Article de méthode

Tests comportementaux pour la manipulation optogénétique des circuits neuronaux chez Drosophila melanogaster

DOI :

10.3791/67964

⸱

7 février 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente des méthodes de manipulation optogénétique chez Drosophila melanogaster, en utilisant CsChrimson et GtACR2 pour activer et réduire au silence des neurones spécifiques. Quatre expériences sont décrites pour utiliser l’optogénétique afin d’explorer les comportements thermotactiques et gustatifs, fournissant des informations sur les mécanismes neuronaux sous-jacents régissant ces processus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’optogénétique est devenue une technique fondamentale en neurosciences, permettant un contrôle précis de l’activité neuronale grâce à la stimulation lumineuse. Cette étude présente des configurations faciles à mettre en œuvre pour l’application de méthodes optogénétiques chez Drosophila melanogaster. Deux outils optogénétiques, CsChrimson, un canal cationique activé par la lumière rouge, et GtACR2, un canal anionique activé par la lumière bleue, ont été utilisés dans quatre approches expérimentales. Trois de ces approches impliquent des expériences à l’aide d’une seule mouche : (1) un test de préférence de position thermotactique optogénétique à lumière bleue ciblant les cellules chauffantes sensibles à la température, (2) un test de préférence de position optogénétique à lumière rouge activant les neurones sensibles amers, et (3) un test de réponse d’extension de la trompe activant les neurones sensibles à la douceur. La quatrième approche (4) est la configuration d’un labyrinthe de mouches pour évaluer les comportements d’évitement à l’aide de plusieurs mouches. La capacité de manipuler l’activité neuronale dans le temps et dans l’espace offre des informations puissantes sur le traitement sensoriel et la prise de décision, soulignant le potentiel de l’optogénétique pour faire progresser notre connaissance de la fonction neuronale. Ces méthodes fournissent un cadre accessible et solide pour les recherches futures en neurosciences afin d’améliorer la compréhension de voies neuronales spécifiques et de leurs résultats comportementaux.

Introduction

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L’optogénétique est devenue une technique puissante combinant l’optique et la génétique en neurosciences, offrant un contrôle précis et non invasif de l’activité neuronale grâce à la stimulation lumineuse1. Chez Drosophila melanogaster, un organisme modèle largement utilisé, les outils optogénétiques permettent l’activation et l’inhibition de neurones spécifiques, permettant aux chercheurs de moduler les circuits neuronaux. Parmi les outils utilisés, CsChrimson et GtACR (rhodopsines du canal anion Guillardia theta) apportent des approches complémentaires pour le ciblage neuronal. La rhodopsine, un canal cationique sensible à la lumière rouge provenant d’algues vertes, facilite l’activation neuronale par dépolarisation lorsqu’elle est exposée à la lumière rouge, avec un pic d’activation à environ 590 nm2. CsChrimson offre une meilleure pénétration tissulaire que les channelrhodopsines précédentes et réduit les artefacts comportementaux induits par la lumière dans les études sur la drosophile 2. En revanche, GtACR, qui comprend des variantes telles que GtACR2, est un canal chlorure photoélectrique qui réduit au silence les neurones par hyperpolarisation 3,4. GtACR2 conduit des anions et est activé par la lumière bleue avec un pic d’activation autour de 470 nm4. CsChrimson et GtACR2 sont activés par des longueurs d’onde distinctes de la lumière, assurant un contrôle précis et indépendant de l’activité neuronale sans activation croisée5.

La drosophile est un modèle efficace pour la recherche en neurosciences en raison de sa rentabilité, de sa facilité d’élevage et de ses réponses comportementales robustes aux stimuli environnementaux, y compris les comportements d’attraction et d’évitement6. Sa petite taille et sa cuticule semi-transparente améliorent la pénétration de la lumière, en particulier de la lumière rouge de longue longueur d’onde, permettant une manipulation optogénétique efficace 7,8. Alors que les cellules de drosophile ne peuvent pas produire suffisamment de rétinienne, un cofacteur crucial pour la fonctionnalité des channelrhodopsines, l’ajout de rétinal à leur alimentation compense cette limitation, assurant une activation efficace des outils optogénétiques9.

Pour explorer les effets de la manipulation optogénétique chez la drosophile, nous décrivons quatre expériences ciblant différents circuits neuronaux et comportements, chacune utilisant des modalités distinctes pour évaluer les réponses d’évitement ou d’attraction, allant des tests en une seule mouche aux évaluations basées sur des groupes. Les cellules chauffantes (HC) chez la drosophile sont des neurones thermosensoriels situés dans l’arista, répondant aux augmentations de température10. Ces neurones expriment des canaux ioniques sensibles à la chaleur qui déclenchent un comportement d’évitement, guidant les mouches loin des sources de chaleur10,11. Dans l’approche 1, nous avons utilisé un test de préférence de position thermotactique optogénétique à lumière bleue pour manipuler les neurones HC. En exprimant GtACR2 dans ces neurones, nous avons inhibé leur activité lors de l’exposition à la lumière bleue. Les mouches ont été exposées à deux options de température : 25 °C et 31 °C. Sous la lumière ambiante, les mouches évitaient le côté à 31 °C, démontrant une réponse thermotactique typique. Cependant, l’activation de la lumière bleue de GtACR2 a réduit au silence les neurones HC. En conséquence, les mouches n’ont montré aucune préférence significative pour la température, ce qui suggère une inhibition optogénétique réussie. En plus d’évaluer la fonction des neurones sensoriels, l’expression de GtACR2 dans les neurones sensoriels en aval permet des manipulations optogénétiques similaires pour étudier les circuits neuronaux nécessaires à des modalités sensorielles spécifiques5.

Le récepteur gustatif GR66a chez la drosophile est exprimé dans les palpes labiaux à l’extrémité distale de la trompe et dans les pattes, médiant la détection du goût amer12,13. Ces neurones déclenchent des comportements d’évitement en réponse à des substances amères. Dans l’approche 2, nous avons utilisé un test de préférence de position optogénétique à lumière rouge pour manipuler les neurones exprimant GR66a. En exprimant CsChrimson dans ces neurones, nous les avons activés lors de l’exposition à la lumière rouge. Les mouches ont été placées dans une arène avec une moitié exposée à la lumière rouge et l’autre moitié filtrant la lumière rouge. En l’absence de lumière rouge, les mouches n’ont montré aucune préférence. Cependant, l’activation de la lumière rouge de CsChrimson a stimulé les neurones sensibles à l’amertume, ce qui a entraîné un évitement significatif de la zone éclairée, confirmant ainsi le succès de l’activation optogénétique des neurones GR66a. Des approches similaires ont été utilisées pour identifier les circuits en aval des cellules de chauffage suffisants pour le comportement d’évitement5.

Nous nous sommes concentrés sur l’activation optogénétique du comportement appétitif dans l’approche 3. Les neurones exprimant GR5a, situés dans la sensille gustative sur le labelle et les pattes, détectent les sucres et déterminent le comportement alimentaire. L’activation de ces neurones déclenche la réponse d’extension du proboscis (PER)14. Nous avons utilisé un test d’extension de la réponse au proboscis optogénétique à lumière rouge pour activer les neurones GR5a. En exprimant CsChrimson dans ces neurones, nous les avons stimulés avec de la lumière rouge. Les mouches n’ont pas déployé leur trompe dans des conditions de lumière ambiante. Cependant, l’activation de CsChrimson par la lumière rouge a conduit à l’extension du proboscis sans stimulus sucré, démontrant une activation optogénétique réussie des neurones GR5a. Cette approche a été utilisée pour étudier le circuit neuronal, y compris les neurones sensoriels gustatifs, les neurones de projection du goût et les motoneurones du proboscis15,16.

Dans l’approche 4, nous avons étudié l’activation optogénétique des comportements d’évitement dans des groupes de mouches, en utilisant un test de labyrinthe de mouches optogénétiques à lumière rouge ciblant les neurones GR66a. Les mouches ont été placées à l’intersection de deux tubes : l’un éclairé par une lumière rouge et l’autre ombragé. L’expression de CsChrimson dans les neurones GR66a a déclenché l’évitement. En l’absence de lumière rouge, les mouches n’ont montré aucune préférence, mais l’activation de la lumière rouge a conduit les mouches exprimant GR66a à éviter la lumière rouge, suggérant l’activation réussie de la voie. Les tests de labyrinthe de mouches ont été largement utilisés pour étudier diverses modalités sensorielles, notamment la température, l’humidité et l’olfaction. Lorsqu’elle est combinée à l’optogénétique, cette approche est puissante pour étudier à la fois les comportements d’attraction et d’évitement 17,18,19.

Ces méthodes fournissent un cadre reproductible pour l’étude de l’activation optogénétique et de l’inhibition des circuits neuronaux de la drosophile . En utilisant une combinaison de différentes channelrhodopsines et des tests comportementaux accessibles, cette étude de preuve de concept démontre l’efficacité de la manipulation optogénétique, fournissant des méthodes simples pour manipuler les fonctions des circuits neuronaux avec des applications potentielles plus larges dans la recherche en neurosciences.

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Protocole

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1. Souches, élevage de mouches et aspirateur de mouches

  1. Décharges et entretien
    1. Les souches utilisées dans les expériences comprennent HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) : 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC : 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC : 55136). L’arrière vole à 25 °C sur un milieu de semoule de maïs standard sous un cycle de lumière de 12 h à 12 h.
      REMARQUE : 1 L de semoule de maïs contient 1 L dH2O, 79 g de dextrose, 7,5 g d’agar, 24 g de levure en flocons, 57 g de semoule de maïs, 2,1 g de méthyl-4-hydroxybenzoate (dissous dans 11,1 ml d’éthanol), 6 g de tartrate de sodium et de potassium tétrahydraté et 0,9 g de chlorure de calcium.
  2. Élevage de mouches et préparation expérimentale
    1. Triez les mouches de 0 à 3 jours. Au moment de l’expérimentation, les mouches auront entre 3 et 6 jours, ce qui permet d’assurer une cohérence liée à l’âge (figure 1A).
    2. Divisez chaque génotype en quatre groupes 3 jours avant de réaliser les expériences : ATR à lumière ambiante -, ATR à lumière ambiante +, ATR à lumière rouge ou bleue -, et ATR à lumière rouge ou bleue +.
    3. Préparez une solution mère d’ATR de 80 mM en dissolvant l’ATR dans de l’éthanol à 100 %. Complétez l’alimentation avec 400 μM ATR aux groupes ATR +.
    4. Compléter l’aliment avec la même concentration d’éthanol mais sans ATR aux groupes ATR.
    5. Arrière de tous les groupes dans l’obscurité22.
    6. Starve Gr5a>CsChrimson vole pendant 16 à 24 heures dans des flacons contenant uniquement du tissu humide. Les flacons ATR + contiennent 400 μM ATR mélangés à de l’eau, tandis que les flacons ATR - contiennent du dH2O mélangé à la même concentration d’éthanol.
  3. Aspirateur de mouches
    1. Assemblez l’aspirateur de mouches (figure 1B) à l’aide d’un tube en plastique, d’un filet anti-insectes et de deux pipettes de transfert de 3 ml.
    2. Coupez les pointes et les bulbes des pipettes de transfert, en veillant à ce que l’embout d’aspiration des mouches permette un passage confortable d’une mouche. Cette conception permet une aspiration douce des mouches par inhalation, ce qui minimise les dommages et facilite la collecte et le transfert efficaces des mouches individuelles.
    3. Drapez un filet anti-insectes sur le tube en plastique et fixez les extrémités de la poire de la pipette au tube à l’aide de Parafilm.

2. Essai de préférence de position thermotactique thermotactique optogénétique à lumière bleue à mouche unique

  1. Souches de drosophile et élevage de mouches
    1. Croisement de la lignée de pilote HC-Gal410 avec UAS-GtACR23, ce qui a donné le génotype expérimental HC>GtACR2. Les mouches HC>GtACR2 expriment GtACR2 dans les cellules chauffantes.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un nombre égal de mouches mâles et femelles sont utilisées pour chaque condition.
  2. Mise en place et exécution d’essais expérimentaux
    1. Alignez deux plaques d’acier sur des plaques chauffantes séparées de manière à ce que leurs bords se rencontrent. Placez une feuille de plastique protectrice sur le dessus, en la fixant avec du ruban adhésif pour minimiser les mouvements. Placez une feuille de papier blanc sur le protecteur de feuille pour réduire les signaux de bruit de fond (Figure 1C).
      REMARQUE : Remplacez le papier blanc au début de chaque expérience ou lorsqu’il est sale.
    2. Placez un couvercle en plastique transparent (2 mm de hauteur × 58 mm de largeur × 83 mm de longueur) sur le papier blanc. Cette housse permet à la mouche de marcher librement tout en l’empêchant de voler.
    3. Découpez un trou au fond d’une boîte en mousse de polystyrène (27 cm de hauteur × 22 cm de largeur × 16 cm de longueur) pour adhérer à l’appareil photo et à la lumière bleue (1 000 mA) à environ 12 cm au-dessus de la surface expérimentale.
    4. Positionnez la caméra et la lumière bleue de manière à minimiser l’éblouissement tout en activant l’activation.
      REMARQUE : Un pré-test peut être nécessaire pour déterminer la plage d’activation de la lumière bleue.
    5. Réglez l’appareil photo pour qu’il enregistre avec les paramètres suivants : timelapse de 1 s, champ étroit, 4000 × 3000 pixels.
    6. Ajustez les réglages de la plaque chauffante pour maintenir une température de surface de 25 ± 1 °C et de 31 ± 1 °C sur les plaques d’acier respectives.
      REMARQUE : Pour des conditions nécessitant des températures inférieures à 25 °C, d’autres méthodes de refroidissement, telles que des dispositifs Peltier ou de la glace, sont nécessaires. Si la température des plaques d’acier dépasse les niveaux souhaités, vaporisez la surface avec de l’eau distillée pour atteindre et maintenir les conditions requises. Ensuite, utilisez une serviette pour absorber l’excès d’humidité du protecteur de feuille de plastique.
    7. Avant et après chaque essai, surveillez les températures à l’aide d’une sonde de température de surface.
      REMARQUE : Un contrôle précis de la température est crucial, car les fluctuations peuvent affecter les résultats.
    8. Placez le couvercle en plastique du côté à 25 °C. À l’aide d’un aspirateur de mouches, libérez doucement une seule mouche sous le couvercle. Positionnez la boîte au-dessus de la zone d’expérimentation pour créer une lumière tamisée (<10 lux) et laissez la mouche s’acclimater pendant 1 min.
    9. Après la période d’acclimatation, soulevez la boîte et ajustez rapidement le couvercle en plastique, en le positionnant avec le centre du couvercle aligné avec la limite de la plaque d’acier pour assurer une couverture uniforme des côtés à 25 °C et 31 °C.
      REMARQUE : Au cours de ce processus, la température de l’air et la température à l’intérieur du couvercle du côté de 31 °C augmentent jusqu’à environ 27 °C en 5 s (Figure supplémentaire 1), ce qui est suffisant pour activer les cellules de chauffage11.
    10. Lancez l’essai en allumant la caméra et la lumière bleue (20 kLux).
      REMARQUE : N’allumez pas la lumière bleue dans des conditions de lumière ambiante. Allumez l’appareil photo et enregistrez quelques images avant d’allumer la lumière bleue en cas de mouvement.
    11. Après plus de 2 min, terminez l’essai en éteignant l’appareil photo et la lumière. Jetez les mouches à l’aide de l’aspirateur.
      REMARQUE : Enregistrez quelques images supplémentaires en cas de mouvement lorsque vous éteignez l’appareil photo.
  3. Analyse comportementale et statistique
    1. N’analysez que les données provenant de mouches qui restent du côté des 25 °C au début de l’essai.
      REMARQUE : Écartez les données provenant de mouches commençant des essais du côté de 31 °C, qui présentent souvent des préférences modifiées23. Jetez les essais impliquant des mouches qui ne s’approchent pas du bord du côté à 31 °C, en vous assurant qu’elles ont fait un choix entre les températures. Supprimez les données des mouches qui restent immobiles pendant plus de 30 s.
    2. Analysez les résultats à l’aide des procédures décrites précédemment23. Calculez l’indice de préférence (IP) comme le rapport entre la différence de temps que la mouche a passé dans chaque zone de température et le temps total, comme indiqué dans la formule suivante :
      figure-protocol-1
      REMARQUE : Les détails statistiques des expériences sont fournis dans les légendes des figures. L’analyse des données est effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.

3. Essai de préférence de position optogénétique à lumière rouge en une seule mouche

  1. Souches de drosophile et élevage de mouches
    1. Croisement de la lignée de pilote Gr66a-Gal421 avec UAS-CsChrimson2, ce qui a donné le génotype expérimental Gr66a>CsChrimson. Les mouches Gr66a>CsChrimson expriment CsChrimson dans les neurones du goût amer.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un nombre égal de mouches mâles et femelles sont utilisées pour chaque condition.
  2. Mise en place et exécution d’essais expérimentaux
    1. Effectuer le test dans une pièce sombre ou un environnement sombre pour assurer une activation contrôlée de CsChrimson (Figure 1D).
    2. Placez un caméscope à environ 45 cm au-dessus de la surface expérimentale.
      1. Utilisez un caméscope sans filtre infrarouge. Si un caméscope est doté d’un filtre infrarouge passe-court interne qui bloque les longueurs d’onde supérieures à 700 nm, retirez-le.
      2. Collez un filtre passe-long de 830 nm sur l’objectif à l’aide de super colle pour capturer les longueurs d’onde infrarouges. Ce réglage est essentiel pour enregistrer le mouvement des mouches dans des conditions de lumière infrarouge.
    3. Placez une source de lumière rouge24 à environ 45 cm au-dessus de la surface expérimentale, en assurant une intensité lumineuse d’environ 2,5 kLux (1 000 mA).
      REMARQUE : Une protection oculaire appropriée capable de filtrer le laser/la lumière rouge est recommandée. Les lunettes de sécurité laser aident à prévenir les lésions oculaires potentielles dues à l’exposition directe à une lumière rouge intense.
    4. Utilisez une lumière infrarouge pour visualiser les mouches à l’intérieur de l’installation. Gardez-le allumé tout au long de l’expérience.
      REMARQUE : Évitez l’éblouissement dans la zone d’expérience causé par la lumière infrarouge ; L’éblouissement peut compliquer l’analyse des données.
    5. Utilisez de la colle pour fixer un filtre passe-long infrarouge de 780 nm à la moitié du couvercle en plastique.
      REMARQUE : Utilisez n’importe quel filtre passe-long qui bloque les longueurs d’onde inférieures à 780 nm. Le côté non filtré laisse passer la lumière rouge et l’infrarouge, tandis que le côté filtré ne laisse passer que la lumière infrarouge.
    6. Placez un matériau noir mat sous la zone d’expérimentation pour minimiser le bruit de fond.
    7. Placez une seule mouche sous un couvercle en plastique transparent (2 mm de hauteur × 58 mm de largeur × 83 mm de longueur) à l’aide d’un aspirateur à mouches et laissez-la s’acclimater pendant 1 min.
    8. Attendez que la mouche soit visible du côté non filtré. Commencez l’essai en allumant le caméscope et le voyant rouge.
      REMARQUE : Le caméscope est susceptible de bouger immédiatement après le démarrage. Sécurisez soigneusement l’appareil photo pendant l’enregistrement et allumez-la plusieurs secondes avant l’enregistrement pour éviter tout mouvement aberrant qui pourrait compliquer l’analyse. N’allumez pas le voyant rouge avant le début de l’essai.
    9. Enregistrez le mouvement de la mouche pendant 1 min.
      REMARQUE : Jetez les essais dans lesquels la mouche ne s’approche pas de la ligne médiane ou ne bouge pas pendant plus de 15 s.
    10. Après 1 min, terminez l’essai en éteignant le caméscope et la lumière. Jetez les mouches à l’aide de l’aspirateur.
      REMARQUE : Enregistrez quelques images supplémentaires pour éviter les effets de mouvement lorsque vous éteignez l’appareil photo.
  3. Analyse comportementale et statistique
    1. Analysez les résultats à l’aide des procédures décrites précédemment23. Calculez l’indice de préférence (IP) comme le rapport entre la différence entre le temps que la mouche a passé dans la zone sans filtre et la zone avec le filtre par rapport au temps total, comme indiqué dans la formule suivante :
      figure-protocol-2
      REMARQUE : Les détails statistiques des expériences sont fournis dans les légendes des figures. L’analyse des données est effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.

4. Réponse d’extension du proboscis optogénétique à lumière rouge

  1. Souches de drosophile et élevage de mouches
    1. Croisement de la lignée de pilote Gr5a-Gal420 avec UAS-CsChrimson2, ce qui a donné le génotype expérimental appelé Gr5a>CsChrimson. Les mouches Gr5a>CsChrimson expriment CsChrimson dans les neurones récepteurs du goût sucré.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un nombre égal de mouches mâles et femelles sont utilisées pour chaque condition.
    2. Starve vole pendant 16 à 24 h avec ATR (ATR +) ou sans (ATR -) avant de tester.
      REMARQUE : Des périodes de famine plus longues peuvent être nécessaires pour susciter une réponse forte.
  2. Mise en place et exécution d’essais expérimentaux
    1. Anesthésie les mouches en les refroidissant sur de la glace (Figure 1E).
      REMARQUE : Évitez le contact direct entre les mouches et la glace. Limitez le temps de refroidissement à environ 1 min ; Un refroidissement prolongé peut entraîner des problèmes de récupération et la mortalité.
    2. Utilisez l’embout d’une pipette de 1000 μL pour appliquer 7 à 10 petits points de colle sur les lames de verre.
      REMARQUE : De petites gouttes de colle sur la glissière garantissent que la mouche ne soit pas submergée et aident à empêcher la colle de coller à sa trompe ou à ses pattes.
    3. Positionnez une braguette, côté ventral vers le haut, sur chaque point de colle. Assurez-vous que le thorax et les ailes entrent en contact avec la colle pour minimiser les mouvements. Déployez les ailes de chaque côté pour augmenter la surface adhésive.
      REMARQUE : Évitez de placer les mouches trop près les unes des autres, ce qui pourrait activer par inadvertance plusieurs mouches lors de l’exposition à la lumière.
    4. Laissez sécher la colle pendant environ 10 min.
    5. Transférez les lames dans une boîte d’humidité (une boîte en plastique avec des serviettes en papier humides) et laissez les mouches récupérer pendant 2 h.
    6. Placez la lame sous le microscope. Utilisez une seringue pour délivrer une gouttelette d’eau afin de rassasier les mouches, évitant ainsi les extensions de trompe induites par la soif.
    7. Tenez manuellement un pointeur laser rouge pour faire briller la lumière rouge sur le trompe/la tête d’une seule mouche (700 lux) tout en observant la réponse PER à travers le microscope.
      REMARQUE : Une protection oculaire capable de filtrer le laser/la lumière rouge est essentielle lors de l’observation de la lumière rouge à travers le microscope.
    8. Observez et enregistrez l’extension du proboscis dans une fenêtre de 30 secondes. Évaluez chaque mouche à l’aide du système d’enregistrement suivant : 0 indique qu’il n’y a pas d’extension, 0,5 indique une extension de 1 à 2 s, 1 indique que l’extension dure plus de 3 s.
    9. Après avoir testé l’extension du proboscis induite par la lumière, examinez la réponse à 4 % de saccharose à l’aide d’une seringue. Expulsez une gouttelette de saccharose à l’extrémité de l’aiguille et approchez-la de la trompe de mouche.
      REMARQUE : Jetez les données des mouches qui ne répondent pas à la gouttelette de saccharose.
  3. Analyse comportementale et statistique
    1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.
      REMARQUE : Les détails statistiques des expériences sont fournis dans les légendes des figures.

5. Essai de labyrinthe de mouches optogénétiques à lumière rouge

  1. Souches de drosophile et élevage de mouches
    1. Croisement de la lignée de pilote Gr66a-Gal421 avec UAS-CsChrimson2, ce qui a donné le génotype expérimental Gr66a>CsChrimson. Les mouches Gr66a>CsChrimson expriment CsChrimson dans les neurones du goût amer.
      REMARQUE : Assurez-vous que chaque groupe contient un nombre égal de mouches mâles et femelles.
  2. Assemblage de labyrinthe de mouches
    1. Réalisez le labyrinthe de mouches comme illustré à la figure 1F.
      REMARQUE : Alternativement, imprimez en 3D les composants du labyrinthe de mouches, en les assemblant comme détaillé précédemment25.
    2. Coupez trois tubes de culture en plastique de 5 ml à la bonne longueur pour fabriquer un tube de chargement, un tube d’essai transparent non couvert et un tube d’essai recouvert d’une feuille d’aluminium. Fixez les tubes au labyrinthe de mouches comme illustré à la figure 1F.
      1. En fonction du matériau du labyrinthe, coupez les tubes d’essai pour assurer une distance égale pour chaque condition d’essai. En fonction de la longueur de la chambre de maintien, raccourcissez le tube à essai découvert dans un labyrinthe transparent, tout en raccourcissant le tube à essai recouvert d’une feuille si le labyrinthe est opaque.
  3. Mise en place et exécution d’essais expérimentaux
    1. Dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, placez 10 mâles et 10 femelles dans le tube de chargement. Connectez le tube de chargement à la chambre de rétention. Inclinez l’élévateur et tapotez doucement le tube pour déplacer les mouches dans la chambre de rétention.
      REMARQUE : Abaissez l’élévateur de manière à ce que seule la moitié de la chambre de stockage soit ouverte. Cette manipulation facilite le transfert des mouches du tube de chargement dans la chambre de stockage.
    2. Une fois les mouches transférées dans la chambre de rétention, utilisez l’élévateur pour abaisser les mouches entre le tube de chargement et les trous du tube d’essai. Ensuite, retirez le tube de chargement.
    3. Placez le labyrinthe à environ 13 cm de la source de lumière rouge (1000 mA) sans allumer la lumière.
    4. Abaissez l’élévateur jusqu’à ce que la chambre de maintien s’aligne avec les trous des tubes à essai, permettant aux mouches de se déplacer librement entre les tubes à essai enveloppés de papier d’aluminium et les tubes à essai découverts. Simultanément, allumez le voyant rouge pour activer CsChrimson. Assurez-vous que l’intensité de la lumière rouge à la surface du tube à essai découvert est d’environ 40 kLux.
      REMARQUE : N’allumez pas le voyant rouge tant que la chambre de maintien n’est pas abaissée et alignée avec les trous du tube d’essai. Une protection oculaire appropriée capable de filtrer le laser/la lumière rouge est recommandée en raison de la luminosité intense de la lumière rouge.
    5. Les mouches choisissent entre le tube exposé à la lumière rouge et le tube ombragé pendant une minute.
    6. Après 1 min, soulevez l’élévateur entre le tube de chargement et les trous du tube d’essai. Comptez les mouches dans chaque tube.
      REMARQUE : Seules les mouches actives et non blessées sont comptées.
    7. Nettoyez l’élévateur à mouches et le labyrinthe à mouches à l’aide de dH2O après chaque essai.
  4. Analyse des données et statistiques
    1. Calculez l’indice de préférence (IP) comme étant le rapport entre la différence entre le nombre de mouches découvertes et les tubes couverts et le nombre total de mouches, comme l’indique la formule suivante :
      figure-protocol-3
      REMARQUE : Les détails statistiques des expériences sont fournis dans les légendes des figures. L’analyse des données est effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essai de préférence de position thermotactique optogénétique en lumière bleue à mouche unique
Quatre conditions ont été testées : la lumière ambiante sans supplémentation en ATR (lumière ambiante, ATR -), la lumière ambiante avec supplémentation en ATR (lumière ambiante, ATR +), la lumière bleue sans supplémentation en ATR (bleu, ATR -), et la lumière bleue avec supplémentation en ATR (bleu, ATR +). Les trois premières conditions ont servi de contrôles. Dans les expériences de contrôle, les mouches on...

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Discussion

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La manipulation optogénétique a transformé le domaine des neurosciences en permettant un contrôle précis des circuits neuronaux avec une précision spatio-temporelle27. Un circuit neuronal comprend des populations de neurones interconnectés par des synapses, remplissant des fonctions spécifiques lors de l’activation. Le connectome du cerveau entier de la drosophile a été achevé, offrant des informations complètes sur les voies synaptiques dans le cerveau d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article. Tous les auteurs ont divulgué tout conflit potentiel et affirment qu’ils n’ont aucune relation financière ou personnelle qui pourrait influencer le travail présenté dans cette étude.

Remerciements

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Des diagrammes schématiques pour toutes les figures ont été créés avec Biorender.com. Ce travail a été soutenu par le NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) à L.N. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1000 mA Pilote LEDLuxeon Star3021-D-E-1000
5 mL VWR Tubes de culture, plastique, avec capuchons à double position VWR60818-664
780 Filtre passe-long / IR 780 nm 100 mm x 100 mmFiltres Lee BH#LE8744Couper à environ 47 x 100 s’adapter au couvercle en plastique
Agfabric 6,5 pi x 15 pi Moustiquaire Moustiquaire de jardin pour protéger les plantes Légumes Fleurs FruitsHome DepotEIBNW6515
Tout trans rétinienSigma-Aldrich116-31-4
Plaque d’aluminium (30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)Amazona acheté sur Amazon
Boîte en plastique noirLI-COR929-97101
CHLORURE DE CALCIUM ANHYDRO 25GRThermo Fisher Scientific  ;
CX405 Handycam avec capteur CMOS Exmor RSONYHDR-CX405
Elmer' s “ Colle scolaire"Elmer
Ethyl alcohol, Pure (200 Proof)Sigma-AldrichE7023
Fisherbrand Isotemp Hot Plate StirrerFisher ScientificSP88850200
Fil à mouches : Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57592
Fil à mouches : Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57670
Fil à mouches : HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabUn cadeau aimable
Ligne de mouche : UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
Ligne de mouche : UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabUn cadeau de nature
Flystuff 62-101 Semoule de maïs jaune (11,3 kg), jaune, 11,3 kg/unitéGenesee Scientific62-101
Flystuff 62-107 Levure sèche inactive, 10 kg, flocons nutritifs, 10 kg/unitéGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11.02 lbs)/UnitGenesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm&ndash ; 420 nm / 600 nm&ndash ; Lunettes de sécurité laser 1100 nm Longueur d’onde violette/rouge/infrarougeMascotte gratuite  ;B08LGMQ65Sacheté sur Amazon
GoPro Hero8 BlackGoPro6365359
LEE Filters 100& fois ; 100 mm Infrarouge #87 Filtre Polyester InfrarougeB& H PhotoLE8744
Filtre passe-long, Verre coloré, 50,8 x 50,8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
4-hydroxybenzoate de méthyle, 99 %, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific  ;
MicroWell Mini Tray 60 puits, profil bas NS PSThermal Scientific  ;NUNC 439225Les couvercles sont utilisés comme « couvercle en plastique"
Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µ ; L Olympus Ergonomic Pipet Tips Low Binding, Racked, Stérile, 8 Racks de 96 Tips/UnitEppendorf24-160RS
Parafilm M Film d’étanchéitéHeathrow ScientificHS234526B4 po x 125 feet
Chlorure de potassium, ACS, 99,0-100,5 %,  ;Thermo Fisher Scientific  ;
PrismGraphPadVersion 9logiciel d’analyse de données
Samco Pipettes de transfert graduéesThermo Fisher Scientific  ;2253 mL
Fisher Scientific12-544-2  ; Stéréomicroscope 5 mm x 75 mm x 1,0 mm
OLYMPUSCZ61
Boîte en polystyrène (27 cm de hauteur et de temps ; 22 cm de largeur et de temps ; 16 cm de longueur)
SaccharoseFisher Scientific225911
Sonde de température de surfaceFluke80PK-3A
SeringueBD Integra305270
Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, poudre, 50 lb/unitéGenesee Scientific62-113
Thermomètre à thermocouple étalonné traçablepar cple-parmer  ; UX-91210-07Fisherbrand Traceable BigDigit Type K Thermomètre
LED bleues à tribordSupply07007-PB000-D470 nm
Triple LED rouges à tribordSupply07007-PD000-F627 nm
Tygon PVC Clear Tubing 1/4 » ID, 3/8 » OD, 5 ft. Longueur  ;McMaster Carr Supply Company  ;6516T21 ;
Univivi IR Illuminator, 850nm 12 LEDs Illuminateur IR grand angle pour la vision nocturneUnivivi4331910725
Wakefield Thermal 25,4 mm Rond Dissipateur Thermique Star LED Board - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Wireless PresenterDinoFire StoreB01410YNAMacheté sur Amazon
AC297150250126960025AA1159530 Lames de Triple

Références

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  1. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  2. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  3. Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing. Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).
  4. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  5. Castaneda, A. N., et al. Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot). PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).
  6. Fischer, F. P., et al. Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview. Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).
  7. Aragon, M. J., et al. Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle. Elife. 11, e69094(2022).
  8. Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).
  9. Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. 11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle. Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  11. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  14. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).
  15. Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit. Elife. 11, e79887(2022).
  16. Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila. Elife. 6, e23386(2017).
  17. Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).
  18. Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults. Insects. 13 (8), 662(2022).
  19. Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).
  20. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).
  21. Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system. Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).
  22. Ratnayake, K., et al. Blue light excited retinal intercepts cellular signaling. Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).
  23. Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. Responses of different drosophila species to temperature changes. J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).
  24. Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae. PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).
  25. Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities. J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).
  26. Joseph, R. M., Heberlein, U. Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila. Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).
  27. Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. Optogenetics in drosophila neuroscience. Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).
  28. Dorkenwald, S., et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).
  29. Schlegel, P., et al. Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila. Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).
  30. Talay, M., et al. Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango. Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).
  31. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (per) assay in drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
  32. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila. Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).
  33. Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics. J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).

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Activation de CsChrimsonInhibition par GtACR2Essai de pr f rence positionnelleR ponse d extension de la proboscisEssai du labyrinthe pour drosophilesTraitement sensoriel

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