisée par une nécrose iléale ou colique, va d’une légère inflammation intestinale à une défaillance multisystémique avec un taux de mortalité infantile pouvant atteindre 50 %6. Le prétraitement avec des VE dérivés du lait maternel est suffisant pour protéger contre l’inflammation intestinale dans des modèles expérimentaux d’ECN in vitro et in vivo 2,7. Par conséquent, l’utilisation de HBMDEV peut être une option viable pour le traitement de l’ECN en milieu clinique.

Malgré les promesses thérapeutiques des HBMDEV, les techniques d’isolement actuelles présentent des limites connues en ce sens qu’elles prennent du temps ou nécessitent un équipement spécialisé, ce qui n’est pas universellement pratique en milieu clinique. L’isolement des VE implique plusieurs cycles d’ultracentrifugation différentielle, ce qui, bien qu’il produise un rendement satisfaisant des VE, peut avoir un impact sur leur intégrité structurelle et leur fonctionnalité 8,9. De plus, les temps d’ultracentrifugation peuvent être de 2 h au minimum, une ressource coûteuse en milieu clinique9. Les kits d’isolation se sont avérés à la fois rapides et quelque peu rentables. Cependant, l’isolement à l’aide de ces méthodes entraîne également de faibles rendements et donc une faible évolutivité. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de techniques d’isolation HBMDEV qui permettent à la fois de gagner du temps et d’être rentables sans sacrifier le rendement des VE.

Ce protocole vise à décrire une méthode étape par étape pour isoler rapidement les VE de la HBM à l’aide d’outils existants cliniquement disponibles et approuvés par la FDA. Pour ce faire, une centrifugation standard et un système d’extension de filtre de qualité clinique ont été utilisés pour isoler les VE des HBM. Ces vésicules se situent dans la gamme de taille attendue, présentent une morphologie compatible avec les VE connues, sont enrichies en marqueurs de VE et fonctionnellement similaires aux VE isolées à l’aide de techniques d’isolement par ultracentrifugation traditionnelles. Ainsi, ce protocole d’isolement des VE HBM peut permettre une isolation et une application pratiques et rapides des VE isolés de la HBM en milieu clinique.

Protocole

Le lait maternel a été collecté dans l’unité régionale de soins intensifs de l’Université de l’Alabama à Birmingham (UAB). Des échantillons récupérés ont été prélevés après que le lait maternel ait été décongelé pour l’utilisation de la patiente, et la patiente n’a pas été en mesure de prendre toute la tétée. Ces repas sont normalement jetés, mais ont été collectés à des fins de recherche. Des échantillons ont été prélevés sur des individus anonymisés et conservés à −80 °C jusqu’au moment des expériences. La collection a été approuvée par le protocole du comité d’examen interne de l’UAB N160203002. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Isolement des vésicules extracellulaires (ultracentrifugation différentielle)

  1. Dans une enceinte de biosécurité, diluer le lait maternel à 1:10 dans du PBS stérile dans un tube conique de 15 ml.
  2. Centrifuger le lait maternel à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, il doit y avoir 3 couches distinctes : la matière grasse du lait (couche supérieure), le lactosérum ou le lait écrémé (couche aqueuse moyenne), et les cellules et autres débris (granulés au fond). Dans une enceinte de biosécurité, filtrez les couches de matière grasse du lait et de lactosérum à travers un filtre de 70 μm (permet d’éliminer plus facilement la graisse) tout en laissant la pastille intacte. Transférez le flux vers un nouveau tube.
  3. Centrifuger l’échantillon à 2600 x g pendant 10 min à 4 °C. La matière grasse résiduelle du lait, les cellules et les débris sont éliminés au cours de cette étape. Dans une enceinte de biosécurité, filtrez le surnageant à travers un filtre de 70 μm. Transférez le surnageant dans un tube d’ultracentrifugation. Confirmer qu’il y a au moins 10 ml de liquide dans le tube avant l’ultracentrifugation.
  4. Ultracentrifuger l’échantillon à 20 000 x g pendant 45 min à 4 °C. Après l’ultracentrifugation, il peut y avoir trois couches similaires à l’étape 1.2 : la matière grasse du lait, le lactosérum ou le lait écrémé, et les cellules et autres débris. Dans une enceinte de biosécurité, filtrez les couches de matière grasse du lait et de lactosérum à travers un filtre de 70 μm sans déranger le granulé. Transférez le surnageant dans un tube conique de 15 ml.
  5. Dans une enceinte de biosécurité, la seringue filtre le lait maternel à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Transférez le surnageant dans un nouveau tube d’ultracentrifugation. Confirmer qu’il y a au moins 10 ml de liquide dans le tube avant l’ultracentrifugation.
  6. Ultracentrifugeuse l’échantillon à 110 000 x g pendant 70 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de PBS stérile.
  7. Ultracentrifuger à nouveau l’échantillon à 110,00 x g pendant 70 min à 4 °C.
  8. Dans une enceinte de biosécurité, remettre la pastille en suspension dans 150-200 μL de PBS stérile.

2. Isolement des vésicules extracellulaires (méthode de filtration rapide)

  1. Dans une enceinte de biosécurité, diluer le lait maternel (1:10) dans du PBS stérile.
  2. Centrifuger le lait maternel à 300 x g pendant 10 min à 4°C. Après la centrifugation, il doit y avoir trois couches distinctes : la matière grasse du lait (couche supérieure), le lactosérum ou le lait écrémé (couche aqueuse moyenne) et les cellules et autres débris (granulés dans la couche inférieure). Dans une enceinte de biosécurité, filtrez les couches de matière grasse du lait et de lactosérum à travers un filtre de 70 μm (permet d’éliminer plus facilement la graisse) tout en laissant la pastille intacte. Transférez le flux vers un nouveau tube.
  3. Centrifuger l’échantillon à 2600 x g pendant 10 min à 4°C. La matière grasse résiduelle du lait, les cellules et les débris sont éliminés au cours de cette étape. Dans une enceinte de biosécurité, filtrer le surnageant à travers un filtre de 70 μm. Transférer le surnageant dans un tube de 15 mL.
  4. Dans une enceinte de biosécurité, amorcez un ensemble d’extension de filtre de 16 pouces de 0,22 μm avec 5,4 mL de PBS.
    1. Pour le système principal, prendre 5,4 mL de PBS stérile dans une seringue et rincer le système jusqu’à ce que le PBS s’écoule de l’autre extrémité de la tubulure.
  5. La seringue filtre le lait maternel à travers un kit d’extension de filtre de 0,22 μm de 16 pouces. La matière grasse résiduelle du lait, les cellules et les débris sont éliminés au cours de cette étape.
    REMARQUE : Plus d’un jeu d’extension de filtre peut être nécessaire en fonction de la quantité de débris présents dans l’échantillon.
  6. Recueillir le flux continu dans un tube conique de 15 mL.

3. Analyse du suivi Nanosight

  1. Diluer l’échantillon (1:1000) dans du PBS stérile. Les échantillons filtrés rapidement peuvent être utilisés non dilués.
  2. Vortex brièvement l’échantillon. Versez 1 mL de l’échantillon dans une seringue à tuberculine.
  3. Fixez la seringue à l’appareil d’injection et fixez la seringue.
  4. Réglez la pompe d’injection sur 50. Allumez l’appareil photo pour vous assurer que les particules observées ne sont ni trop nombreuses ni trop nombreuses. Assurez-vous que le flux de particules est constant, sans sauts ou sauts soudains dans le flux d’échantillons.
  5. Réglez la pompe d’injection sur 100. Exécutez le protocole.
    REMARQUE : Le logiciel a été configuré pour être lu une fois par minute pour un total de 5 lectures.
  6. Lisez l’exemple.
  7. Rincez Nanosight entre les échantillons avec du PBS.
    REMARQUE : Un système d’analyse de suivi des nanoparticules a été utilisé pour déterminer la taille des particules et la concentration de particules par millilitre. La concentration moyenne de l’échantillon ultracentrifugé était de 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 particules/mL, tandis que la méthode de filtration rapide était de 5,50e+08 +/- 1,16e+08 particules/mL.

4. Coloration négative des vésicules extracellulaires et microscopie électronique à transmission

REMARQUE : Des échantillons dont la concentration d’exosomes se situait entre 10et 8 ont été utilisés pour la microscopie électronique à transmission (MET).

  1. Grilles EM en cuivre recouvertes d’un film de carbone pendant 25 s à 20 mA à l’aide de l’appareil de décharge.
  2. Chargez 7 μL de la solution de suspension EV sur le réseau et incubez pendant 1 min.
  3. Mèchez l’excès avec du papier filtre Whatman en évacuant l’échantillon par le dessous de la grille pour « tirer » l’échantillon vers la grille plutôt que de l’en éloigner.
  4. Colorer immédiatement l’échantillon avec 7 μL de solution d’acétate d’uranyle (UA) filtrée à 1 % sur la surface de la grille EM à l’aide d’une pipette.
  5. Après 15 s, l’excès de solution UA a été éliminé de la grille en contactant le bord de la grille avec du papier filtre. Visualisez l’échantillon immédiatement (dans les 24 heures) sur le TEM à 80 kv.

5. Concentration en protéines

  1. L’acétone précipite 250 μL de VE purifiés (1:4) pendant 1 h à -20 °C.
    REMARQUE : Utilisez 100 μL d’exosomes purifiés pour la méthode d’ultracentrifugation.
  2. Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 30 min.
  3. Faites sécher la pastille à l’air, puis la remplacez en suspension dans 100 μL de tampon RIPA.
  4. Suivez le protocole du kit de dosage des protéines BCA pour déterminer les concentrations de protéines. L’absorbance a été mesurée à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    REMARQUE : 1 mL de lait maternel produit normalement environ 1,3 μg/mL de protéines par ultracentrifugation et environ 0,2 à 1 μg/mL de protéines par filtration rapide.

6. Transfert Western

  1. Incuber un échantillon de protéines de 1 volume à l’aide d’un marqueur de couloir de 4 volumes, réduire le tampon d’échantillon et le faire bouillir pendant 7 minutes à 90 °C.
  2. Chargez et exécutez 10 μg de protéines sur un gel SDS 10 % à 70 V pendant 15 min. Ensuite, augmentez la tension à 100 V et faites fonctionner pendant 90 minutes supplémentaires.
  3. Transférez le gel sur une membrane de nitrocellulose à l’aide de l’appareil semi-sec pendant 30 min à 15 V.
  4. Laver la membrane 3 fois avec du TBS-0.1 % Tween (TBS-T) pendant 10 min chacune.
  5. Bloquez la membrane pendant 30 minutes à l’aide d’une solution tampon de blocage rapide (diluée à 1x).
  6. Incuber l’anticorps primaire (Hsp70-1:1000 ; CD63-1:1000 et CD9-1:1000) dans 1x solution tampon, toute la nuit à 4°C sur un rocker 10,11,12.
  7. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec du TBS-T.
  8. Ajouter (H+L) l’anticorps secondaire anti-souris conjugué HRP, à une dilution de 1:1000 pour toutes les protéines interrogées (Hsp70, CD9 et CD63) dans du lait à 2 % dans du TBS-T et incuber pendant 2 h à température ambiante sur une bascule.
  9. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec du TBS-T.
  10. Développer à l’aide de l’ECL (1:1) et filmer avec le révélateur.

7. Culture in vitro de cellules IEC-6

  1. Ensemencez 1,0 x 106 cellules dans une fiole T-25 dans 5 mL de milieu RPMI complet. Laissez les cellules adhérer pendant la nuit.
  2. Retirer le support complet et laver avec 1 à 2 ml de PBS.
  3. Aspirez le PBS et ajoutez 5 ml de RPMI complet sans VE.
  4. Ajouter une concentration finale de 400 μMH2O2 par puits et 10 μg/mL de VE simultanément dans les cellules pendant la nuit.
  5. Retirer le milieu et laver les cellules avec 1 à 2 ml de PBS.
  6. Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine.
    1. Placez les cellules dans l’incubateur à 37°C pendant 5 min.
  7. Désactivez la trypsine en ajoutant le double du volume de RPMI complet. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à 125 x g pendant 5 min.
  8. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS.
  9. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.

Résultats

Isolation des VE par ultracentrifugation et isolation rapide
D’un point de vue dogmatique, l’isolement des VE à partir des HBM implique une centrifugation pour éliminer la matière grasse du lait et d’autres grosses particules, suivie d’un filtrage, de plusieurs cycles d’ultracentrifugation et d’une remise en suspension de l’échantillon enrichi en VE dans du PBS. La méthode de filtration rapide utilise la centrifugation pour éliminer la matière grasse du lait et les débris cellulaires, suivie d’une filtration via un filtre d’extension de filtre de 0,22 μm, éliminant davantage les débris résiduels, ce qui donne un échantillon enrichi en EV comparable à l’ultracentrifugation traditionnelle (Figure 1).

Caractérisation des HBMDEVs à partir du système de filtration rapide d’extension de filtre
L’analyse du suivi Nanosight a révélé une taille de particule comparable entre les HBMDEV ultracentrifugés (Figure 2A) et les HBMDEV isolés par filtre rapide (Figure 2B). Les deux méthodes indiquent que les VE isolés ont une taille moyenne d’environ 100 nm. Les VE transportent diverses cargaisons (protéines, lipides, miARN, etc.) pour la sécrétion des cellules hôtes vers leurs diverses cibles. Par conséquent, la première protéine cible examinée était la protéine de choc thermique 70 (Hsp70), une protéine connue pour être transportée par les VE13. L’analyse par transfert Western montre que les VE isolés à l’aide de la filtration rapide ont montré une expression de Hsp70 comparable à celle des véhicules isolés par ultracentrifugation (figure 3A et figure supplémentaire 1A). De plus, les VE peuvent être identifiés par l’expression en surface de tétraspanines telles que CD9 et CD6314. L’analyse par transfert Western a révélé que les VE isolés par filtration rapide expriment effectivement le CD9 (figure 3B et figure supplémentaire 2B) et le CD63 (figure 3C et figure supplémentaire 3C). Enfin, l’analyse morphologique des HBMDEVs par microscopie électronique à transmission a révélé une morphologie des vésicules similaire entre les deux techniques d’isolement (Figure 4A-D).

Plusieurs laboratoires ont montré que les VE confèrent des propriétés protectrices qui favorisent la survie cellulaire pendant le stress cellulaire 2,3,7. À l’instar de rapports précédemment publiés, les VE isolés à l’aide de la méthode de filtration rapide sont capables de protéger les cellules épithéliales intestinales (IEC-6) contre la mort cellulaire induite par le peroxyde d’hydrogène2 (Figure 5A,B). Ces données suggèrent que les HBMDEV isolés à l’aide de la méthode de filtration rapide possèdent non seulement des qualités comparables à ceux isolés à l’aide de l’ultracentrifugation différentielle, mais sont également fonctionnellement similaires.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma délimitant les différences entre les méthodes d’ultracentrifugation et de filtration rapide de l’isolement des VE à partir du lait maternel humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Analyse de suivi Nanosight des VE isolés du lait maternel humain à l’aide de l’ultracentrifugation et de la méthode de filtration rapide. (A) NTA des VE du lait maternel humain (dilué 1:1000 dans 1x PBS) isolés par ultracentrifugation. Les données présentées sont une représentation unique de 3 à 4 essais indépendants. (B) NTA des VE du lait maternel humain isolés par filtration rapide. Les données présentées sont une représentation unique de 3 à 4 essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Analyse par Western blot de VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. (A) Exposition d’une seconde à 10 μg de protéine de choc thermique 70 (Hsp70). « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons obtenus par filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. L’image ci-dessous représente l’un des quatre essais indépendants. (B) Exposition de 10 μg de CD9 pendant vingt-deux-secondes. « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons de filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. L’image ci-dessous représente l’un des quatre essais indépendants. (C) Exposition de 22 secondes à 10 μg de CD63. « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons de filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. L’image ci-dessous représente l’un des quatre essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Analyse en microscopie électronique à transmission de VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. (A) Micrographie électronique de VE isolés par ultracentrifugation à un grossissement de 8 000×. Barre d’échelle = 800 nm. L’image présentée représente l’un des trois essais indépendants. (B) Micrographie électronique de VE isolée par ultracentrifugation à un grossissement de 20 000 ×. Barre d’échelle = 200 nm. L’image présentée représente l’un des trois essais indépendants. (C) Micrographie électronique de VE isolés à l’aide d’une filtration rapide à un grossissement de 8 000 ×. Barre d’échelle = 800 nm. Les VE ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. L’image présentée représente l’un des trois essais indépendants. (D) Micrographie électronique de VE isolés à l’aide d’une filtration rapide à un grossissement de 20 000×. Barre d’échelle = 200 nm. Les VE ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. L’image présentée représente l’un des trois essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Analyse fonctionnelle de VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. (A) Viabilité cellulaire des cellules IEC-6 cultivées dans un milieu RPMI-1640 complet sans EV. Les cellules ont été traitées pendant la nuit avec 400 μMH2O2 et 10 μg/mL de VE simultanément. Les données présentées représentent l’un des deux essais indépendants. (B) Nombre de cellules IEC-6 cultivées dans un milieu RPMI-1640 complet sans EV. Les cellules ont été traitées pendant la nuit avec 400 μMH2O2 et 10 μg/mL de VE simultanément. Les données présentées représentent l’un des deux essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Caractérisation par transfert Western de Hsp70 dans des VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. Exposition d’une seconde à 10 μg de protéine de choc thermique 70 (Hsp70). « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons de filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. Chaque échantillon représente une seule répétition biologique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Caractérisation du CD9 par transfert Western dans les VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. Exposition de cinq minutes à 10 μg de CD9. « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons de filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. Chaque échantillon représente une seule répétition biologique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Caractérisation du CD63 par transfert Western dans les VE isolés par ultracentrifugation et filtration rapide. Exposition de dix minutes à 10 μg de CD63. « L » signifie échelle, « U » signifie ultracentrifugation et « R » signifie filtration rapide. Les échantillons de filtration rapide ont été concentrés par centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min, réalisée deux fois. Chaque échantillon représente une seule répétition biologique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les VE attirent l’attention car la littérature suggère qu’ils peuvent réguler divers mécanismes inflammatoires et offrir des avantages protecteurs 2,7. Cependant, une limite de l’utilisation pratique des VE en milieu clinique est le temps nécessaire pour isoler les VE et obtenir un rendement suffisant 8,15. Ici, un protocole étape par étape pour l’isolation rapide et efficace des VE du HBM à l’aide d’un système de filtration approuvé par la FDA a été décrit. L’utilité de cette méthode réduit de moitié les méthodes traditionnelles d’isolation des véhicules électriques sans sacrifier le rendement. Par conséquent, ce protocole pourrait permettre une application thérapeutique pratique des VE dérivées du lait maternel humain dans un cadre clinique, si la thérapie par VE est approuvée dans un avenir prévisible.

Les protocoles d’isolement existants ont démontré un rendement constant et efficace des VE à partir de leur fluide source. Cependant, les moyens d’isolation traditionnels, qu’il s’agisse de l’étalon-or, de l’ultracentrifugation différentielle ou de l’utilisation de kits commerciaux, ne sont pas sans limites. L’isolation des VE par ultracentrifugation différentielle, bien qu’efficace, prend du temps avec des protocoles impliquant des temps d’essorage combinés d’un minimum de ~3 h 2,8,15. Le temps d’isolement combiné à des protocoles permettant de quantifier correctement le nombre de VE, ce qui rendrait difficile leur utilisation dans un cadre clinique sous des contraintes de temps. De plus, les kits commerciaux, bien qu’efficaces, sont coûteux. De plus, le nombre d’échantillons pouvant être traités par kit est faible, compte tenu des coûts élevés de ces kits 8,15.

Ce protocole offre une solution à ces limitations qui permet d’économiser du temps et de l’argent sans sacrifier le rendement ou la pureté des VE. Pour que ce protocole soit efficace, il y a des étapes clés qui doivent être suivies lors de la mise en œuvre du protocole. La dilution et la centrifugation initiale du lait maternel humain sont nécessaires pour éliminer les débris extracellulaires et la matière grasse du lait de l’échantillon de lait. L’élimination de ces débris est essentielle pour éviter l’obstruction du système d’extension du filtre et évite ainsi d’avoir à utiliser plusieurs filtres pour un seul échantillon. De plus, le rinçage du système d’extension du filtre avec du PBS est essentiel car il amorce le filtre en préparation de l’échantillon. L’amorçage permet de s’assurer que l’échantillon n’est pas perdu pendant le processus d’amorçage. Il convient de noter que, selon le contenu de l’échantillon de lait maternel, plus d’un ensemble d’extension de filtre peut être nécessaire, indépendamment de la dilution et de la centrifugation de l’échantillon avant la filtration. Dans ce cas, plus d’un filtre peut être utilisé ; Cependant, le nouveau kit d’extension de filtre doit être amorcé avant la filtration de l’échantillon.

Ce protocole est efficace et cohérent pour isoler les VE du lait maternel humain, cependant, il y a quelques limites à prendre en compte. Les étapes de centrifugation (~20 min de temps total entre les deux essorages) avant la filtration de l’échantillon sont nécessaires. Les tentatives de filtrage de l’échantillon dilué sans centrifugation entraîneront un colmatage répété du système d’extension du filtre, une perte d’échantillon et ajouteront du temps supplémentaire au protocole d’isolation EV. De plus, l’échantillon n’était pas pur, comme en témoignent les analyses NTA et TEM. Les tentatives d’utilisation d’échantillons qui n’ont pas été centrifugés avant la filtration peuvent introduire des contaminants indésirables dans l’échantillon, ce qui peut produire des effets hors cible en fonction de l’application future en aval de VE isolés. De plus, ce protocole n’a été mis en œuvre qu’en ce qui concerne l’isolement des VE du lait maternel humain. Par conséquent, l’efficacité de ce protocole isolé des VE d’autres fluides n’a pas été étudiée. Étant donné la nature aqueuse de tous les fluides corporels, on ne s’attend pas à ce qu’il y ait des différences dans la pureté et le rendement des VE si ce protocole est utilisé pour isoler les VE d’autres sources.

Il convient également de noter que ce protocole est efficace pour isoler les petites vésicules extracellulaires (sEV). Selon la NTA, les VE dérivées de HBM avaient une taille de ~100 nm, ce qui suggère que des VE plus grandes n’étaient pas présentes dans l’échantillon. La raison en est que les échantillons ont été filtrés à l’aide d’un filtre de 0,22 μm, qui est principalement utilisé pour l’isolement des exosomes et d’autres VE plus petits, un objectif principal du laboratoire au moment de cette étude. En théorie, l’utilisation d’un filtre avec des pores de plus grande taille peut permettre d’isoler les VE plus grands. Cependant, ces questions dépassent le cadre de la présente étude.

Les VE dérivées du lait maternel humain représentent une source thérapeutique naturelle facilement accessible pour un usage clinique. L’une des limites à l’introduction du travail sur les VE en milieu clinique est l’isolement des VE dans une méthode pratique que n’importe quel établissement pourrait potentiellement utiliser. Ce protocole est conçu pour surmonter cette limitation et peut facilement être appliqué en milieu hospitalier et mis en œuvre à l’aide d’un système de filtration existant de qualité hospitalière, approuvé par la FDA, disponible dans le commerce, ou peut être acheté pour beaucoup moins cher que l’ultracentrifugeuse standard. Cette méthode est rentable et produit un échantillon pur et riche en VE à partir d’un système de filtration déjà utilisé en milieu clinique.

Déclarations de divulgation

L’auteur n’a déclaré aucun conflit d’intérêts potentiel en ce qui concerne la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article.

Remerciements

Des images et des figures ont été générées à l’aide de biorender.com. Les recherches dont il est question dans cette publication ont été financées par l’UAB High Resolution Imaging Facility. Ce travail a été soutenu par NIH/NICHD 5R21HD104481.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(H+L) Anti-souris conjugué HRPBio-Rad1721011
(H+L) Anti-lapin conjugué HRPBio-Rad1706515
Filtre à seringue 0,20Fisherbrand09-719C
Filtre à cellules μm 0,70Corning431751
1,5 million Tris HCLFabriqué en interne
Tubes de 15 mLFaucon352096
Ensemble d’extension de filtre 16 poucesB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Tubes de 50 mLFaucon353070
Tampon d’échantillon 5 fois réducteurThermo Scientific39000
AcylamideFisher Scientifc  ;BP1410-1
Amphotéricine BGibco15290-018
Appareil photo AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSThermo Scientific17874
Kit de test protéique BCAPierce23227
Tubes BeckmanBeckman coulter  ;344059
BrightStar ECL ChimiluminescentAlkali ScientificXR92
FBS épuisé par les exosomesFisher ScientificNC0464480
Tampon de blocage rapidePierce37575
Sérum fœtal bovinTechnologies de vie10082147
Hsp70InvitrogenMA3-006
Insuline humaineSigma-AldrichI9278-5ML
Peroxyde d’hydrogèneFisher ScientificH325-500
IEC-6  ;ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Tampon d’échantillon de réduction du marqueur de voieThermo Scientific39000
Lait en poudreBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Membrane de nitrocelluloseTechnologies de vie88018
Appareil de décharge PELCO easiGlowTed Pella
Mini-comprimés inhibiteurs de protéasePierceA32955
Tampon RIPAPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc  ;11875119
SDSFisher Scientifc  ;BP2436-200
Flasque T-25Thermo Scientific156367
TBSFabriqué en interne
TEMEDBio-Rad161-0801
Trypsine EDTAGibso25200-056
Préadolescent 20Thermo ScientificJ20605-AP

Références

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

VE du lait maternelfiltration rapideultracentrifugationisolement des exosomesWestern blotmicroscopie électronique à transmissionsuivi NanoSightmarqueur CD63
Isolement rapide de vésicules extracellulaires dérivées du lait maternel humain
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.