Article de méthode

Un test TCID50, rationalisé, sans marqueur, sans marqueur, à la dose infectieuse de culture tissulaire de 50 %, utilisant l’impédance pour la quantification automatisée des titres viraux

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DOI :

10.3791/67956

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9 janvier 2026

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1Agilent Technologies, Inc.

Dans cet article

Résumé

Le test TCID50 présenté ici exploite des mesures d’impédance en temps réel sans étiquetage et le module de virologie du système pour surveiller objectivement en temps réel les effets cytopathiques (CPE) induits par les virus. Ce test simplifié réduit considérablement le temps d’intervention pratique tout en assurant des mesures CPE cinétiques quantitatives à haut débit et permettant des calculs TCID50 automatisés en temps réel.

Résumé

La mesure du titre viral, c’est-à-dire la concentration d’un virus dans un échantillon, est une procédure fondamentale en recherche virologique. Bien que nécessaires, les méthodes traditionnelles comme le test de plaque et le test TCID50 peuvent être longues, nécessiter la coloration ou le marquage des réactifs, et impliquent souvent une interprétation subjective, en particulier lorsque les effets cytopathiques (EPC) sont subtils ou difficiles à quantifier par imagerie. Par exemple, les tests TCID50 peuvent utiliser des colorants de viabilité comme MTT ou MTS, tandis que les tests de plaques reposent sur l’imagerie et la coloration pour visualiser les plaques virales, qui peuvent introduire une variabilité. De plus, ces méthodes traditionnelles ne fournissent qu’un instantané statique de l’infectivité virale, limitant la capacité à capturer les interactions dynamiques entre les virus et les cellules permissives. Pour surmonter les limites actuelles dans la mesure du titrage viral, un test TCID50 simplifié a été développé utilisant une technologie basée sur l’impédance pour mesurer la CPE de manière objective, non invasive et en temps réel, éliminant ainsi le besoin d’étiquettes. Dans cette étude, deux modèles cellulaires permissifs par le virus ont été utilisés pour valider le test d’impédance TCID50 : l’adénovirus marqué par GFP (Adv-GFP) dans les cellules HEK293A et le virus de la grippe A (IAV) dans les cellules MDCK. Le flux de travail est simple, englobant l’ensemencement cellulaire, l’inoculation virale, la surveillance en temps réel et l’analyse automatique de TCID50 par le logiciel. Tout au long de l’infection, les valeurs TCID50 ont été calculées automatiquement par le logiciel du système à l’aide de la formule Reed-Muench à tous les moments enregistrés. Les valeurs TCID50 de l’IAV obtenues via des lectures d’impédance étaient comparables à celles générées par le test TCID50 conventionnel basé sur la coloration violette cristalline. Ces résultats démontrent que la quantification du virus peut être réalisée de manière précise et efficace en utilisant la mesure de l’impédance en combinaison avec le module de virologie du logiciel du système. Le nouveau test simplifie les méthodes traditionnelles tout en offrant une meilleure compréhension de la dynamique virale, soutenant ainsi la recherche virologique avancée et élargissant les applications cliniques potentielles.

Introduction

Alors que la recherche en virologie évolue rapidement, la quantification précise de l’infectiosité virale reste cruciale pour comprendre les mécanismes viraux, développer des thérapies antivirales et évaluer l’efficacité des vaccins. L’une des procédures les plus importantes consiste à mesurer le titrage viral, c’est-à-dire la concentration de particules virales dans un échantillon. Le test TCID50, qui quantifie le nombre de particules virales infectieuses nécessaires à la production de CPE dans 50 % des cellules inoculées, est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer le titre viral fonctionnel. Ce test final largement utilisé est particulièrement précieux pour les virus qui ne forment pas de plaques et peut servir d’alternative au testde plaque 1.

En général, le test TCID50 prend de 2 à 14 jours, selon le virus et les cellules permissives. L’EPC, incluant les changements de prolifération cellulaire, de morphologie et de viabilité, est évaluée soit par (1) mesure colorimétrique après l’ajout de réactifs, tels que le test MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltézolium) et le test MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfopényl)-2H-tétrazolium), utilisant un test de lecteurde plaques 2, ou (2) l’évaluation visuelle des changements morphologiques ou liés à la culture à l’aide de plateformes d’imagerie optique — par exemple, évaluer la CPE en mesurant le pourcentagede confluence 3, ou (3) la détection visuelle de la CPE par coloration violette cristalline après fixation de puits traités par virus avec du formol ou du paraformaldéhyde (PFA). Le taux positif d’infection virale dérivé du nombre de réplications CPE-positives à chaque dilution virale est la base du calcul TCID50. La dilution à laquelle 50 % des cultures présentent de l’EPC est calculée statistiquement à l’aide des formulesétablies 4, telles que Reed-Muench, Spearman-Karber et Améliored-Karber, et le résultat est rapporté comme TCID50 par millilitre (TCID50/mL).

Les tests traditionnels TCID50 et les tests de plaques sont largement reconnus comme la référence en matière de quantification virale fonctionnelle et peuvent fournir des informations précieuses. Cependant, ces tests sont souvent fastidieux, chronophages et nécessitent une coloration manuelle pour visualiser l’EPC, ce qui entraîne un faible débit, un risque accru d’erreur humaine et une subjectivité. Pour les virus hautement contagieux ou létaux, minimiser le temps d’exposition aux virus et réduire les déchets contenant des virus grâce à des étapes supplémentaires, comme la coloration, sont des considérations importantes pour améliorer la biosécurité. À l’exception du test TCID50 basé sur l’imagerie sans marqueur, la plupart des tests TCID50 et de plaques sont également des tests de point final, ce qui peut entraîner un timing sous-optimal pour l’évaluation du titre et limiter la capacité d’observer les interactions dynamiques entre les virus et les cellules hôtes. Pour surmonter ces limites, un test TCID50 simplifié, sans étiquetage et en temps réel a été développé et établi. Bien que conceptuellement similaire au test TCID50 conventionnel, la nouvelle méthode exploite les relevés d’impédance cellulaire, capturés et analysés par le système MP RTCA, pour surveiller l’infection de manière objective et continue dans le temps.

Il a été démontré et vérifié que la biodétection basée sur l’impédance fournit une lecture composite qualitative et quantitative du nombre cellulaire, de la morphologie et de la force d’attache cellule-substrat de manière non invasiveet sans marqueur 5,6. Des études antérieures ont démontré que l’EPC induite par le virus peut être quantifiée avec précision en temps réel à l’aide des mesures d’impédanceRTCA 7,8,9. Au lieu de rapporter des valeurs brutes d’impédance, les systèmes utilisent un paramètre sans unité appelé Indice Cellulaire (IC) pour refléter les variations d’impédance dues aux événements cellulaires. Par exemple, à mesure que les cellules adhèrent, se propagent et se développent au fond du puits, l’IC augmente. Inversement, lorsque les cellules meurent, rétrécissent ou se détachent, comme lors d’une infection virale, l’IC diminue.

Compte tenu des rapports prometteurs utilisant l’impédance pour mesurer l’EPC, cette étude visait à démontrer que le test TCID50 basé sur l’impédance est une alternative fiable et précise à la quantification virale conventionnelle. Le module de virologie du logiciel du système permet le calcul automatisé TCID50 tout au long de la mesure CPE en temps réel, simplifiant et raccourcissant le processus de test tout en fournissant des informations précieuses sur la cinétique de la réplication virale et leur interaction avec les cellules permissives.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Essai TCID50 basé sur l’impédance

REMARQUE : Comme l’illustre la Figure 1 , un test TCID50 basé sur l’impédance se compose de quatre étapes, incluant l’ensemencement cellulaire permissif sur une plaque biosensorie, la préparation et l’inoculation par dilution du virus, la mesure de la CPE sur le système, et enfin, l’analyse des données et le calcul TCID50 utilisant le module de virologie du logiciel du système.

  1. Préparation du test : réanimation et sous-culture des cellules permissives
    REMARQUE : Cette étape doit être réalisée une semaine avant le test. Pour minimiser la variation entre les expériences, il est fortement recommandé de préparer une banque cellulaire de cellules permissives au même nombre de passages pour l’essai. N’utilisez pas de cellules de plus de 15 voies après achat auprès du fournisseur de téléphone.
    1. Dégel préserver les cellules permissives
      1. Un milieu de croissance cellulaire chaud dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 30 minutes. Par exemple, le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine, a été utilisé pour la culture HEK293A.
      2. Décongeler un flacon de cellules de la banque cellulaire cryopréservé pour les tests TCID50 en le faisant doucement tourner dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à la présence de quelques cristaux de glace ; Ne plongez pas le capuchon. Essuyez le flacon avec 70 % d’éthanol et placez-le dans une hotte laminaire.
      3. Transférez doucement les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajoutez 9 mL de milieu de croissance chauffé aux cellules.
      4. Centrifugez la suspension à cellules à 300 x g pendant 4 minutes à température ambiante.
      5. Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 15 mL de milieu de croissance chauffé. Transférez-les dans une nouvelle fiole T75.
      6. Faites croître les cellules jusqu’à une confluence de 80 % à 90 % dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Sous-culture de cellules permissives.
      1. Surveillez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 80 % à 90 %.
      2. Retirez le milieu contenant du sérum de la fiole et rincez doucement la monocouche cellulaire une fois avec la solution de solution sulfureuse phosphatée (DPBS) de Dulbecco, sans Mg et Ca.
      3. Trypsinisez les cellules en répartissant uniformément 2 mL de solution à 0,05 % de trypsine/EDTA par flasque T75 et en laissant la fiole dans un incubateur à 37 °C pendant 1 à 3 minutes.
        REMARQUE : Ne sur-trypsinissez pas les cellules, car cela peut être nuisible aux cellules.
      4. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant 8 mL de milieux contenant du sérum pour diluer le volume initial de trypsine au moins cinq fois. Transférez 2,5 mL de la suspension cellulaire dans un nouveau flasque T75, puis ajoutez 8 mL de milieu de culture.
        REMARQUE : Évitez d’utiliser des cellules permissives fraîchement décongelées pour le test TCID50. Utilisez plutôt des cellules cultivées à 80 % à 90 % de confluence. Pour réduire la variabilité inter-expérimentale, les cellules réanimées doivent être maintenues pendant un maximum de deux semaines après la décongélation. Pour garantir une viabilité cellulaire élevée et une prolifération pendant la culture de deux semaines : (1) changer de milieu de croissance au moins deux fois par semaine ; (2) sous-culture des cellules lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 % à 90 %. Pour une maintenance prolongée au-delà de deux semaines, une validation est requise.
  2. Titer viral
    REMARQUE : Cette étape doit être réalisée dès le premier jour.
    1. Mesure du fond de la plaque biosensore
      1. Transférez soigneusement 50 μL de milieu préchauffé à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal, en utilisant la technique du pipetage inversé pour minimiser la formation de bulles et assurer une distribution volumique constante.
      2. Placez la plaque dans la station de la plaque ; ouvrez le logiciel du système et sélectionnez le module de virologie avant de commencer l’expérience. Saisissez toutes les notes pertinentes dans l’onglet Notes d’Exp , et saisissez les informations de cellule, y compris le nom et le numéro de cellule, dans la sous-languette Cellule de l’onglet Disposition après avoir sélectionné les puits correspondants. Sinon, l’information des cellules peut être saisie après l’ensemencement.
        REMARQUE : La mesure du fond de la plaque doit être effectuée avant d’ajouter des cellules dans les puits de la plaque. Les relevés de fond pour tous les puits devraient indiquer entre -0,063 et 0,063.
      3. Dans l’onglet Planning , cliquez sur le bouton Ajouter une étape pour ajouter l’étape 1, qui est destinée à la mesure du fond de la plaque. Ensuite, lance l’enregistrement en cliquant sur le bouton Démarrer .
      4. Retirez la plaque de la station et replacez-la dans la cagoule pour le semis des cellules.
    2. Ensemencement permissif des cellules sur la plaque biocapteur à 96 puits
      1. Trypsinisez les cellules permissives à partir de la fiole T75.
      2. Comptez les cellules et ajustez la suspension cellulaire à la concentration souhaitée. Dans cette étude, la concentration de HEK293A était de 60 000 cellules/mL.
      3. Ajoutez 100 μL de suspension de cellules à chaque puits de la plaque.
        REMARQUE : La densité cellulaire appropriée est essentielle. Une densité d’ensemencement sous-optimale pourrait entraîner un artefact expérimental. Par conséquent, la densité de semis doit être optimisée avant d’effectuer un test TCID50.
      4. Laissez la plaque dans la hotte à température ambiante pendant 30 minutes après l’ajout de la cellule, permettant ainsi aux cellules de se répartir uniformément au fond du puits.
        REMARQUE : Le non-respect de cette étape pourrait entraîner de grandes variations d’un puits à l’autre.
      5. Placez la plaque dans la station à plaques à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C contenant 5 % deCO2.
      6. Accédez à l’onglet Planning du logiciel et ajoutez l’étape 2 en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut : 100 balayages et un intervalle de 15 minutes. Cela déclenchera la surveillance de l’impédance/IC toutes les 15 minutes, permettant une évaluation en temps réel de l’attache et de la prolifération cellulaire en tant qu’étape de contrôle qualité cellulaire (QC) avant l’inoculation virale.
        REMARQUE : Jour 2 - Pour maximiser la reproductibilité et la cohérence des tests entre les expériences, il est crucial d’évaluer la performance des cellules sur le système avant de passer à l’étape suivante. Puisque l’IC reflète l’attachement et la croissance cellulaires, les valeurs d’IC durant la période de 20 à 28 heures après l’ensemencement servent de paramètre clé de contrôle qualité. La valeur et la cinétique de l’IC sont toutes deux spécifiques à chaque cellule. Dans cette étude, pour HEK293A cellules semées à 6 000 cellules par puits et cultivées pendant 20 à 28 heures, l’IC devrait dépasser 2. Si l’IC n’atteint pas 2 dans les 20 à 28 heures suivant le semis, la culture cellulaire HEK293A est considérée comme ayant échoué au contrôle qualité (QC), et le test TCID50 qui suit ne sera pas réalisé. Ce critère garantit une grande reproductibilité des résultats expérimentaux.
    3. Préparation des dilutions en série virale
      1. Calculez le volume total du milieu (DMEM + 2 % FBS + 1 % pénicilline / streptomycine) nécessaire pour préparer les dilutions, et réchauffez-le dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes. Le support sera utilisé pour le reste de l’expérience.
      2. Décongelez rapidement un flacon de stock viral aliquoté dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que tous les cristaux de glace aient fondu.
      3. Préparez des virus dilués en série 10 fois en transférant 20 μL du stock viral dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 180 μL de milieux préchauffés à chaque étape. Faites une pipette vers le haut et le bas pour assurer un mélange complet du milieu et du virus.
        REMARQUE : Ne plongez pas trop profondément la pointe de la pipette dans la solution virale afin d’éviter de transporter un excès de résidus de particules virales à l’extérieur de la pointe, ce qui pourrait entraîner des dilutions imprécises.
      4. Pour éviter les fluctuations des indices d’impédance causées par l’ajout d’échantillons du virus du rhume, équilibrez les dilutions virales en les incubant dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 20 minutes avant l’inoculation.
    4. Saisissez les informations sur le traitement du virus dans l’onglet Mise en page
      1. Dans l’onglet Disposition des plaques du logiciel ; sélectionner les puits pour le traitement du titrage viral ; cliquez sur la sous-tabulation Traitement, et saisissez la dilution initiale, par exemple, 0,001 (10-3) dans cette expérience ; entre 10 comme le « facteur de dilution » ; sélectionnez la direction de dilution, de gauche à droite dans ce cas. La dilution virale sera automatiquement calculée en fonction de l’entrée de disposition des plaques et affichée dans chaque puits correspondant.
      2. Ensuite, saisissez le volume d’inoculation du virus et cliquez sur le bouton Appliquer pour enregistrer toutes les informations sur le traitement. Cette étape est essentielle pour calculer avec précision le TCID50/mL lors de l’analyse des données.
      3. Assignez les puits qui ne seront pas traités par des virus comme contrôles négatifs en sélectionnant les puits appropriés puis en cochant Ctrl négatif sous Type de puits dans l’onglet Traitement .
        REMARQUE : Les puits de contrôle négatif doivent être désignés et ajoutés à la page de mise en page ; Une omission empêchera le calcul TCID50.
    5. Inoculation virale
      1. Lorsque vous êtes prêt, appuyez sur le bouton Pause dans le logiciel pour arrêter l’acquisition de données. Retirez la plaque de la station et placez-la dans la hotte laminaire.
      2. Retirez soigneusement le milieu de culture des puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanal.
      3. Ajoutez doucement 50 μL de dilution virale à l’aide d’une pipette multicanal sur le dessus de la monocouche cellulaire, évitant ainsi la perturbation de la culture cellulaire.
      4. Replacez la plaque dans la Station et ajoutez l’étape 3 en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut (100 balayages et un intervalle de 15 minutes) dans l’onglet Planification pour reprendre l’impédance d’enregistrement toutes les 15 minutes pendant 2 heures, permettant au virus de se lier aux cellules.
      5. Après 2 heures d’inoculation virale, mettez l’enregistrement en pause et retirez la plaque de la station vers la cagoule laminaire.
      6. Ajoutez lentement 150 μL de milieu préchauffé dans les puits à l’aide d’une pipette multicanal, évitant ainsi la perturbation de la monocouche de la cellule ; Retournez la plaque à la Station.
      7. Reprenez l’étape 3 en cliquant sur Démarrer dans l’onglet Planning . Les signaux d’impédance sont mesurés en continu toutes les 15 minutes pendant toute la période d’inoculation.
    6. Calcul de TCID50 soit pendant, soit après la réalisation du test TCID50
      1. Dans l’onglet Analyse des données , sélectionnez et ajoutez tous les puits utilisés dans l’essai au graphique graphique. L’axe y du graphique est déterminé par l’option sélectionnée dans le menu déroulant de l’axe Y .
      2. Naviguez dans la section Paramètres . Sélectionnez TCID50 dans la liste déroulante des paramètres pour lancer le calcul TCID50.
      3. Choisissez le diagramme à barres pour le calcul du TCID50 à un moment précis ou sélectionnez le TCID50 dépendant du temps pour générer le parcours temporel du TCID50 sur une période souhaitée lors de l’inoculation. Le TCID50/mL sera calculé et affiché après avoir cliqué sur le bouton d’exécution.

2. Analyse Crystal Violet-TCID50

  1. Semez les cellules permissives dans une microplaque à 96 puits à la densité d’ensemencement optimale telle que décrite dans le test TCID50 basé sur l’impédance (étapes 1-2).
  2. Effectuer la préparation par dilution en série virale et l’inoculation telles que spécifiées dans le test TCID50 basé sur l’impédance.
  3. Fixation et coloration
    1. Après l’achèvement du test, éliminez doucement le surnageant de chaque puits et ajoutez 100 μL de formaldéhyde à 4 % pour fixer les cellules.
    2. Incubez à 4 °C pendant 1 heure, puis retirez le fixateur.
    3. Colorez les cellules fixes avec du Crystal Violet à 0,5 % préparé en PBS. Incubez à température ambiante pendant 30 minutes.
    4. Lavez la plaque avec de l’eau du robinet jusqu’à ce que le fond soit dégagé. Laissez l’assiette sécher complètement à l’air avant de marquer.
      REMARQUE : Les déchets violets cristallins sont considérés comme dangereux selon la RCRA et le Code of Regulations de Californie (CCR 66261.24). Rassemblez toutes les solutions de cristal violet usées, les matériaux contaminés (par exemple, essuie-tout, gants) et rincez les déchets dans un contenant désigné pour déchets dangereux. Éliminez les déchets via l’intermédiaire de l’organisme de santé et sécurité environnementale (EH&S) ou d’un entrepreneur agréé pour l’élimination des déchets dangereux.
  4. Évaluation et calcul TCID50
    1. Inspectez visuellement chaque puits pour la CPE. Un puits positif montre une destruction partielle ou totale de la monocouche et une coloration plus légère. Un puits négatif conserve une monocouche intacte avec une tache violette foncée.
    2. Compter le nombre de puits positifs et négatifs pour chaque dilution.
    3. Calculez manuellement TCID50/mL en utilisant la méthode Reed-Muench, en fonction d’un volume d’inoculation de 150 μL.

Résultats

Surveillance dynamique, en temps réel et sans étiquetage de l’EPC médiée par virus en utilisant l’impédance
Pour confirmer que l’EPC induite par le virus peut être mesurée de manière fiable et quantitative par impédance, nous avons d’abord enregistré les changements cellulaires dans HEK293A cellules après une infection par Adv-GFP en utilisant un système RTCA eSight qui mesure simultanément l’impédance et capture des images de cellules vivantes provenant d’une même population cellulaire, fournissant des informations éclairantes sur le comportement cellulaire. HEK293A cellules ont été ensemencées sur une plaque biocapteur de 96 puits à une densité d’ensemencement de 6 000 cellules/puits pendant 24 heures, puis infectées par l’Adv-GFP à 104 UI/mL. L’impédance et l’imagerie cellulaire vivante ont été enregistrées pendant 250 heures après l’inoculation (Figure 2A). Pour minimiser la variabilité due aux différences dans l’ensemencement cellulaire et révéler des changements relatifs après traitement, l’Indice Cellulaire Normalisé (NCI) a été utilisé pour représenter les changements collectifs de croissance, d’attache et de viabilité cellulaire au fil du temps. Le NCI est calculé en divisant l’IC à un moment donné par son IC au moment de normalisation (le temps avant l’inoculation). La trace cinétique NCI du témoin non infecté (Figure 2A, trace noire) montre une augmentation progressive au cours des 48 premières heures, indiquant une prolifération cellulaire continue. Il est suivi d’un plateau à la fin du test, indiquant que les cellules étaient devenues confluentes et couvraient toute la surface des biocapteurs d’or. En revanche, la cinétique des NCI provenant des puits infectés par le virus est tombée en dessous du contrôle 50 h après l’inoculation et a progressivement diminué jusqu’à atteindre zéro à 100 h.

L’imagerie des cellules vivantes acquise auprès de la même population cellulaire a confirmé visuellement que le signal d’impédance reflète de manière fiable l’état physique des cellules permissives à mesure qu’elles progressent à travers l’ensemble du continuum CPE. Comme montré à la Figure 2A, il existe une corrélation inverse entre le NCI et l’expression de la GFP virale dans les cellules HEK293A infectées observée dans les 100 premières heures précédant la lyse complète des cellules permissives. De plus, les images de cellules vivantes (Figure 2B) enregistrées aux moments spécifiés démontrent également un statut cellulaire permissif lors d’une infection virale. La croissance cellulaire persistait pendant les 48 premières heures suivant l’infection, tandis que les particules virales restaient à faibles niveaux à l’intérieur des cellules. Cependant, à mesure que la réplication et l’infection du virus progressaient, la mort cellulaire a commencé, comme en témoigne une confluence réduite et une augmentation du signal de GFP dans les cellules hôtes. Environ 100 heures après l’inoculation, l’expression virale de GFP a commencé à diminuer en raison de la perte significative de cellules permissives viables. Cette approche intégrée renforce la fiabilité de la détection de l’EPC induite par virus par impédance, établissant une base solide pour le test TCID50 basé sur l’impédance.

Calcul automatisé du TCID50 dérivé de la lecture d’impédance
Identifier avec précision les puits CPE positifs est crucial pour un calcul fiable du TCID50. Pour évaluer si le test TCID50 basé sur l’impédance peut différencier précisément et objectivement une CPE positive et négative avec le soutien du module Virologie du logiciel du système, les cellules HEK293A ont été semées à 6 000 cellules/puits pendant 24 heures avant inoculation et traitées avec une série de dilutions dix fois plus nombreuses d’Adv-GFP, utilisant huit réplications (puits) pour chaque dilution. L’EPC induit par l’Adv a été enregistré en temps réel sur le système RTCA. Dans la Figure 3A, les traces cinétiques d’impédance, présentées comme NCI, ont été enregistrées et automatiquement tracées tout au long de l’expérience. La diminution de la NCI après l’inoculation révèle une EPC clairement dépendante de la dose, démontrée par la forte corrélation entre la quantité de virus ajoutée et la vitesse à laquelle le signal d’impédance diminue. Les cellules exposées à des charges virales élevées, entre 10-3 et 10-7 dilutions, ont présenté des baisses nettes et constantes de la NCI, reflétant une CPE robuste et uniforme sur les puits de réplication. En revanche, à une dilution de 10-8 virus, la trace cinétique a montré une grande variabilité dès le début, entraînant des écarts-types NCI significativement plus importants, en particulier au-delà de 100 heures après l’inoculation. Lorsque la charge virale était encore réduite en dessous du seuil nécessaire pour provoquer l’infection, dans ce cas une dilution de 10-10 , le NCI devenait indiscernable des témoins négatifs. Ces données suggèrent qu’à une dilution de 10-8 , 1) le virus ne pouvait pas induire l’EPC dans tous les puits répétés à des cinétiques similaires ; 2) cette dilution constituerait une ligne de démarcation entre les concentrations qui provoquent la CPE dans toutes les répétitions et celles qui n’induisent la CPE que dans certaines ou aucune des réplications ; Ce résultat binaire, infecté (indiqué par des changements d’IC induits par le CPE) ou non infecté (aucun changement de CI), constitue la base du calcul du TCID50 à l’aide de méthodes statistiques dans le logiciel système. Par conséquent, la variation profonde de la NCI observée à certaines concentrations virales est un indicateur clé de la survenue d’une infection partielle et pourrait être cruciale pour l’extrapolation nécessaire au calcul du TCID50.

Comme dans l’essai classique TCID50, le seuil pour une CPE positive doit être défini avant que le logiciel intégré puisse automatiquement identifier les puits positifs au CPE. Parce que différents virus et modèles cellulaires permissifs peuvent nécessiter des seuils distincts, le logiciel permet aux utilisateurs de configurer et d’affiner ces critères au sein du module Virologie. Sur la base de données empiriques, le seuil par défaut du logiciel pour une EPC positive a été appliqué, défini comme la valeur NCI du bien traité par le virus étant plus de trois écarts-types inférieure à la moyenne NCI des contrôles négatifs (non inoculés), c’est-à-dire <traitée par le virus NCI (NCI-3 X SD)ctrl négatif. Les puits individuels étaient alors notés soit comme positifs (+), soit négatifs (-) (Figure 3B). Dans ce cas, le TCID50/mL d’Adv-GFP a ensuite été calculé en utilisant la formule Reed-Muench, l’une des formules incluses dans le logiciel. À part sélectionner ou définir des critères pour une CPE positive, aucune action manuelle n’était requise pour le calcul TCID50, car le logiciel automatisait entièrement le processus.

Suivi dynamique de TCID50 lors d’une infection virale
Pour déterminer la durée appropriée du test TCID50, les valeurs d’Adv-GFP TCID50 ont été extraites aux moments désirés après l’infection, en commençant à 30 heures et en continuant par incréments de 30 heures jusqu’à 240 heures. Un incrément de 30 heures a été délibérément choisi, car la réplication de l’adénovirus est rapportée en environ 30h 10. Les valeurs TCID50 d’Adv-GFP ont été tracées en fonction du temps (Figure 4). Une observation notable est l’augmentation progressive des valeurs de TCID50, qui se poursuit jusqu’à environ 150 heures après l’inoculation. Au-delà de ce point, un plateau émerge, indiquant un équilibre où les effets cytopathiques ont probablement atteint leur saturation. L’augmentation dépendante du temps, suivie d’une stabilisation, suggère une courbe de réplication virale typique. La phase initiale se caractérise par une propagation virale active, culminant par un pic reflétant l’impact cytopathique maximal dans les conditions expérimentales données. La phase de plateau de la TCID50 peut refléter un plafond biologique où le processus d’infection virale a impliqué la majorité des cellules permissives, entraînant une mort cellulaire significative et arrêtant la réplication ultérieure du virus. Le parcours du temps cinétique TCID50 suggère que le test peut être interrompu six à sept jours après l’inoculation pour le modèle adénovirus-HEK293A, car une valeur stable de TCID50 de 8,9 × 109 TCID50/mL a été observée dès 150 heures.

Quantification du titre du virus de la grippe A à l’aide du test TCID50 basé sur l’impédance
Pour étudier si le test TCID50 basé sur l’impédance pouvait être étendu à d’autres modèles hôte viral, un test TCID50 a été réalisé dans des cellules MDCK infectées par IAV. Tout en tenant compte de légères variations du milieu infectieux spécifiques à l’IAV, la procédure de test de base est restée cohérente avec celle établie pour l’adénovirus. La figure 5A montre le NCI des cellules MDCK au fil du temps après l’inoculation avec des dilutions IAV allant de 1 x 10-2 à 5 x 10-9. Similaires aux résultats observés dans les cellules HEK293 A infectées par l’Adv, les puits témoins non infectés/négatifs ont montré un NCI stable et constant à travers les réplications. Cependant, les puits infectés par le virus ont révélé un changement de NCI dépendant de la dose. À faibles doses, 6,4 et 1,3 x 10-7 dilutions, un grand écart-type a été observé. Cela suggère qu’à ces dilutions, la concentration du virus approchait TCID50.

Les puits CPE-positifs ont été identifiés en utilisant les mêmes critères et seuils appliqués dans le modèle Adv-HEK293A, plus précisément, un écart-type trois fois inférieur à la moyenne des puits témoins négatifs. Les valeurs TCID50 basées sur l’impédance pour la VI ont également été déterminées à différents moments après l’inoculation. La figure 5B montre les valeurs moyennes de TCID50 issues de deux expériences indépendantes. À l’exception du point temporel initial à 60 h, les valeurs TCID50 de 90 à 150 h après l’infection ont démontré une bonne stabilité et cohérence, indiquant que le test TCID50 basé sur l’impédance pour IAV peut être réalisé de manière fiable en quatre jours au lieu de cinq. Cette cohérence renforce la robustesse de la méthode basée sur l’impédance, confirmant son adaptabilité et sa fiabilité entre différents agents pathogènes viraux.

Validation du test TCID50 basé sur l’impédance en utilisant la méthode TCID50 conventionnelle
Pour vérifier le TCID50 dérivé de l’impédance pour la mesure de la concentration IAV, des tests TCID50 utilisant deux approches alternatives ont été réalisés en parallèle : l’imagerie sans étiquetage et la coloration au violet cristallin. En résumé, des cellules MDCK ont été préparées et ensemencées en plaques micro-titrées à 96 puits. Le lendemain, les cellules ont été inoculées avec une série de dilutions IAV pendant 5 jours. Pour le test TCID50 basé sur l’imagerie, l’imagerie en cellules vivantes a été réalisée toutes les 4 heures. Les concentrations de dix échantillons IAV ont été évaluées dans l’étude de validation. La confluence cellulaire des puits traités par le virus a été comparée à celle des puits négatifs non infectés utilisant le logiciel du système. Cependant, l’analyse d’imagerie des cellules MDCK était particulièrement difficile, comme l’illustre la Figure 6A. La différenciation précise entre cellules et espaces vides a été difficile en raison de la morphologie plate et des arêtes mal définies des cellules MDCK, compromettant l’identification fiable des puits positifs au CPE par analyse par imagerie. L’utilisation de logiciels d’analyse d’imagerie plus avancés et sophistiqués peut améliorer la précision des calculs TCID50 dans de telscas 11. Dans ce cas, l’évaluation TCID50 basée sur l’imagerie sans étiquette a échoué avec le logiciel système actuel. Pour le test de coloration au violet cristallin TCID50, les cellules ont été fixées et colorées au 5e jour après l’inoculation, comme décrit dans la section protocole. La figure 6B montre une forte corrélation linéaire entre les valeurs TCID50 basées sur l’impédance et celles basées sur la coloration violette cristalline, avec une équation de régression de y = 0,9582x et un R² = 0,9979. Cette analyse comparative souligne la fiabilité de la méthode basée sur l’impédance pour la mesure du titrage viral et son adéquation aux tests TCID50.

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Figure 1 : Flux de travail d’essai TCID50 basé sur l’impédance. Étape 1 : Ensemencement permissif des cellules sur la plaque biocapteur. Semez les cellules permissives sur une plaque à une densité de semis optimale. La croissance cellulaire est ensuite surveillée dans le système dans le cadre de la procédure de contrôle de la qualité cellulaire (QC). Étape 2 : préparation du virus et inoculation. Préparez des stocks de virus dilués en série en utilisant un facteur de dilution défini par l’utilisateur. Retirez la plaque du système et ajoutez les virus dans les puits de la plaque dans une hotte laminaire. Étape 3 : Mesure et évaluation de la CPE des puits positifs à la CPE à l’aide du logiciel du module Virologie. Retournez la plaque dans le système et reprenez l’enregistrement en temps réel de l’EPC induite par le virus. Le logiciel identifie automatiquement les puits positifs au CPE en se basant sur le seuil défini par l’utilisateur pour la détection des CPE. Étape 4 : Calcul TCID50. Grâce à l’évaluation en temps réel des puits CPE-positifs par rapport à l’inoculation virale, le logiciel du module Virologie peut calculer les valeurs TCID50 à tout moment tout au long de l’analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : L’EPC induite par l’adénovirus a été évaluée à l’aide de méthodes basées à la fois sur l’impédance et par imagerie (A) Profilage dynamique de l’impédance (axe y gauche) et de la fluorescence verte (axe y droit) dans HEK293A cellules au fil du temps après l’infection par Adv-GFP. L’indice cellulaire normalisé pour les cellules infectées par l’adénovirus (infectées par l’Adv NCI, ligne rouge), les cellules témoins négatives (NCI NC, ligne noire) et l’intensité intégrée totale de GFP (infectée par l’Adv par GFP, ligne verte) sont tracés en fonction du temps. L’intensité totale intégrée de la GFP reflète l’expression de la GFP dans les cellules permissives et sert d’indicateur d’infection virale. Les chiffres (1 à 6) le long de l’Indice Cellulaire Normalisé correspondent à des moments précis durant le processus d’infection. Les données sont présentées en moyenne ± DE (N = 8). (B) Images séquentielles de cellules HEK293A avant et après l’infection à l’adénovirus-GFP. (1) L’image de référence (0 h) est suivie de photos instantanées à 48 h (2), 72 h (3), 96 h (4), 120 h (5) et 200 h (6) post-infection, illustrant l’évolution de la croissance cellulaire, de la viabilité et de la fluorescence adénovirus-GFP au fil du temps. Barres d’échelle = 160 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : EPC dépendant de la dose de l’adénovirus-GFP dans HEK293A cellules mesurée par impédance. (A) HEK293A cellules ont été ensemencées dans une plaque biosensore à une densité de 6 000 cellules/puits, et 24 heures plus tard, ont été infectées par une série d’adénovirus-GFP dilué 10 fois. Les données sont présentées en moyenne ± DE (N = 8). Insertion : Indice cellulaire normalisé des puits infectés par l’adénovirus-GFP à une dilution de 10-8. Les données des dilutions 10-9, 10-11 et 10-12 sont omis pour plus de clarté. (B) Les puits/réplicés individuels à chaque dilution virale ont été notés soit CPE-positif (+), soit CPE-négatif (-). Chaque colonne de la plaque a été traitée avec une dilution virale différente, le gradient de dilution allant du plus bas dans la colonne 1 au plus élevé dans la colonne 10. Les colonnes 11 et 12 étaient des puits témoins négatifs, sans traitement viral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : Le parcours temporel des valeurs TCID50 dérivé des mesures d’impédance de la CPE dans les cellules HEK293 après avoir été infectée par l’adénovirus-GFP. Le TCID50/mL de l’adénovirus-GFP a été calculé à des moments précis à l’aide du module de virologie à partir de cinq expériences. Bien que le module de virologie fournisse trois formules de calcul TCID50, la formule Reed-Muench a été sélectionnée pour le calcul TCID50. Les données sont présentées en moyenne ± SD (N = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5 : Évaluation du titre du virus de la grippe A à l’aide du test TCID50 basé sur l’impédance. (A) EPC dépendant de la dose de l’IAV dans les cellules MDCK mesurée via impédance. Les cellules MDCK ont été ensemencées dans une plaque biosensore à 8 000 cellules/puits et infectées 24 heures plus tard par une dilution en série de cinq fois du virus de la grippe. Les données sont indiquées en moyenne ± DE (N = 8). Les données issues de la dilution 2,6 × 10⁻⁸ sont omis pour plus de clarté. (B) Évolution temporelle des valeurs TCID50 dérivée des mesures d’impédance dans les cellules MDCK infectées par l’IAV. La méthode Reed-Muench a été utilisée pour le calcul TCID50. Les données sont présentées en moyenne ± DS (N = 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 6 : Corrélation entre les tests TCID50 basés sur impédance et sur la coloration violette cristalline. (A) Image des cellules MDCK inoculées avec IAV. Barre d’échelle = 160 μm. (B) Une comparaison des valeurs TCID50/mL obtenues par des méthodes basées sur l’impédance et la coloration au violet cristallin a été réalisée à partir de dix échantillons IAV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 7 : Les interfaces représentatives du logiciel du module de virologie du système. Le logiciel simplifie le processus d’essai TCID50 basé sur l’impédance. (1) Disposition des plaques pour enregistrer la conception de l’expérience ; (2) L’indice cellulaire ou l’index cellulaire normalisé était automatiquement tracé et affiché par le logiciel lors de l’inoculation virale ; (3) le logiciel offre une flexibilité pour déterminer les critères et choix positifs de CPE pour la formule de calcul TCID50 ; (4) TCID50/mL peut être déterminé à un moment donné pendant le test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Dans cette étude, l’applicabilité de l’impédance à la détermination du titre viral a été démontrée à l’aide de modèles adénovirus-HEK293A et virus de la grippe A-MDCK. D’autres ont également validé la détection robuste et fiable de l’EPC induite par le virus à l’aide de systèmes RTCA pour un large éventail de virus, notamment l’orthopoxvirus12, le virus du Nil occidental (WNV) et le virus de l’encéphalite de Saint-Louis (SLEV)13, le virus chikungunya14, le virus boursalinfectieux 8, la dengue chimériquede fièvre jaune 15, le virus de l’hépatiteA 16, le SARS-CoV-217 et le virus de la dengue9.

L’enregistrement CPE en temps réel via impédance permet de découvrir des chutes temporelles spécifiques au virus dans certains modèles cellulaires permissifs aux virus. Fang et al. ont d’abord démontré qu’un paramètre cinétique caractérisant l’EPC induite par le flavivirus, CIT50 — défini comme le temps jusqu’à une diminution de 50 % de l’impédance cellulaire — est inversement proportionnel à la dose infectieuse virale dans une plage spécifique. Ils ont également montré que CIT50 est proportionnel à l’inverse du titre neutralisantde l’anticorps 13. Depuis, Charretier et al. de Sanofi Pasteur ont étudié cette méthode d’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance (RTCA) pour déterminer les titres infectieux viraux lors du développement du produit vaccinal chimérique fièvre jaune-dengue (CYD) et du procédé15. Charretier et al.15 ont également validé cette dose infectieuse de culture cellulaire basée sur l’impédance de 50 % (CCID50) avec un test CCID50 basé sur la coloration immunocolorante. Ils ont démontré que la méthode RTCA basée sur l’impédance est environ 5 fois moins laborieuse et 3,5 fois plus rentable que le test CCID50 standard dans un environnement industriel. Dans notre étude, la validation du TCID50 basé sur l’impédance par rapport au test traditionnel Crystal Violet TCID50 a été démontrée pour la CPE induite par IAV. De plus, le module logiciel de virologie dans le logiciel RTCA a été utilisé. Les puits positifs au CPE étaient automatiquement identifiés selon des critères définis par l’utilisateur pour les puits positifs au CPE dans le logiciel ; dans notre cas, le degré d’IC diminue par rapport aux témoins négatifs. Le TCID50 a ensuite été calculé par le logiciel en conséquence, permettant une détermination précise du titrage sans dépendre du CIT50 ni risquer que l’échantillon de test ne dépasse la plage optimale. Fixer un seuil approprié pour les puits positifs au CPE est crucial car cela impacte directement la sensibilité et la spécificité du test. Il est recommandé aux utilisateurs de déterminer les critères spécifiques au virus en comparant les variations de l’indice cellulaire avec les résultats de leur méthode conventionnelle validée. Ces seuils dérivés empiriquement peuvent ensuite être configurés et affinés au sein du module Virologie du logiciel.

Comme pour d’autres tests à base de cellules, l’état des cellules permissives utilisées dans les tests TCID50 basés sur l’impédance est crucial pour déterminer le succès du test et la qualité des résultats. Pour assurer une prolifération cellulaire élevée et une viabilité élevée, des cellules fraîches à faible passage sont recommandées. De plus, la création d’une banque cellulaire de cellules permissives au même passage peut améliorer la reproductibilité entre les expériences. Comme indiqué à la Figure 3A, lorsque les cellules permissives étaient dans des conditions optimales, elles généraient des signaux d’impédance stables et constants dans les témoins non infectés tout au long de l’essai. Il a fourni une référence de référence fiable pour établir un seuil pour les puits CPE-positifs, aboutissant à une détermination précise du titre viral. De plus, le test TCID50 basé sur l’impédance est particulièrement capable d’effectuer un contrôle qualité sur les cellules permissives avant l’évaluation du titrage viral. Le profil cinétique caractéristique de l’IC des cellules permissives saines sert de métrique fiable de contrôle qualité, garantissant que seules des populations cellulaires viables et constantes sont utilisées pour la quantification virale, améliorant ainsi la reproductibilité et la précision du test.

Pour chaque nouveau virus, une optimisation et une validation du test TCID50 impédance doivent également être effectuées avant la mise en œuvre. Des facteurs clés, tels que les conditions de culture cellulaire, y compris le milieu basal et la concentration en FBS, sont essentiels pour obtenir des données d’impédance cellulaire reproductibles et améliorer la sensibilité de la détection de l’EPC, comme l’ont souligné des étudesprécédentes 6,16. À cet égard, la technologie basée sur l’impédance en temps réel et sans marquage s’est avérée être un outil simple, efficace et précieux pour optimiser les conditions de culture cellulaire lors du développement dutest 16.

Une limitation du test impédance-TCID50 survient avec les virus qui ne provoquent pas la CPE, car le test s’appuie sur la CPE pour générer des variations de l’affichage de l’impédance, ce qui constitue la base du calcul TCID50. Dans de tels cas, il peut être nécessaire d’identifier un modèle cellulaire permissif alternatif pouvant présenter une EPC induite par le virus ou d’adopter une approche d’immunocoloration, à condition qu’un anticorps approprié contre l’antigène viral spécifique soit disponible. Néanmoins, cette étude a démontré la capacité du système MP RTCA à capturer l’EPC dépendante de la dose et à distinguer efficacement les populations cellulaires infectées et non infectées grâce à une lecture d’impédance objective et sensible.

L’introduction de l’analyse dépendante du temps TCID50 représente une avancée significative par rapport aux mesures d’extrémité traditionnelles. Cela simplifie le processus d’optimisation des tests TCID50, car le moment optimal pour calculer et rapporter le titre viral peut être facilement obtenu à partir d’un seul test en temps réel. Bien que les tests TCID50 sans étiquette basés sur l’imagerie puissent également fournir des valeurs TCID50 résolues dans le temps, leur applicabilité est limitée aux modèles virus-cellules présentant une CPE reconnaissable par les algorithmes logiciels d’imagerie, comme le démontre le modèle IAV-MDCK (Figure 6A). De plus, utiliser une impédance sans étiquetage pour la détection des CPE élimine les complications liées à l’utilisation de divers réactifs et de flux de travail en plusieurs étapes qui pourraient augmenter les risques associés aux erreurs humaines. En plus de simplifier le flux de travail, le module Virologie du logiciel du système simplifie également l’analyse. Tout d’abord, cela commence par une configuration facile du planning d’expérimentation pour un enregistrement automatique contrôlé par le système. Elle est suivie d’un score CPE-positif spontané en temps réel après chaque mesure et se termine par un calcul automatisé TCID50 pour une quantification simple des particules infectieuses du virus (Figure 7). Cette automatisation réduit considérablement le temps d’intervention directe, une amélioration cruciale, notamment lors de la manipulation de virus hautement infectieux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % de trypsine 0,53 mM EDTA  ; (1x)Corning25-052-CI
12 réservoirs de réactifs du canalVistaLab Technologies3054-1011
Adénovirus-GFPVector Biolabs  ;1060
Médium DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Sérum bovin fœtalAvantor97068-085
Cellule Hek293AThermo Fisher Scientific & nbsp ;  ; R70507
Solution de pénicilline-streptycineHyCloneSV30010
Solution tampon phosphate (1x)HyCloneSH30256.01
Seaplaque agaroseLonza50101
Système eSight xCELLigence RTCAAgilentS2833AA
Système MP RTCA xCELLigenceAgilent380601040

Références

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